重组腺病毒ad35-anti-pd-1表达的pd-1抗体增强ctl抗肿瘤功能的研究

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1、尚弘理≯大学硕士学位论文重组腺病毒Ad35．anti．PD一1表达的PD．1抗体增强CTL抗肿瘤功能的研究作者姓名陶雷学科(专业)生物化学与分子生物学指导老师钱其军教授所在学院生命科学学院提交日期2014年3月中国杭州ZHE]IANGSCI-TECHUNIVERSI。rYMASITERDISSERTATIONStudyofCTL’SenhancedantitumoreffectinducedbyPD-1antibodyexpressedfromreconbinantadenovirusAd35--anti--PD-·1

2、Dr．QijunQianProfessorCollegeofLifeSciences，ZhejiangSci—TechUniversityMar．2014HANGZHOU，CHINA分类号：UDC：密级：论文答辩日期2014年3月10日辩委员会主席金洁论文评阅人苏长青鄢和新金华君答辩委员会员钱文斌金华君解纯刚张世馥浙江理工大学硕士学位论文浙江理工大学学位论文独创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不

3、包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：沁碑年弓月阁雷浙江理工大学硕士学位论文学位论文版权使用授权书UlIIIIIIlUllllllll(IIIIllllllMIIlllY2551276本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描

4、等复制手段保存、汇编学位论文。‘本学位论文属于保密口在——年解密后使用本版权书。不保密迥／／学位论文作者签名：陶雷日期：雌弓月，上日茹瓣誓日期：如哗年孑月，孓日浙江理工大学硕士学位论文重组腺病毒Ad35-anti-PD一1表达的PD-1抗体增强C11-抗肿瘤功能的研究重组腺病毒Ad35一anti—PD．1表达的PD．1抗体增强CTL抗肿瘤功能的研究中文摘要细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)是一类自身主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilit)，complex，

5、MHC)限制性的抗原特异性的T细胞。因其具有有效靶向杀伤肿瘤细胞的特点，在肿瘤的个体化治疗中占有重要地位。免疫学家希望通过基础研究的突破来提高CTL过继细胞治疗(adoptivecelltherapy，ACT)的临床疗效。幸运的是，随着人们对肿瘤免疫抑制机制研究的不断深入，尤其是免疫检查点(checkpoint)PD．1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的发现，为提高CTL的疗效提供了新思路。PD．1和CTLA4为T细胞活化

6、的负调控蛋白，它们抑制了T细胞活性，降低了T细胞抗肿瘤功能。本课题主要研究了PD．1信号阻断对CTL抗肿瘤功能的影响。首先我们构建了携带PD．1抗体基因的5／35型重组腺病毒载体Ad35．anti．PD．1。然后我们将经PCR鉴定正确的4个病毒克隆感染293细胞，在不同时间点收集细胞上清，通过ELISA实验检测发现3号Ad35．anti．PD．1病毒克隆在72小时PD．1抗体的表达量最高，约600ng／mL。同时Westembotting证实了表达的PD-1抗体包含正确的重链(约50kD)和轻链(约25kD)。我们选取

7、3号Ad35．anti．PD．1病毒克隆大量表达PD．1抗体，在72h收集细胞上清，用ProteinG亲和层析方法纯化PD．1抗体。考马斯亮蓝染色证实了纯化出的PD．1抗体拥有较高纯度。ELISA实验表明从100mL细胞上清中纯化出的抗体质量约在45烬。经浓缩后，浓度为40gg／mL。最后，我们从人的外周血单个核细胞中分离和培养了DC和T细胞。用重组腺病毒Ad35．TP53感染DC，再用该DC去致敏初始T细胞，获得了TP53特异性的CTL。在CTL杀伤肿瘤细胞的体外实验中，我们设置了加PD．1抗体的实验组和不加PD．1

8、抗体的浙江理工大学硕士学位论文重组腺病毒Ad35一anti-PD一1表达的PD-1抗体增强口1．抗肿瘤功能的研究对照组。采用CCK8试剂盒做出的杀伤数据显示实验组的杀伤效率均高于对照组10个百分点。目前本课题己完成了从Ad35．anti．PD．1重组腺病毒的构建到体外杀伤的部分实验，证明了PD．1抗体体外增强CTL抗肿瘤功能。接下