c-maf泛素化及其泛素连接酶的研究

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3、变体，结合各突变体对蛋白酶体抑制剂硼替佐咪的不同反应，筛选关键突变位点，确定各赖氨酸位点对c—Maf泛素化的影响。方法：1．通过定点突变PCR技术将c—Maf蛋白质的赖氨酸突变为精氨酸(K--)R)，得到c—Maf单一赖氨酸突变位点(例如K29R)和M14(全突变体)以及多突变体；同时构建c．Maf含单一赖氨酸的突变体(例如K29)，然后将各突变体分别转染到HEK293T细胞中，36hrs后加入蛋白酶体抑制剂硼替佐咪(BZ)，进一步处理12hrs，然后用Westernblotting方法检测各突变体对c—Mar稳定性的影响，并进‘步筛选出可以

4、介导c．Maf泛素化的关键赖氨酸位点。2．将筛选的关键突变体及野生型和全突变体转染到HEK293T细胞中，6hrs后加入蛋白酶体抑制剂MGl32处理4hrs，用免疫沉淀法检测各突变体对c—Maf泛素化水平的影响。3．将关键突变体及野生型和全突变体构建到pEGFP—C3中，36hrs后乙醇固定并用DAPI染核，用激光共聚焦检测c—Maf的胞内分布。4．将关键突变体及野生型和全突变体同CCND2一Luc共转染到HEK293T细胞中，36hrs后检测其对荧光素酶活性的影响。结果：1．c．Maf单点突变无法抑制c．Maf的泛素化降解，同时单一赖氨酸的

5、存在也不能单独介导c．Maf的泛素化降解。多个赖氨酸的存在，例如同时保留第85位和350位赖氨酸位点K(85，350)可以介导c—Maf的泛素化降解。2．IP结果显示K(85，350)的c—Maf突变体有明显的多聚泛素化条带，但这两个位点同时突变的多位点突变体也存在多聚泛素化条带，证明这两个位点参与c．Maf中文摘要c-Maf的泛素化及其泛素连接酶的研究泛素化，但也不是唯一的。3．共聚焦结果显示K(85，350)(同时保留85位与350位赖氨酸)、K(85，350)R(同时突变85位与350位赖氨酸)突变体同野生型c—Maf一样主要分布在核内

6、，而完全突变体在核内和胞质中均有分布，提示c—Maf部分赖氨酸位点突变不影响其胞内定位，而完全突变可能由于泛素化修饰的改变导致其细胞内分布的变化。4．荧光素酶活性结果显示，K(85，350)、K(85，350)R多位点突变体以及全突变体相比野生型c．Maf能明显增强CCND2启动子的转录活性，这可能与c—Maf蛋白的降解受到抑制有关。c—Maf的泛素化是由多个赖氨酸位点介导的，例如c．Maf蛋白中K85和K350对于其泛素化很重要，但它们并不是唯一的。K(85，350)和K(85，350)R多突变体不影响蛋白在细胞中的定位，但由于其降解受到一

7、定程度的抑制，可明显增强其对CCND2的转录活性。第二部分c．Maf的溶酶体降解途径目的：全突变c．Maf(M14)突变体的泛素化降解被抑制，但在实验中仍发现其发生降解，由于蛋白质主要存蛋白酶体和溶酶体两种降解途径，我们推测c．Maf可能也通过溶酶体降解。本部分将利用不同的溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂抑制蛋白质降解，以证明c．Maf在泛素化降解的同时也存在着溶酶体降解。方法：1．转染wT与M14c—Maf质粒到HEK293T细胞中，用放线菌酮(CHX。100ng／mL)处理细胞不同时间(0、4、8、12hrs)后，收取细胞进行WestemBl

8、otting分析，检测蛋白的变化情况。2．转染WT与M14c．Maf质粒到HEK293T细胞中，加入放线菌酮(CHX100ng／mL)抑制蛋白合成，同时加入蛋白酶体