奥奈达希瓦氏菌气液界面生物膜生长及其机制的研究

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1、中南大学博士学位论文摘要奥奈达希瓦氏菌(Shewanellaonedensis：&onedensis)具有代谢方式的多样性和灵活性，是生物修复与生物进化领域研究的模式菌株。因为希瓦氏菌对不溶性金属的还原性，以及在生物燃料电池等方面潜在的应用前景，使得希瓦氏菌生物膜的研究成为近年来该领域研究的热点。已报道的文献对该菌在固体表面形成生物膜的研究较多，但在气液界面形成生物膜的研究未见报道。本论文首次构建了Shewanel]aonedensisMR-I静置培养条件下形成气液界面生物膜的生长体系，结合微生物

2、生理学、生物化学与分子生物学的研究方法对气液界面生物膜形成的条件、必需因素和分子机制进行了较系统的研究。主要取得了以下结论和认识：(1)构建MR一1气液界面生物膜生长的培养体系，探讨该生物膜生长的动力学和生长特征。研究了静置培养生长时气液界面生物膜的生长动力学和培养体系的氧气条件等生长特征。实验表明气液界面生物膜仅在好氧条件下形成，且形成生物膜时浮游细胞的临界浓度(OD。∞)为0．23，浮游细胞浓度(OD枷)超过0．23后，细胞开始粘附到气一固一液界面，然后扩展到气一液交界面成膜。在厌氧静置培养时

3、，即使浮游细胞密度(0D枷)达到0．4，液体表面也没有观察到生物膜的形成，说明氧气条件和一定浓度的浮游细胞是气液界面生物膜形成的重要条件。(2)研究胞外基质的主要成分，观察生物膜的微观形貌特点。胞外基质是生物膜的重要组成部分，一般包括蛋白质、纤维素和DNA等组分。本文实验发现，大于100I上g／mL的蛋白酶K不仅能阻止生物膜的形成，而且可以破坏生长成熟的生物膜。而DNaseI(0-1000U／mL)和纤维素酶(0-100U／mL)对生物膜的形成没有影响，也不能破坏成熟的生物膜。说明而纤维素和DNA

4、不是生物膜基质中的主要成分，蛋白质对生物膜形成与稳定有重要作用。所以，论文对蛋白分泌系统及其分泌的蛋白进行了进一步的研究。SEM分中南大学博士学位论文摘要析显示成熟的MR-1气液界面生物膜是由多层密集细胞组成，膜上细胞从顶端产生直径约10nm，几到几十微米长的纳米线。(3)应用MR-1全基因组cDNA芯片，揭示同一培养体系中气液界面生物膜与浮游细胞表达的各种差异。为了研究气液界面生物膜与浮游细胞的差异和生物膜形成的机理，文章利用MR一1全基因组cDNA芯片研究了同一培养系统中气液界面生物膜与浮游细

5、胞表达的差异。芯片分析结果表明：1)浮游细胞与气液界面生物膜细胞表达差异的基因涉及MR一1生理代谢的各个方面，占总编码序列的19．O％；2)在生物膜细胞中，所有三羧酸循环基因和ATP合成酶基因都上调，13个编码NADH脱氢酶的基因有12个上调；与厌氧呼吸有关的基因在浮游细胞中表达上调；说明气液界面生物膜细胞是以有氧呼吸为主，浮游细胞以厌氧呼吸为主；(3)蛋白运输基因在两种细胞中表达差异显著，特别是铁与血红素吸收与运输的基因在生物膜中一致上调，采用q—RT—PCR验证了芯片杂交实验的可靠性，说明铁在

6、生物膜的形成过程中有某种程度的作用。(4)系统研究了EDTA和Fe、Ca、Mn、Cu、Zn、Mg等金属离子分别对MR-1气液界面生物膜形成的影响首先，构建了dhmuT和dhugA两株铁运输基因突变株，发现突变株与野生株形成气液界面生物膜的能力一样；说明铁对MR一1生物膜形成贡献较小，cDNA芯片识别的铁运输基因不是与生物膜的形成功能特异性相关，它们的表达差异是对气液界面生物膜生成环境的适应性响应。其次，研究了EDTA和其它金属离子对气液界面生物膜形成的作用。实验发现：0．3mMEDTA完全抑制了生

7、物膜的生成：大于0．3IIlMCa(II)、Mn(II)、Cu(II)和Zn(II)能完全消除EDTA对生物膜形成的抑制；而Mg(II)加入含EDTA的培养液不能恢复生物膜的形成；说明前四种金属离子在生物膜形成中有重要的促进作用。0．3mMFe(II)或Fe(III)加入含EDTA的培养液，MR一1生物膜形成量仅为没有EDTA处理的42．5％和40．8％，进一步验证了铁对MR-1生物膜形成贡献较小。中南大学博士学位论文摘要(5)探讨与生物膜形成相关的蛋白及其分泌通道首先，采用RT-PCR对MR-1

8、基因组中依次排列的rtxB、emrA、aggA和ompA基因转录关系进行分析，结果表明它们同属于rtxB操纵子。利用生物信息学的方法对rtxB操纵子的可能启动子序列进行了预测和分析。其次采用基因同源重组方法构建了I型蛋白分泌系统三个基因的突变株4r坦AolurA和1AaggA，分泌系统上游基因突变株Artx，下游基因突变株AompA。实验表明：Artx，ArtxB,AemrA和AaggA四株突变株都丧失了在气液界面形成生物膜的能力，它们在固体表面生成生物膜的速率比野生株慢，说明I型