h1n1亚型流感病毒vero细胞冷适应株的选育及甲型流感病毒vero细胞适应株的elisa检测

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1、硕士学位论文学校代码：10023学号：$2010018019H1N1亚型流感病毒Vero细胞冷适应株的选育及甲型流感病毒Vero细胞适应株的ELISA检测DevelopmentofaCold-adaptedH1N1InfluenzaVirusStrainonVeroCellsandDetectionofaVeroCell—adaptedInfluenzaAVirusStrainbyELISAMethod所院：北京协和医学院医学生物学研究所姓名：卢勇指导教师：李卫东研究员导师小组：姜述德廖国阳孙明波学科专业：病原生物学研究方向：病毒疫苗完成日期：2013年5月目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1ABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2第一部分H1N1亚型流感病毒Vero细胞冷适应株的选育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4月U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．7二、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9三、结果和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16四、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25五、小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30第二部分甲型流感病毒Vero细胞适应株的ELISA法检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33二、实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34三、结果和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36四、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39五、小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．64个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～65独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．66中国医学科学院北京协和医学院硕士论文摘要流感病毒减毒活疫苗采用滴鼻途径

5、免疫，能激发机体的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，具有减免注射疼痛，免疫保护作用持久，有一定的交叉保护作用等优点。目前上市的流感病毒减毒活疫苗是以鸡胚为培养基质生产的。然而，使用鸡胚生产流感疫苗还存在着许多不足：遗传性状稳定性差，降低了保护效果；交叉保护作用差；容易被其他致病因子所污染；纯化工艺复杂；难以大规模生产等。Vero细胞是WHO推荐用于疫苗生产的细胞基质，用其培养的流感病毒遗传稳定性好，质量更高，还可实现规模化生产以满足流感大流行的需要。流感病毒Vero细胞冷适应株是用流感病毒Vero细胞适应株通过在低温下连续传代培养选育而出。本实验通过温度梯度降温法成功选育出了一株能在25

6、℃生长的H1N1亚型流感病毒冷适应株，血凝效价维持在1：512以上。对该毒株在低温培养时的PH值、TPCK胰酶的添加、BSA终浓度等条件进行了优化，并确定了病毒的适宜收获时间。通过免疫荧光、血凝抑制试验以及感染性滴度测定对该毒株的生物学性状进行了鉴定。实验结果表明该毒株与H1N1亚型Vero细胞适应株为同一亚型。通过对该毒株在25℃、33℃、39℃的TCID50m11的比较，确定该毒株具有ts表型和ca表型。通过RT．PCR扩增出该株流感病毒的8个基因片段，并将NA、NS、NP、M四个基因成功连接到双向转录载体PHW2000上，并进行基因测序分析。通过与对应母本株基因的比对，确定了突

7、变位点，为流感病毒冷适应的相关基因研究奠定了基础。为了便于Vero细胞冷适应株的选育，通过测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度，建立了双抗体夹心ELISA检测甲型流感病毒Vero细胞适应株病毒的方法。对已知的阳性样品，双抗体夹心ELISA法测定的病毒滴度比血凝方法测定病毒滴度灵敏度高噜该方法操作简单、敏感性高，可应用于流感病毒的检测。关键词：Vero细胞，流感病毒，冷适应，ELISAABSTRACTAdministeredIntranasally,