比格犬注射重组腺病毒adhgf后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测

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　　比格犬注射重组腺病毒AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测哈小琴,赵治华,吕同德,劳妙芬,吴丹莉,吴祖泽【摘要】目的：观察Beagle犬重复给予AdHGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子（hepatocytegroo龄，体质量6~7.5kg，雌雄各半（军事医学科学院动物实验中心）.AdHGF(携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒)，AdGFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和293细胞（以腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系）均由军事医学科学院二所三室提供.鼠抗人HGFmAb（RD），辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc),重组人HGF蛋白纯品（RD）,DMEM(Gibco),小牛血清（天津血研所）,猴抗血清（军事医学科学院五所昭衍新药研究中心），洁净工作台（北京半导体设备一厂），CO2培养箱（Sanyo）,IX70倒置荧光显微镜（Olympus）,PM30自动照相系统（Olympus）.　　1.2方法　　1.2.1动物分组设正常对照组、手术对照组、AdHGF小剂量组(2.4×107pfu/kg,拟临床用量3.4倍)和大剂量组(2.4×108pfu/kg,拟临床用量34倍)，每组6只. 　　1.2.2给药途径采用心肌注射和臀部肌肉注射相结合,首次心肌注射，其余13次为肌肉注射给药.给药期限为7o.　　1.2.3犬血清中抗腺病毒抗体测定利用病毒中和反应方法，即病毒与抗血清中和后，将其感染细胞，细胞不产生病变为抗腺病毒抗体阳性，反之细胞出现病变为抗腺病毒抗体阴性，并观察绿色荧光是否出现.将293细胞接种于96孔细胞培养板上，5×104个/孔.次日感染病毒（AdGFP）与血清的混合液:取20μL犬血清加8u的青霉素，再加5×106pfu病毒,相当于100MOI(multiplicityofinfection,感染强度)，混匀后37℃水浴30min.吸弃原培养液，加入上述混合液，每个样品双份，每孔加入200μL，以小牛血清加病毒液作阴性对照,猴抗血清为阳性对照，置37℃，50mL/LCO2的培养箱继续孵育.24，36，48h观察荧光及CPE(细胞病变效应).　　1.2.4犬血清中中和抗体测定用ELISA方法测定血清中抗HGF抗体水平.收集稳定分泌表达HGF的CHO细胞的培养上清作为抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，新鲜配制的OPD为底物显色液，测A490nm值.同时用抗HGFmAb作一标准曲线，以计算抗体的滴度.　　2结果 　　2.1血清抗腺病毒抗体检测共12次采血，受试动物212只次，手术对照组及正常对照动物血清均出现明显CPE及强荧光(图1).给药前及给药2次后24h的血清也出现明显的阳性结果.给药4次后大剂量组5只动物血清均对腺病毒有中和作用(图2A)，小剂量组3只动物也已检测到抗体.给药6次后，动物全部检测到高滴度抗体(图2B).停药后4wk，抗体水平下降，直至停药12wk，大剂量和小剂量组动物抗体水平基本都已下降为“±”，分别出现明显CPE及荧光.同时观察到动物性别及给药剂量大小无差异.　　A:293细胞表达强绿色荧光蛋白；B:与(A)同视野293细胞出现明显CPE.　　图1荧光显微镜观察示强荧光和明显CPE×100（略）　　A:少量293细胞表达绿色荧光蛋白；B:极少量293细胞表达绿色荧光蛋白.　　图2荧光显微镜观察示弱荧光×100（略）　　2.2血清中抗HGF抗体的检测结果各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体，表明局部注射重组腺病毒AdHGF后，犬血清中可能不产生抗HGF抗体.　　3讨论 　　腺病毒载体是继逆转录病毒载体之后在基因治疗中广为应用的一种基因转移载体，可感染种类相当广泛的有丝分裂后细胞，甚至包括来自高度分化的组织中的细胞，例如骨骼肌细胞、肺细胞、脑细胞和心肌细胞.该病毒有以下优点〔3-6〕：①对人类安全，无致畸、致病及致癌性；②对分裂细胞及癌细胞株的转染效率达到90%～100%；③腺病毒感染细胞时DNA不整合到宿主细胞染色体中；④腺病毒容易制备、纯化和浓缩，可达到较高滴度；⑤腺病毒载体插入外原基因的容量较大，所以目前国外多用复制缺陷的腺病毒为载体介导p53基因转移.p53基因治疗的研究虽然取得了一定的成绩，也存在不少问题.最突出的问题为抗体的产生,病毒载体均可引起抗体产生.腺病毒能引发强烈的免疫反应，在第一次感染后两etovDM,GaggarA,NiS,etal.Adenovirusbindingtobloodfactorsresultsinlivercellinfectionandhepatotoxicity〔J〕.JVirol,2005,79(12):7478-7491.　　〔4〕PandoriM,HobsonD,SanoT.Adenovirusmicrobeadconjugatespossessenhancedinfectivity:aneE.Rebinantadenovirusvectorsforgenetherapyandclinicaltrials〔J〕.ActaMicrobiolImmunolHung,2001,48(34):323-348. 　　〔6〕AdamE,NaszI.Adenovirusvectorsandtheirclinicalapplicationingenetherapy〔J〕.OrvHetil,2001,142(38):2061-2070.　　〔7〕ZabnerJ,PetersenDM,PugaAP,etal.SafetyandefficacyofrepetitiveadenovirusmediatedtransferofCFTRcDNAtoairatesandcottonrats〔J〕.NatGe,1994,6:75-83.