蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质的研究

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1、⑧研究生学位论文蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质的研究研究生姓名王蒸指导教师姓名池蘧鳃救援申请学位撮攒蕊±专业名称盎生生纽堂论文答辩日搬鲤生蔓昱鳇丑学位授予日期巡篓且中国海洋大学蛋白酶高产海洋酵母的筛选、发酵条件优化及酶性质研究摘要本研究从自然界中分离筛选出一株高产蛋白酶的海洋酵母HN311，经鉴定属于类酵母属短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。对HN311发酵产酶条件进行研究确定其最适产酶培养基组分为(％，wlv)：可溶性淀粉2．5，NaN032．0，起始pH6．0；最适产酶培养条件是：25

2、0mL锥形瓶培养基装量为50mL，10．0％(v／v)的接种量，24℃条件下搅拌转速为150rpm，通气量为8，培养24h。在最适产酶条件下，培养24h时菌株HN31l发酵液中蛋白酶比活力可达到623．1U／mL。该蛋白酶是一种胞外酶，SephadexG一100凝胶过滤、CM—SepharoseFastFlow阳离子交换层析对菌株HN311发酵液中的蛋白酶进行了分离提纯，获得了SDS—PAGE呈单条带的蛋白酶，分子量为33kD，Km和Vmax分别为0654mg／mL、25．64Pmol／min／mL。对该纯酶进行部分酶学性质的

3、研究表明该蛋白酶的最适作用温度和最适反应pH分别为45℃和10，酶比活力酶在pH偏中性环境中相对稳定，当pH低于6或者pH高于10时，酶的比活力基本等于零。温度对蛋白酶比活力的影响较为明显，并且随着时间的延长，温度对蛋白酶的影响更为明显，50。C以上保温30min后酶比活力基本完全丧失。金属离子Mn”对酶比活力有明显地促进作用，O．OlmmoL／L的Mn”能够使蛋白酶比活力提高至对照组酶比活力的近两倍，10mmol／l的Mn2+可以使蛋白酶的比活力提高到原来的114倍。Mg”、ca2+、和Na+对蛋白酶比活力的影响都不太明显，

4、O．01mmol／1的Fe”、Fe”、Zn2+和Cu2+对蛋白酶比活力的影响不大，但是10mmol／I的Fe3+、Fe”、zn2+4和Cu2+对酶比活力具有明显的抑制作用，尤其是Hg”在浓度为n01mmoL／L或者是10mmol／l时即可使酶基本完全失活。PMSF、SDS对蛋白酶比活力具有明显的抑制作用，可使酶基本完全失活，由此可以看出，此蛋白酶是丝氨酸型蛋白酶。关键词：海洋酵母碱性蛋白酶发酵最适培养条件纯化AbstractAstrainHN3l1withhighproteaseactivitywasisolatedfroms

5、edimentsofsalternnearQingdao，China．ItWaSidentifiedbelongtotheAureobasidiumpullulans．TheoptimalcompositionsofthemediumforHN311strainwerestudiedasfollows(％，w／v)：solublestarch2．5，NaN031．0，theinitialpH6．0．TheoptimalproducingproteaseconditionsforHN311wereillustratedbelow

6、：amountofinoculationl0％(v／v)，incubatingtemperature24。C，shakingcultivation150rpmandaeration8L／min．Theproteaseactivityoffermentedbrothcouldreach623．1U／mLwhenHN31wasincubatedundertheoptimalcultivitionconditions．Theproteaseofthestrainwaspurifiedbygelfiltration(SephadexG

7、一100colum)andion—exchangechromatography(CM—SepharoseFastFlowcolum)，SDS—PAGEshowedasinglebandforthepurifiedproteaseandthemolecularweightwasestimatedtobe33kD，Km=0654mg／mLandVmax=2564¨nol／min／mL。TheoptimaltemperatureandpHforhydrolysisoftheproteasewere45。Cand10，respecti

8、vely．ThechangesofpHandtemperaturehadthesignificantinfluencesontheproteaseactivity．Mn2+ionenhancedtheenzymeactivitysignificantly．10mmol／lor