人肥胖基因在毕赤酵母中的表达

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1、华中农业大学硕士学位论文人肥胖基因在毕赤酵母中的表达姓名：聂芬申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：龙良启20060601人肥胖基冈在毕赤酵母中的表达摘要肥胖基因编码的蛋白质(1eptin)是反映体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子，leptin能显著降低脂肪组织数量、促进青春期发育，对机体的免疫应答、繁殖功能、神经内分泌等功能具有重要的作用。本文根据己报道的人肥胖基因cDNA序列设计引物，PCR扩增出人肥胖基因的cDNA编码序列，然后将此定向克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的a因子信号肽编码序列37端，构建成重组酵母表达载体，测序分

2、析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸组成的多肽。用化学方法转化毕赤酵母GSll5，经PCR鉴定证实，目的基因整合到重组酵母菌染色体中，对重组酵母进行G418筛选和4天的诱导表达，然后对阳性克隆进行了为期4天的诱导表达，SDS．PAGE未检测到目的产物的表达。根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子偏爱性，对肥胖基因进行了简并改造和人工合成，然后将改造过的人肥胖基因以正确的读码框架插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K的a因子信号肽编码序列37端，构建成重组酵母表达载体，测序结果与预期一致。重组酵母用同样方法进行了为期4天的诱导表达，

3、并通过SDS—PAGE和放免检测，得到一株表达目的蛋白量最高的重组酵母菌，该重组蛋白表达水平可达7．71mg／L，不同浓度G418筛选表明该酵母菌是高拷贝的。SDS．PAGE检测表明分泌蛋白分子量约为16kD。关键词：肥胖基因；瘦素；毕赤酵母；克隆；表达华中农业人学2006届硕上学位论义AbstractTheexpressionproductofobgene—leptinisanimportantsignalreflectingbodyfatmassandcontrollingweight，itCanremarkablycutdowntheamou

4、ntsoffatmass、stimulatethedevelopmentoftheadolescenceandalsoplaysanimportantroleintheimmunefunction，reproduction，neuroendocrinesecretion．SpecificprimersweredesignedtoamplifythecDNAfragmentencodinghumanleptin，then，thecDNAfragmentWasinsertedintothe3-endofCt—factorofyeastexpressio

5、nvectorpPIC9K．DNASequenceanalysisrevealedthatitconsistedof438nucleotidesthatencodeda146-aminopeptide．TherecombinantplasmidpPIC9K-obwastransformedintothegenomeofGS15bychemicalmethod．Thepositivetransformantswereinducedbymethan01．TheresultofSDS-PAGEdemonstratedthatthegenenearlyco

6、uldn’tbeexpressed．Togetahigherexpressionofhumanleptin，thehumanobgeneWasmodifiedandsynthesizedbymanualinthebasisofcodonbias，therecombinantplasmidwasconstructedandtransformedintothegenomeofGS15．ThemutipleinserttransformantswerescreenedbyG418andinducedbymethan01．After4daysofmetha

7、nolinduction，humanleptinwassecretedintothemedium．TheconcentrationofleptinexpressionsupematantWasabout7．71mg／LbyIRA．TheresultofSDS—PAGEdemonstratedthattheweightofthesecretedproteinWasapproximately16kD．Keywords：Obesegene；Leptin；Ppastoris；Cloning；ExpressionU人肥胖基因在毕赤酵母中的表达缩写AmpBMM

8、YBMGYbp(s)BisddH20dNTPDTrEBEDTAghkbkDaLBmgmlnmLMMMDoboD0nPAGE