喉癌microrna差异表达谱的筛选及mir-125a抑制喉癌细胞增殖的研究

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南方医科大学2010级硕士学位论文喉癌microRNA差异表达谱的筛选及miR-125a抑制喉癌细胞增殖的研究DifferentialmicroRNAexpressionproffiinginlaryngealcancerandstudyofmiR-125aontheproliferationoflaryngealcancercellline课题来源：2011年广东省科技计划项目(No：20118031800148)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院卢仲明张思毅耳鼻咽喉科学专业学位硕士广东省人民医院2013年5月8日广州 硕士学位论文喉癌microRNA差异表达谱的筛选及miR．125a抑制喉癌细胞增殖的研究硕士研究生：卢仲明指导教师：张思毅摘要背景与目的喉癌是最常见的头颈肿瘤之一，在呼吸道肿瘤中发病率居第二位，以鳞状细胞癌为主，约占95％。随着工业化的发展和空气污染的加重，有调查表明，喉癌的发病率不断升高，每年约增力n25％，常见于中老年男性。2008年世界上男性喉癌发病率估计为5．1／100，000，男性病人死亡率约为2．2／100，000。根据最新的研究，虽然近30年来新的外科手术方法、化疗药物及更先进的放射治疗手段己应用在喉癌的治疗中，喉癌患者的总生存率不但并未得到提高，甚至有下降的趋势，仅约50％，晚期喉癌的生存率更低达30--40％。流行病学调查已确认喉癌的病因包括吸烟、酗酒、空气污染、职业因素等。随着分子生物学的迅猛发展，喉癌的发生发展己被证实是多基因、多步骤渐进发展的结果。寻找新的分子诊断标记物和治疗靶点，实现肿瘤的个体化治疗已成为当前肿瘤研究的重要方向之一。然而喉癌的分子发病机制目前仍未明确，目前还难以从分子水平干预喉癌的发病并提高其生存率。微d、RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类长度大约19～25nt的进化保守、小分子单链非编码RNA。miRNAs通过不完全或完全结合到靶基因mRNA的37非翻译N(3’untranslatedregion，37UTR)，从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译，实现对靶基因表达水平的转录后调控，从而参与调控个体发育、细胞代谢、增殖、分 摘要化和凋亡等多种生物学过程。尽管miRNAs只占整个基因组基因总数的2％左右，但是其调控的基因却至少占基因组的30％，每个miRNA可以控制数百个基因的表达，在基因组的调控网络中发挥着至关重要的作用。近年越来越多的研究显示，miRNAs可能作为癌基因或抑癌基因在多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和血管生成的基因调控中扮演了重要角色。50％以上的miRNAs定位于已经被证明与肿瘤相关的染色体区域，包括等位基因的杂合性丢失区、基因组断裂点和脆性位点等。有研究表明，miRNAs可能在喉癌等头颈肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用，提示miRNA可能作为喉癌的生物标记物或治疗靶标在喉癌的早期诊断、治疗、预后等方面具有潜在的临床价值。寻找新的诊断标记物和治疗靶点是改善喉癌疗效的关键，miRNAs研究为探索喉癌的发生发展机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点提供了广阔的前景。然而，迄今为止喉癌的miRNA差异表达谱仍未明确。现有的研究多为包括了口腔、咽、喉等多个部位的头颈癌的差异表达谱，单独喉癌的miRNAs差异表达谱研究非常少，而且不同研究问结果很不一致。为了避免把所有头颈癌一起进行研究所可能带来的偏倚，有必要单独针对喉癌进行miRNAs差异表达谱的研究。在肿瘤中表达增高的miRNAs，可能具有癌基因的促进肿瘤细胞增殖、侵袭转移等功能；在肿瘤中表达下调的miRNAs，则可被认为具有抑癌基因的功能。差异表达自,FJmiRNAs的生物学功能一般必须通过体内、体外实验才能获得证实。目前仅有少数miRNAs的功能得到了较深入的研究，miRNA在喉癌中的生物学功能研究则更罕见，亟待进一步研究。本研究采用涵盖了目前最新的miRbase数据库中全部人类microRNA的第6代miRCURYTMLNA微阵列芯片，对喉癌中差异表达miRNAs进行筛选，通过实时定量PCR对其进行验证，并研究了miR一125a(即111iRNA一125a，又称miR一125a．5p)对喉癌Hep2细胞增殖的影响。旨在为进一步研究miRNA与喉癌发生、发展的关系提供线索，为寻找喉癌早期肿瘤分子标志物及后续的喉癌基因治疗提供更有效 硕士学位论文的靶点，以便最终提高喉癌的早期诊断率并改善治疗效果。第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的mi]刚rAs研究目的通过miRNA微阵列基因芯片技术研究喉癌组织与周围正常喉黏膜之间差异表达的miRNAs，建立喉癌miRNA差异表达谱。方法从2010年开始收集在广东省人民医院耳鼻喉科进行喉癌手术的病人的组织和血标本，建立了喉癌标本库。我们还建立并完善了标本的采集、处理、保存的标准化流程，并通过电脑软件进行全面、准确的信息化管理。在广东省人民医院喉癌标本库中随机选取了手术切除的喉癌组织及癌旁正常组织共10对采用最新的miRCURYTMLNA微阵列基因芯片(Exiqon)进行分析：抽提总RNA，质量鉴定合格后，对RNA进行荧光标记，芯片杂交，清洗扫描及信号数字化处理，扫描得到的图像输入GenePixPro6．0(Axon)软件进行坐标调整和数据提取。显著差异表达的miRNAs通过火山图(VolcanoPlot)过滤后确认。使用MEV软件(v4．6，TIGR)进行聚类分析。进一步采用芯片显著性分析软件(Significanceanalysisofmicroarrays,．SAM，http：／／www-stat．stanford,．edw'～tibs／sarn／)对芯片数据进行分析，设定错误发现率(falsediscoveryrate，,FDR)为0．05。结果总RNA质量鉴定结果：表明所有样品总RNA的质量可靠，没有降解或DNA、蛋白质污染，可入选进行下一步基因芯片等后续实验。通过miRNA微阵列基因芯片初步筛选，结果经过SAM软件分析处理，获得喉癌组织和癌旁正常组织之间显著差异表达的microRNAs：相对正常喉黏膜，在喉癌组织中共有11个miRNAs表达显著上调；l14个miRNAs表达显著下调。下调的miRNAs占大多数。 摘要结论1、喉癌与正常喉黏膜之间存在明显差异表达的miRNAs，这些差异性表达的miRNAs可能在喉癌的发生发展中发挥重要作用，可能成为新的喉癌分子标记物。2、喉癌规范化标本库的建立和信息化管理对于喉癌基础研究非常重要，有助于保护珍贵医学资源和提供高质量喉癌标本。第二章应用实时荧光定量PCR技术验证喉癌组织中差异表达的miRNAs研究目的通过实时荧光定量PCR(qRT．PCR)技术进一步验证基因芯片实验中获得喉癌组织中的差异表达的miRNAs。方法在广东省人民医院耳鼻喉科喉癌标本库中随机选取喉癌组织和癌旁正常喉黏膜配对标本32对标本进行茎环法qRT—PCR实验，以U6为内参，检测let一7f-5p、miR一10a一5p、miR一125a-5p(又称miRNA-125a或miR·125a)、miR一144—3p、miR．195．5p、miR．203基因在32例喉痛病人的肿瘤及癌旁正常组织中的表达水平：提取标本的总RNA，逆转录获得cDNA，进行定量PCR扩增。对获得的Ct值采用2也“‘法对基因表达进行相对定量。结果qRT—PCR实验结果验证了喉癌组织中的let一7f-5p、miR-10a-5p、miR·125a、miR-144—3p、miR一195-5p、miR一203等的表达均显著下调，这6个miRNAs在32对喉癌与周围正常喉黏膜组织之问的表达差异均有统计学意义(P<0．05)。miRNA定量PCR溶解曲线均为单一峰，说明PCR扩增特异性好。结论基因芯片与qRT．PCR结果一致，证实了miRNA微阵列基因芯片结果是真实V 硕士学位论文可靠的。第三章miR-125a抑制喉癌Hep2细胞株增殖的研究研究目的选取在基因芯片和qRT．PCR实验中表达均显著下调的miR-125a(又称miR-125a-5p)作为研究对象。通过这一系列的体外细胞功能实验研究miR一125a对喉癌Hep2细胞增殖的影响，以更好地了解在喉癌中miR-125a的生物学功能。方法合成miR-125a模拟物(mimic)jfl抑制物(inhibitor)，并分别转染至喉癌Hep2细胞株。实验分为三组：阴性对照组(NC)、转染miR．125a．mimic组、转染miR-125a．inhibitor。应用MTT实验、克隆形成和软琼脂集落形成实验观察miR．125a过表达或抑制对喉癌Hep2细胞增殖的影响；通过BrdU、流式细胞术等实验分析miR．125a过表达或抑制对喉癌Hep2细胞周期的影响；采用Westernblot技术检测111iR一125a对多个细胞周期调控因子的蛋白表达水平变化的影响。结果1、MTT实验结果显示：转染miR一125a-mimic组Hep2细胞与对照组相比，活细胞数量明显降低(P<0．05)，增殖能力受到显著抑制；转染miR-125a—inhibitor组Hep2细胞与对照组比较，活细胞数量明显增)JIJ(P=50的miRNAs计算标准化因子。表达数据使用中位数标准化，显著差异表达的miRNAs通过火山图(VolcanoPlot)过滤后确认。使用MEV软件(v4．6，TIGR)进行聚类分析。(四)芯片实验步骤及锁核酸(LNA)技术原理示意图RNA权曩质氍捻测RNA删L260／280nm5．}比光测试甲睦变性收电泳、≮叫．一Agilent2100Nanodrop图1—1Fig．1—1¨。一1P■-一■一■=●皇RNA灾光标i己煽芯片杂交■囝芯片实验原理、步骤示意图(Exiqon公司资料)SchematicdescriptionofmiRCURYLNAArray． 硕士学位论文{o]O‘0一P=O{LNA图1-2miRCURYTM芯片的锁核酸(LNA)技术示意图(Exiqon公司资料)Fig．1-2SchematicdescriptionofLNAtechnologyofmiRCURY7Mmicroarray(五)基因芯片数据统计学处理及分析对microRNA基因芯片实验数据通过MEV软件(v4．6，TIGR)进行聚类分析，获得二维树状热点图(dendrogramheatmap)；进一步采用芯片显著性分析软件(Significanceanalysisofmicroarrays，SAM，http：／／www—stat．stanford．edu／～tibs／sam／)进行分析，设定错误发现率(falsediscoveryrate，FDR)为0．05，筛选出喉癌组织和癌旁组织之间差异表达的microRNAs。二、结果(一)总RNA质量鉴定结果经分光光度计检测，所有样本提取的总I斟A的A260／280均在1．9～2．1之间(见表1—3)；琼脂糖凝胶电泳：28s和18s的IⅢA呈现明显、锐利的条带，而且28s带荧光强于18s，二者之比约为2：1(见图1．3)。结果表明所有样品总RNA的质量可靠，没有降解或DNA、蛋白质污染，可入选进行下一步基因芯片等后续实验。9 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs表I一3标本RNA含量及浓度Tab．1—3RNAquantificationandqualityassurance10 硕士学位论文田28s18s5s图1．3用于芯片实验的标本RNA凝胶电泳图像(左图：本研究中20个样本的电泳图像；右图：凝胶电泳示意图)Fig．1-3RNAIntegritytestbyDenaturingAgaroseGelElectrophoresis．20个样本所在位置：Lane1：TotalRNAofsample025hnLane2：TotalRNAofsample026IntLane3：TotalRNAofsample029hLane4：TotalRNAofsample036hLane5：TotalRNAofsample043IntLane6：TotalRNAofsample044IntLane7：TotalRNAofsample048IntLane8：TotalRNAofsample050IntLane9：TotalRNAofsample052nLane10：TotalRNAofsample057hnLane1l：TotalRNAofsample0251tLane12：TotalRNAofsample026RLane13：TotalRNAofsample029kLane14：TotalRNAofsample0361tLane15：TotalRNAofsample0431tLane16：TotalRNAofsample044k 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAsLane17：TotalRNAofsample0481tLane18：TotalRNAofsample0501tLane19：TotalRNAofsample0521tLane20：TotalRNAofsample0571t(二)对过滤后的miRNA数据进行质量评估l、箱图箱图对于快速直观地了解大量数据的分布非常有效，最常用于比较样本的不同分布。经过标准化后，每个样本经对数处理后的分布几乎完全一致。(见图1—4，左图：未经标准化的对数处理数据；右图：经标准化后的对数处理数据)ReforeNormaIi7甜ionAfterNormaI|zation一．J焉o．I-q；；。l眦日罟⋯|Io—}—————·—··—————————--‘--“---。-‘—-‘‘-‘+--■。。H。。¨。。¨‘‘十P。’。。‘。。。。。。1o，．Il●_一7；]㈠{“1■L一一一．二∑二1．L一一一，．：二二jIiiliii{{{§$§§§§§§§§女§§§女§女{{《§§§§§§§§§§图i-4各喉癌组织标本箱图Fig．1-4Box·plot2、相关矩阵和散点图相关矩阵方法描述了每次重复实验间的相关性(见表1．4，表1—5，表1—6)。 硕士学位论文表l一4癌旁正常组织相关系数矩阵Tab．1-4Correlationcoefficientmatrixbetweenadjacentnormaltissues029lm036Im048lm050Int057lm025Im026Int043Int044Int052lm0．923350．901630．893120．944360．883910．917590．852040．845740．851830．92335l0．93l40．859360．867990．954830．95240．939l0．894820．915790．901630．931410．854610．86780．957810．976660．9173l0．896850．922170．893120．859360．8546l10．947670．885290．884070．859230．833220．896680．944360．867990．86780．9476710．848450．888120．860120．85730．824190．883910．954830．957810．885290．8484510．983280．912730．859470．97560．917590．95240．976660．884070．888120．9832810．914540．8820．946180．852040．93910．917310．859230．860120．912730．9145410．977010．879250．845740．894820．896850．833220．85730．859470．8820．9770110．819440．851830．915790．922170．896680．824l90．97560．946180．879250．8l94413 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs表1-5喉癌组织相关系数矩阵Tab．1-5Correlationcoefficientmatrixbetweenlaryngealcancertissues029lt036lt048lt050lt0571t0251t0261t043lt044lt052lt0．949430．913050．843950．888490．877540．8843l0．8870．932980．909530．9494310．974620．902430．949380．914020．911930．923420．9650．940390．913050．9746210．919290．951590．904540．89880．886980．94080．955830．843950．902430．9192910．880150．84930．787310．845570．885520．951780．888490．949380．951590．8801510．962750．92330．881160．941060．924710．877540．914020．904540．84930．9627510．86440．86980．914840．9016l0．8843lO．911930．89880．787310．92330．864410．864840．92120．839970．8870．923420．886980．845570．881160．86980．86484l0．928020．836660．932980．9650．94080．885520．941060．914840．92120．92802l0．930810．909530．940390．955830．951780．924710．9016l0．839970．836660．93081 硕士学位论文表1-6It组与hn组的总体相关情况Tab．1-6correlationbetweenItgroupandIntgroup散点图能直观地有效评估芯片间变异情况(或重复性)。散点图的坐标轴刻度代表了样本的标准化信号值(指数级)，见图l一5。图1—5散点图Fig．1-5Scatterplot．(三)miRNA基因芯片结果1、筛选在喉鳞癌组织中差异表达的miIⅢA基因，并对其进行两组配对样本的聚类分析：本研究使用了丹麦Exiqon公先进的基于LNA(锁核酸)技术生产的microRNA芯片，其既可高灵敏度地检测出普通DNA捕获探针不能检出的微量microRNA，又能高特异性的区分单碱基差异的microRNA。尽可能地保证了结果的可靠性和准确性。通过IIll’州A-心H-．片筛选，并将结果中的非人类miRNAs以及超过一半样本均无法检测到的miRNAs去除后，比较]'780个miRNAs，发现其d7277个miRNAs表达1气 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs上调，503个miRNAs表达下调。为了确定差异表达的miRNAs，我们通过基因芯片火山图(VolcanoPlot)对实验结果进行过滤，采用的阈值为上调2倍以上，或下调超过0．5倍，p=<0．05。(见图l一6，横坐标：>l表示上调2倍以上，<．1表示下调0．5倍以上；纵坐标：>1．30103表示p<0．05，差异有统计学意义；<1．30103表示p>0．05)。图l一7为喉鳞状细胞癌miRNA热点图，对喉癌及癌旁正常组织的配对标本间差异表达的miRNAs进行分层聚类分析。图中每列分别代表不同的组织样本，每行分别代表不同的差异表达的miRNA基因。红色为表达上调，绿色为表达下调。聚类树状图在左侧显示，组织样本聚类树状图在上方显示。把样本和miRNAs按其表达水平进行聚类分析，通过这样处理使我们能找到miRNAs和各样本的相关性。随后的分层聚类是根据标准化的肿瘤组和癌旁正常组之间差异表达的miRNAs数据(己通过火山图)来进行的，其中在所有样本中前景值与背景值的强度差小于50的miRNAs被剔除。分层聚类结果显示了不同样本间可区别的miRNA表达谱。图1-6基因芯片火山图Fig．1-6Microarrayvolcanoplot． 硕士学位论文图1．7喉鳞状细胞癌热点图。配对标本间差异表达的miRNA进行分层聚类分析，红色代表高表达，绿色代表低表达。Fig．1-7HeatmapofmiRNAmicroarrayinLaryngealSquamousCellCarcinoma．HierarchicalclusteringofdifferentiallyexpressedmiRNAswasshowninpairedtumor-normalsamples．Redindicatesoverexpression；greenrepresentsdownregulation．2、SAM软件分析我们对芯片分析结果获得的780个miRNA进一步采用SAM软件分析，设定FDR为0．05，发现相对正常黏膜，在肿瘤组织中共有l1／i'。miRNA表达显著上调；114个miRNA表达显著下调(见图1—8)。图1．8中，红点代表表达显著上调的miRNAs，绿点代表表达显著下调的miRNAs。表1．7，表1．8中列出了所有显著差 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs异表达的miRNAs，FoldChange表示喉癌组织与癌旁组织相比，各miIⅢAs上调或下调的倍数；SAM软件以q—value表示统计学上差异的显著性(类似于一般统计学软件中的pvalue)。￡8可4g舅oSAMPlotsheet图1-8通过sAM软件分析获得的显著差异的mu州A基因。在喉癌中，共11个miRNAs高表达，114个miRNAs低表达。F唔1．8SignificantmiRNAgenesidentifiedusingSAMsoftware．Fromthisanalysis，therewere1geneshighlyexpressedand114geneslowlyexpressedinlaryngealcancer．18叶^¨1lJ{J日4{∞壮畔 硕士学位论文表1．7显著上调的microRNA列表(SAM，I砸R；<5％)Tab．1-7Significantlyup-regulated11microRNAs(SAM，FDR=<5％)表1．8显著下调的microRNA列表(SAM，n)R=<5％)Tab．1-8Significantlydown—regulated114microRNAs(SAM，FDR=<5％)GenelDGeneNameFoldChangeq-value(％)427084622214608914567714565130787425551458201471983102614600814716214608613485145943hsa·-miR··99a··5phsa··miR-·1228—·5phsvl．miR—H8hsa·-miR·-139··5phsa-miR--99a--3phsa··miR··125b··5phsa-miR．208bhsa．1et．7chsa-·miR-26a··5phsa··miR--101··3phsa-·miR··26b-·5phsa··let··7a-5phsa-·miR··30a··5phsa—miR一10a．5phsa—-miR·-100·-5p190．2294166180．9694l29220．8228135220．7452909l60．9434209980．00050414l0．856998652O．1633692410．412830360．Oll5478380．044496706O．1150180140．5559632l70．7304292930．3952469530O0O 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs46944110921482281794446918425924286614770946104284717935110413359614583110925429234283910928179571959l1456384267214300425431477714257l1478201482172819117752145676298021118211004hsa—miR—l297hsa··miR·-378a-5phsa-miR．3656hsa-·miR·-337--5phsa．miR．375hsa··miR·-338—-3phsa．miR．45lahsa—miR_3185hsa·-miR-·126-·3phsa-miR··497-5phsa-miR··101-5phsa-miR—-29c··3phsa-miR·-126··5phsa-miR--625-·5phsa·-miR··1Ob·-5phsa··miR--30c-5phsa-miR—l35a-5phsa-miR-I25a-5phsa—miRPlus—C1070hsa··miR-·199b—·5phsa·-miR··29a··5phsa-·miR—·323b··5phsa··miR-·29c-5phsa．．miR．．608hsa．miR-4328hsa··miR--i29-·l-3phsa．miR-3133hsa．miR．23chsa·-rrliR—·30e-5phsa--let·-7f-5phsa·-miR··30e-3phsa-miR--144--3phsa．miR-98hsa—miR一203200．6759615120．9593159130．2016418980．9496580240．5367329790．6516221733．05E．050．9857289130．0191846570．832746090．970538127O．1419442030．3329255480．8390628340．4506536810．2261683210．9301310l0．097444040．7325274190．2869496410．9110323960．7724149810．8628491610．982843666O．3136754590．9372047910．9400251460．9401218030．3593994040．6538792950．7346550270．0397328460．7280125490．001955606O0O0O0O0O0O01．416083916 硕士学位论文329461484181480001103911105145844146112178411486741106514583814775546439109854264011037429694264l464381457511461694279246567148633147997147776131481796114612411077573014768214803346440hsa-miR-486-5phsa-miR-3607-5phsa．IlliR．3195hsa-miR-29a-3phsa—miR-378a-3p／hsa-miR·378c／hsa_miR·378dhsa-miR-374a-5phsa-miR-30b-5phsa．miRPlus-C110011Sa-miR-432lhsa-miR-335—5phsa-miR-125b一1—3phsa—miR-378chsa．miR．1243hsa-miR-191-5phsa-miR一20b一5phsa-miR-299—3phsa-miR·10b-3phsa-miR-145—5phsa-let-78-5phsa-miR·23b-5pmgv—miR-M1—3phsa—miR一29b一2—5phsa．miR-3176hsa-miR·299—5phsa-miR-3934hsa．miR-43l7hsa-miR-195—5phsa-miR-629—5phsa—miR一4796-3phsa-miR-363—3phsa．miR-208ahsvl—miR-H6—5phsa-miR-3065—5phsa．mjR．12872lO．7146829110．8395204550．3678481810．0054979410．6806475480．62979l599O．195820835O．9695130610．9735507090．8322714370．950006750．7871462730．8608684730．6243576560．8107694730．9104452840．9907732720．421421711O．1136678980．9773541470．8955277920．9889237720．9344639570．5541762480．9653202930．5705195130．4345561980．9218541740．9873078390．9532614770．9521931950．9555207150．9842538290．982301821．4160839161．9780219781．9780219782．4923076922．7604673812．76046738l2．7604673812．76046738l2．76046738l2．7604673812．7604673812．7604673812．76046738l2．76046738l2．76046738l2．7604673812．76046738l2．7604673812．76046738l2．76046738l 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs131771482211475364278214584514591414582711000173381479161457151483711013817592424541472831461221484301787242749147199428271486634629911277428851095514604914584114864431076hsa-miR-143·3phsa-nilR-3650hsa-miRPlus．Il07*hcmv．miR—ULl48Dhsa-miR--20a--5phsa··miR·-135b··5phsa-miR-200a-5phsa-miR-200a-3phsa-miR-660—5phsa-miR-3126-3phsa．miR．．648hsa．miR-3620hsa-mjIol30a-3phsa．．miR．．604hsa-miR··138··2··3phsa．miRPlus．I137*hsa-miR-2053hsa-miR··374c·-5phsa-miR·148a-5phsa-miR·-659-·3phsa—miR-27b一3phsa-·miR-·652··3phsa-miR-557hsa·-miR-34a··3phsa-miR··7-·1-3phsa-miR-376a-5phsa-miR--148a--3phsa-miR··28··5phsa—miR一23b一3phsa-miR-551b一3phsa．miR．5590．0236865220．9534047650．9288174520．8840135650．5198735l10．8829959110．982126485O．125234644O．9197520550．9798644680．9681245330．9675743840．4732374070．9755732330．8269112240．909617】320．98469502lO．9015686990．9674096660．924508920．1761386330．9440300020．9445519020．9789895030．9924539040．975147170．5689724710．9321576620．0029492120．9760248640．9l75456633．2793522274．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846l53854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846153854．9846l53854．9846153854．9846153854．98461538522 硕士掌位论文三、讨论在本部分研究中我们随机选取了广东省人民医院耳鼻喉科喉癌标本库中的10对新鲜冰冻喉癌组织及癌旁正常组织标本，采用丹麦Exiqon公司的第六代miRCURYTMLNA(v．16．O)芯片进行分析，获得了喉癌及其癌旁正常黏膜组织中miRNA的全基因表达谱，进一步使用SAM软件找到与喉癌相关的差异具有统计学意义的125个特征性miRNA。大多数关于恶性肿瘤的miRNA表达谱研究结果发现下调的miRNAs比上调的多‘37，381，我们的研究也支持此观点：芯片结果发现ll"i"miRNAs表达上调，114个miRNAs表达下调，下调的miRNAs占大多数。这提示了miRNAs调控的靶基因可能多为癌基因，从而发挥了抑癌的作用。寻找特征性分子标记物对于肿瘤的早期诊断和预后评估具有非常重要的意义，有助于改进治疗策略，提高肿瘤的生存率。由于miRNA具有高度保守性、时序性和组织特异性等主要特点【29。31】，而_H．miRNA的长度比较短，分子足够稳定，发生各种突变的机会较低，因此miRNA具有成为理想的肿瘤分子标记物的潜力。miRNA表达谱可区分和鉴别不同来源、不同类型的肿瘤及其分化状态，这为肿瘤的基因诊断、治疗提供了新的思路和方法，具有广阔前景。和正常组织相比，miRNA在各种肿瘤中具有不同的表达模式，这种特征性miRNAs表达谱能有效反映肿瘤组织的发展与分化状态，对肿瘤的组织起源具有诊断价值，尤其是更利于低分化型肿瘤的检测‘391。Lu等通过对10余种肿瘤的miRNA表达谱研究发现，不同类型肿瘤之间的miRNA表达谱差异很大，但从起源上来说邻近部位组织的肿瘤可以归类到一起，同时该研究还对同一样本的miRNA和mRNA的表达谱进行了比较，结果发现在对检测肿瘤来源和分化程度方面，miRNA表达谱的准确性优于mRNA表达谱【39】。而且，多项研究发现，某些miRNA的表达与肿瘤的预后有关【40，411，miRNAs有望成为评估肿瘤病人预后的新型分子标记物。因此鉴定喉癌特征性miRNA表达谱具有非常重要的意义。 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs头颈肿瘤miRNAs的表达谱研究起步较晚，相比肺癌、乳腺癌等其它肿瘤明显滞后，而且miRNA的相关研究目前还主要针对混杂的头颈多部位肿瘤组织或细胞株中miRNA表达谱的研究，单独进行喉癌miRNA的研究非常少，到目前为止仅报道过3篇。而且现有报道的头颈癌miRNA表达谱与喉癌miRNA表达谱存在较大差异，这表明了对头颈癌miRNA表达谱并不能取代各个不同部位的miRNA表达谱，有必要对喉癌miRNA表达谱进行单独研究。不同研究中miRNA表达谱存在较大差异的重要原因之一可能是标本的质量问题。长期以来国内大多数医院没有建立起规范的肿瘤组织库和标本管理方法，存在许多问题：很多研究者在开展某一研究项目时才开始收集标本，延误了研究进度；没有标准化流程，缺乏专人管理，也没有定期进行质量鉴定，没有进行信息化管理；采集标本没有经过伦理委员会的同意，也没有病人的知情同意等。因此广东省人民医院耳鼻喉科喉癌规范化标本库的建立对本研究以及其他喉癌基础研究具有重要的价值，有助于保护宝贵的生物医学资源。标准化的标本采集、处理保存、信息化管理为喉癌研究提供了高质量的标本。高质量的组织标本是获得准确的肿瘤特征性表达谱的强有力保证。我们所取的喉癌和癌旁正常组织标本均在离体30min置入RNAlater液(Qiagen)中保存，4。C冰箱过夜后，放入．80‘C冰箱保存。而且所有配对标本均经过经验丰富的病理科医生鉴定，在确定手术切缘为阴性的基础上，在切缘外距肿瘤至少2cm处取正常粘膜组织作为对照，一旦发现标本不合格马上将其剔除。在进行microRNA基因芯片检测前，我们通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测进行了标本的总RNA质量鉴定，结果表明样品。营,RNA的质量可靠、未降解，可用于后续实验，以上各项措施充分地保证了基因芯片结果以及后续的下一步qRT-PCR验证实验结果的准确可靠。基因芯片(微阵列芯片)技术是一个里程碑式的重大突破，它是近年发展起来的融合了微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学的新技术，它克服了传统核酸印迹技术(SouthernBlot、NorthernBlot等)操作复杂、自动化程度低、24 硕士学位论文检测目的基因数量少、低通量等缺点，大大减轻了生命科学研究的工作量，己广泛应用于各种基因的研究中。基因芯片技术现己成为研究miRNA表达谱的重要手段。目前己发现来自100多个物种的超过10000个miRNAs，其中人类成熟miRNAs已有1000多个(http：／／www．mirbase．org)，而且其数量还在不断地快速增长之中。对数量如此庞大的miRNAs进行分析研究，需要高效率、高通量的检测技术。miRNA微阵列芯片技术通过设计芯片上miRNA基因及对照序列广泛应用于miRNA基因研究中。miRNA微阵列芯片技术与传统RNA分析方法比较，具有明显优势：(1)高通量联合检测，可以同时检测上千个miRNA，还可分析出miRNA的表达水平；(2)检测的灵敏度和效率高；(3)样本需要量小：仅需lug总RNA即可完成所有检测。我们的研究应用J"Exiqon公司的具有高灵敏度和特异性、最新版本的含有1890个miRNA探针、可检测目前miRbase数据库中全部人类microRNA的第六代miRCURYTMLNA(v．16．0)microRNA微阵列芯片进行检测，其LNA专利技术具有以下特点：均一化的Tm值(统一为72℃)、高特异性探针(可显著提高单碱基差异的分辨能力)、独特的总I矾A标记方法(仅需1-2ug总RNA，样品用量少，信号保真)、以及完整的质控体系，尽可能地保证了检测结果的可靠性和准确性。在芯片筛选获得的喉癌组织miRNAs差异表达谱的基础上，我们应用了目前在芯片数据分析方面最常用的SAM(SignificantAnalysisofMicroarray)统计分析软件来筛选在各样本中表达重复性好、表达丰度相对较高、差异较显著的miRNAs，获得了喉癌特征性miRNA差异表达谱，进一步支持了喉癌组织相对癌旁组织相比miRNAs表达谱有明显差异的研究结果。基因芯片技术可以同时检测成千上万个基因的表达水平，但与此同时，多重检验的问题和芯片实验的样本量往往较小对鉴别差异表达基因的统计学方法带来了新的考验。统计分析方法应既能筛选到尽可能多的差异表达基因，同时又要保证较低的假阳性率，否则将大大增加后续验证工作的工作量。目前用于筛选差异表达基冈的统计方法有传统的两样本t检验、非参数检验 第一章利用基因芯片技术筛选喉癌组织中差异表达的miRNAs法、针对多重检验进行修正的Bonferroni法等，还有专门针对芯片数据的SAM软件，其中SAM软件无疑是最佳的选择。有研究[421表明，两样本t检验着IWilcoxon非参数检验法筛检得到的差异表达基因数E1较多，但其错误发现率(FDR，falsediscoveryrate)也较高，这意味着由这两种方法筛选到的目的基因有很多是假阳性。Bonferroni法的FDR很低，但筛选得到的差异表达基因数目也最少，导致筛检效率低。而SAM在筛选得到较多差异表达基因的同时，FDR值还控制在较低的水平。此外，由于miRNA的基因芯片结果属于多重检验的范畴，两样本t检验可能并不适用。因此对于应用基因芯片初筛差异表达基因而言，SAM是比较理想的分析工具，因此该方法目前在芯片分析领域被广泛应用。SAM是由美国StaMford大学开发的一个免费软件，我们使用的SAM4．0作为MicrosoftExcel的一个插件，界面友好，操作比较简便。它可接受缺失值，也可根据需要调整Delta值，得到不同的FDR估计值和相应的差异表达基因，而且计算速度快，特别适用于基因芯片。SAM软件以t检验为基础，并考虑芯片数据噪音大小与表达峰度相关的特点进行了校正，其分析的一个基本前提就是需要至少3次实验以上的重复，重复可以是不同病人的重复或者多次实验的重复。通过重复实验，才能从统计学意义上判断差异变化的基因。Cao等[43】通过基因芯片：乖1qRT—PCR研究发现在喉癌中miR．2l、miR．93、miR．205、miR一708表达上调，而miR-125b和miR-145表达下调。钟琦等【44J通过基因芯片研究发现，与对照组相比，喉鳞状细胞癌组织中表达升高的有，miR．200b、miR．21、let．7i、let．7e、miR-93、miR一19a、miR一106b和miR-19b．2：下调的有：miR-543、miR-520h、miR一582—3p、miR—1305和miR-203，但未进一步行qRT—PCR验证。王苹等145】的研究结果则显示在喉癌组织中miR一93，miR-31，miR一221，miR一17，miR一20b表达增加，而miR一133a，miR一1，miR一30b，miR．487表达下降。我们的研究发现与以往的研究一致的miRNAs有miR．21、miR一106b，miR-203、miR一125b、miR-145、miR-30b：与以往的研究相反的有：let．7c、let一7f-5p、miR．20b；还发现了一些以往未见报道的喉痛特异性miRNAs，如miR．195—5p。26 硕士学位论文本研究与以往的miRNAs在头颈肿瘤或喉癌的表达谱研究结果有一定的差异。这可能是因为：l、使用不同的检测方法或不同的基因芯片；2、选取的样本来源不同：大多数的研究为多种头颈肿瘤的综合检测，没有区分部位，喉癌标本之间存在异质性；3、应用不同的基因芯片分析软件或方法，我们选用了目前国内外最常用于分析基因芯片数据的SAM软件进行分析；4、其他因素：如不同种族、地区、病理分化、年龄等。目前喉癌早期诊断和预后评估还没有突破性的进展，喉癌miRNA特征性表达谱的确立有望为喉癌的早诊早治提供强有力的保证。然而，芯片分析结果有一定局限性，获得的喉癌miRNA特征性表达谱有假阳性可能。因此，我们在下一部分进行7qRT．PC娥证。 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对基因芯片结果进行验证第二章应用实时荧光定量PCR(qRT．PCR)对基因芯片结果进行验证一、资料和方法(一)研究资料我们在广东省人民医院喉癌标本库中选取了喉癌组织及癌旁正常组织32对标本(见表2-1)进行qRT-PCR实验，标本取材与保存同第一部分。所有患者术后病理诊断均为鳞状细胞癌，术前均未接受放、化疗。表2-1入选qRT-PCR实验的32例喉癌病人临床病理资料Tab．2-1Clinicopalh0109icaIcharacteristicsof32patientsselectedinqRT-PCR 硕士学位论文(二)主要实验仪器及试剂l、实验仪器：磁力搅拌器(森信)、低温高速离心机(H伽ER)、低温冰箱(HAIER)、EP管(Axygen公司)、各种不同规格的RNAase—flee枪头(Axygen公司)、弯头吸管、分光光度计、凝胶成相仪(上海培清)、电泳仪(Tannon公司)、q-PCR仪(Bio—RadCFX96)；2、主要试剂：Trizol(Invitrogen，Carlsbad，California)、氯仿、异丙醇、75％的乙醇(DEPC水配制)、琼脂糖(西班牙BioWest公司)、iScriptTMcDNASynthesisKit(Bio—RadLaboratories，Hercules，CA)，SsoFastEvaGreenSupermix(Bio-RadLaboratories，Hercules，C舢、各目的miRNAs的上、下游引物由广州锐博生物公司合成。Sybrgreen染料(TaKaRa公司)；MMLV-RT逆转录酶(TaKaRa公司)：29 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对基因芯片结果进行验证dNTP(TaKaRa公司)试剂配制：DEPC水(Sigma-AldrichCorp，St．Louis，MO)：每1000mlddH20中加入lmlDEPC，终浓度为0．1％，充分混匀，37。C过夜后，高压灭菌；电泳缓冲液(TBE)：54gTris—base，27．59硼酸，定容至500ml；(三)实验方案与步骤通过实时荧光定量PCR的方法，采用SybrGreen染料法，以U6为内参基因，对于let·7f-5p、miR-10a一5p、miR-125a-5p、miR-144—3p、miR-195-5p、miR一203基因在32例喉癌病人的肿瘤及癌旁正常组织中的表达量进行检测。1、总RNA的提取取少量组织用液氮研磨成粉末，然后挑取60mg左右粉末于预先加入lmlTrizol的离心管中，震荡使充分裂解；室温放置5min后加入氯仿0．2ml／管，用力振摇15s。15—30℃下孵育3—5min，离心(4℃，12，0009，15min)；离心后液体分为三层(上层无色水相为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色水相移入一新的EP管中；加入等体积异丙醇，混匀，一20℃下孵育30min，离心(4℃，12，0009，lOmin)；去上清，加入lml75％乙醇，温和振荡悬浮沉淀，离心(4℃，7，5009，5min)；尽量弃去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。后每管加入20．501xlDEPC水溶解，-80。C冰箱保存。2、逆转录(RT)取2ng～299总RNA用MMLV-RT逆转录酶按照说明合成eDNA(反应体系见表2—2，表2—3)。表2—2RT反应体系组成(第一步)Tab．2．2RTreactionsystem(firststep)试剂用量全部特异的RT引物(25“M)总RNAdH202．0x6=12．01．tl2．09l10．OpiTotal24．0pl30 硕士学位论文70℃温育10min变性后冰浴2min表2．3RT反应体系组成(第二步)Tab．2-3RTreactionsystem(7secondstep)试剂用量第一步获得的混合液RNA酶抑制剂5xM—MLVBufferRTaseM—MLV(RNaseH一)(200U／91)dNTPMixturedH2024．01．d2．0LLl8．09l2．09l2．0u1Total40．Opl30。C反应10min，再42。C孵育lhr，最后70。C保温15min灭活反转录酶，逆转录产物作为下步PCR模板。3、q-PCR按照试剂说明书配好反应体系，进行RealTimePCR扩增和检测。反应体系为20gl总体系(见表2—4)。每个样本重复3个复孔，Bio．RadCFX96Manager软件分析，GraphPad软件作图。表2—4q-PCR反应体系组成Tab．2-4q-PCRreactionsystem．试剂用量2xMixSYBRGreenI荧光反应液PCRForwardPrimer(10gM)PCRReversePrimer(10BM)cDNA模板dH2010．09l0．25LLl0．25u11．0u18．59l堕20．0gl反应条件95V20sec预变性，循环f为95。C10sec变性，60。Cj．垦'Je．20sec．70"CL垂．伸10sec，共设置40个循环，在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT．PCR)对基因芯片结果进行验证线；40个循环后设置(95。C15s，60。C30s，95。C15s)反应步骤，并且对60。C到95℃升温整个过程进行全程荧光信号收集，绘制融解曲线。4、结果分析：对获得的Ct值采用2也△Q法对基因表达进行相对定量，喉癌组与癌旁正常组表达水平的比较采用配对样本t检验。二、结果对let一7f-5p、miR-10a-5p、miR一125a、miR-144．3p、miR．195—5p、miR-203等6个表达下调的miRNAs进行qRT．PCR验证(以U6为内参)，这6个miRNAs在32对喉癌与周围正常喉黏膜组织之间的表达差异均有统计学意义(P<0．05)。miRNA定量PCR溶解曲线均为单一峰，说明PCR扩增特异性好(见图2．1)。et一7f-5p扩增曲线let一7f-5p溶解曲线miR一10a一5p扩增曲线 硕士学位论文^m口I№UOn厅心黝护。f：0CYc啪1。I毫·矿'r1矿'0●墓，一1子1一’一盘，一rruR—125a扩增曲线搋甄。一缎miR一144—3p扩增曲线iloA?0—07075∞e5Te“∞杆■坩^Cd“rnjR．125a溶解曲线miR一144—3p溶解曲线miR一195—5p扩增曲线miR一195—5p溶解曲线纺～黝cm‘口Logsc“miR一203扩增曲线rniR一203溶解曲线图2—164-miRNAs2更内参U6的qRT—PCR扩增曲线及溶解曲线图Fig．2-1Amplificationcurveandmeltingcurveofsi)【miRNAsandinternalreferenceU6inqRT—PCR．33瑚啪乏耋枷湖瑚_2^^r岂寸 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT—PCR)对基因芯片结果进行验证以U6作为内参照，通过2也△Q法计算喉肿瘤组与癌旁正常组之间目标miRNAs表达水平的差异。其中Ct值为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增是呈对数期增长，ACt=肿瘤组或癌旁组△Ct值．内参△Ct值，△ACt：lleO瘤组△ct值．癌旁组△Ct值。将原始数据(Ct值)取3次重复的平均值后用内参基因U6校正，计算各miRNA的差异表达倍数(2。△△Q)，qRT—PCR结果见表2—5。表2—5qRT—PCR验证的6个miRNAs的差异表达倍数Tab．2-5FoldchangeofsixdifferentiallyexpressedmiRNAsvalidatedbyqRT·PCR．miRNAs差异表达倍数(2。△△Q)let-7G5pmiR-10a-5pmiR．125amiR·-144·-3pmiR-·195--5pmiR一2030．1210．1620．2610．2380．12l0．135我们再将芯片结果与qRT．PCR结果进行比较，图2—2显示，miRNA芯片与qRT．PCR的结果相符，这6个miRNAs在喉癌组织中的表达均下调。 硕士学位论文2．001．50o咖a四号1．00日。口■0．50O．00】et-7f_5pmiR一10a—ITliR—ITliR一144一miR一195一miR-203513,125a-5p3p5PMicroRNAD图2—2对6个miRNAs进行qRT-PCR与基因芯片比较。可见qRT-PCR与基因芯片结果一致。(其@miR-125a又称为miR-125a一5p)Fig．2-2ComparisonofqRT—PCRandmiRNAarraydataforselected6miRNAs．TheresultsofmicroarraywereaccordantwiththosefromqRT—PCR．(miR-125aisalsoknownasmiR一125a一5p)三、讨论由于miRNA基因芯片结果存在一定的假阳性的可能，而且其可重复性仍受到一定质疑[46，471，因此经其筛选所得的差异表达的miRNA--般仍需要进一步验证。因此，本部分研究中，我们对另#[-32对喉癌组织标本应用茎环引物的荧光定量PCR技术进行验证，证实了let-7f-5p、miRNA一10a一5p、miRNA一125a、miRNA一144—3p、miRNA一195—5p、miRNA-203等6个miRNAs在基因芯片以及35 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对基因芯片结果进行验证qRTPCRqb均显著下调。qRT．PCR与芯片结果一致，说明了本实验基因芯片结果的可靠性。常用的验证方法有克隆测序、NorthernBlot、实时定量PCR等。克隆测序虽然可提供准确的miRNA表达信息，但操作繁琐，效率较低。Northernblot虽然精确性高，但也有其缺点：第一，需要使用放射性元素标记探针，对实验操作人员有一定危害：第二，难以检测到低丰度的miRNA。由于具有高度的特异性和敏感性，实时荧光定量PCR(qRT．PCR)被广泛认为是包括miRNA在内的核酸定量检测的金标准【481，是目前最常用于验证在微阵列基因芯片等高通量实验技术中发现的特异性miRNA的技术。qRT．PCR技术最早出现于1996年，它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。使用的荧光基团可以是荧光染料或荧光探针。常用的荧光基团有SYBRGreen染料和Taqman探针，具有快速、可重复等优点。本实验采用的是SYBRGreen染料法。因为前体miRNAs含有稳定的发夹结构，而成熟miRNAs大小只有17～25nt，大约只有常规PCR'3l物的大小，没有mRNA的poly(A)尾巴，因此通过PCR技术来进行扩增具有很大挑战，传统的qRT．PCR技术不适合于检测miRNA。但通过特殊设计的RT引物，配合qPCR引物及探针就可以精确检测微量样品中miRNA的表达水平，也可以用于终点RT—PCR定性检N[81，82】。Chen等【49】发明的茎环(Stem-loop)结构的实时定量PCR(Stem．100pRT—PCR)因具有简便、高敏感、高特异等特点已成为目前miRNA定量检测法的最推荐的qRT．PCR方法。Stem．100pRT结合实时定量PCR包括设计具有茎环结构的反转录引物和应用miRNA荧光标记的特异分子探针进行检测的两个关键实验步骤。该技术相对其它microRNA检测技术有以下明显优点：1．高度特异性：可以针对成熟microRNA进行定量，还能有效区分成熟microRNA分子和前体microRNA分子以及其它成熟microRNA的同源分子；2．超大的定量线性范围和很高的检测灵敏度：从几个拷贝到几万个拷贝，定量范围最多可达7个数量级；3．样品需要量少：仅需1～10ng的总RNA；4．适用范围广：总RNA、细胞裂解 硕士学位论文物以及纯化的RNA均可用于进行miRNA的定量检测；5．可用于其他小分子RNA的检测。实时定量PCR的结果一般通过相对定量来计算miRNA的表达水平[50l，由于Ct值反映的是指数关系，所以需要应用2‘△△C‘法，将其转化成线性关系，再进行统计学检验。IIIlIIlIcDNAStep2：Real-timePCRForwardprimer图2—3茎环结构的实时定量PCR示意图Fig．2-3SchematicdescriptionofTaqManmiRNAassays．TaqMan—basedreal—timequantificationofmiRNAsincludestwosteps，stem-loopRTandrealtimePCR．对哪些差异表达miRNAs进,}yqRT-PCR验证实验需要根据多种因素综合考虑而决定的，除应用SAM软件统计分析外，我们尽量选取表达丰度较高、在10对喉癌／癌旁组织的芯片筛选中表达较稳定(P值小于0．05)的microRNAs作为候选。此外，我们也参考了相关文献所报道的miRNAs的一些研究结果。本研究中qRT．PCR结果表明验证了let一7f-5p、miR一10a．5p、miR一125a、葛弋呻№6№ 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT—PCR)对基因芯片结果进行验证miR．144．3p、miR-195．5p、miR．203等6个miRNAs在喉癌基因芯片中筛选结果提示为低表达的microRNAs，结果表明实时定量PCR的结果虽然在数值上和芯片筛选结果有一定差异，但总体趋势是一致的。因此，miRCURYLNA基因芯片(丹麦Exipon)芯片筛选结果是准确可靠的，证实了喉癌组织和正常喉组织之间的miRNAs有表达差异。提示差异表达的miRNAs可能在喉癌的发生发展过程中起到重要作用。虽然以往已经有研究证实与正常喉组织相比，喉癌组织有明显的miRNAs表达差异，但是不同的研究结果所报道的miRNAs表达谱差异很大，原因可能在于目前miRNA在喉癌表达谱的研究仍存在以下诸多不足之处：(1)肿瘤取材部位不同。现有研究多为头颈肿瘤的研究，单纯喉癌研究很少。头颈肿瘤是来源于头颈部不同解剖部位的多种肿瘤的总称，包括鼻咽癌、鼻腔鼻窦癌、口腔癌、口咽癌、下咽癌、喉癌等。虽然头颈部各种肿瘤的发病部位相近，然而，喉部作为呼吸系统的一部分，与口腔、咽部等所属的消化系统有所不刚5‘，521。喉癌与其它头颈鳞癌有着不同的危险因素[531、临床病理特征、生物学行为及预后[541，例如喉癌病人的性别构成中男性发病比例占90％以上，明显较其他头颈肿瘤高【521。而且，有喉癌与其它头颈鳞癌的基因组杂交比较研究发现，两者的染色体型存在明显差异【551。所以，不区分部位地对头颈鳞癌一起进行研究可能会影响实验结果的可靠性并带来偏倚。此外，组织样本中肿瘤细胞和非肿瘤细胞的比例也可能会影响表达谱的检测结果。(2)miRNA的检测方法和统计分析方法不同。各研究选用的的芯片可能由不同的公司制备，而且，由于基因芯片等相关研究技术也在不断进步，新的miRNAs也不断被发现，同一公司制备的芯片也在不断改进。采用不同的miRNAs芯片或不同的芯片数据统计分析方法，其结果必然存在一定差异。另外，在芯片分析得出的差异表达miRNAs往往很多，而选取不同的miRNAs进行qRT—PCR验证也导致了研究结果的不同。另外，基因芯片结果存在一定的假阳性，不少研究仅进行基因芯片检测，未进一步进行qRT—PCR验证等均可能对研究结果带来一定影响。 硕士掌位论文(3)标本制备方法不同。不少研究中所采用头颈肿瘤标本，是在标本离体后，立即置入液氮中保存：也有的研究的组织标本在切除后放入预先准备好的RNAstore标本保存液中；一些研究标本采自多种不同的头颈肿瘤细胞株，还有部分研究的标本为石蜡包埋的组织(在固定和包埋过程中可降解或者发生严重的交联，故结果可能不如新鲜冰冻组织准确)。此外基因芯片检测所需的总RNA的提取方法也有所不同，在样本处理过程中不能排除miRNA降解的可能。(4)其他潜在的影响因素，包括喉肿瘤的不同病理分化类型、解剖部位(声门型／声门上型)、I临床分期以及病人的种族、地区差异等。由于芯片技术价格昂贵，现有多数研究的标本量较小；不同研究结果间存在较大差异：因此，在喉癌规范化标本库中选取高质量的新鲜冰冻组织标本，并应用最新的基因芯片丰UqRT．PCR技术进行喉癌组织I拘lmiRNAs表达谱研究显得非常有必要。在我们的喉癌miRNA差异表达谱研究结果中，有miR-10a．5p156】、miR一125at361、miR-203t44I、miR-144—3p[45i等microRNA与以往的头颈鳞癌的文献报道一致。其中miR-125a[361、miR一203|441、miR-144—3p三个miRNA在文献中仅进行基因芯片检测的miRNA，我们对其进一步进行了qRT—PCR验证。miR-125a(又称为miR-125a-5p)_；f11miR-144(又称miR-144．3p)在头颈鳞癌或喉癌组织的基因芯片研究E36,45]di，被发现表达下调。然而，文献中均未见qRT-PCR验证的相关研究报道。WangW等‘571对已发表的28项肿瘤相关的miRNA基因芯片研究进行meta分析后发现，在超过10项研究中，miR-144均被发现在多种肿瘤组织中显著下调。miR-144．3p在直肠癌、甲状腺滤泡状癌㈣等显著下调。我们的研究不但通过基因芯片技术再次证实，而且首次应用qRTPCR技术验证了miR．125a和miR一144确实在喉癌组织中表达下调。miR-203--般被认为是一种抑癌基因，在肝癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌中表达下调，然而目前miRNA一203在喉癌中的可能作用仍存在争议。钟琦等【441的基因芯片研究中发现头颈鳞癌组织中同样表达下调，但该研究未对芯片筛选结果进行qRql．PCR验证。BianK的最新的细胞功能研究【5纠认为，过度表达的39 第二章应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对基因芯片结果进行验证miR-203能通过直接作用于凋亡抑制基因survivin，抑制喉癌细胞的增殖和克隆形成能力，使细胞周期G1期阻滞，起抑癌基因的作用。然而，LiuM等1601对三对喉癌组织的研究中，在基因芯片检钡4中miR-203的表达却显著上调，但该研究未对miR-203进行qRT-PCR验证，而且样本量明显偏小。在本研究中，45对喉癌组织中的miR-203在基因芯片以及qRT．PCR中均显著下调，我们的研究结果支持了钟琦、BianK等的miR-203可能是与喉癌相关的一种抑癌基因的观点，但仍有待进一步的细胞功能研究加以证实。同时我们也发现了一些尚未在头颈鳞癌或喉癌研究中报道的或结果不一致的microRNA，如let一7f-5p、miR-195．5p。Let．7是最早在秀丽隐杆线虫fC．elegans)@发现的miRNA之一，其家族包括多个成员，如let．7a、let．7b、1et。7c、let．7d、let．7e、let-7fo目前研究已证实Iet一7与肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种人类肿瘤的发生、发展有关，其表达水平均显著下调。有研究认为let一7i在头颈鳞癌中高表达【36】，而let．7a、C、e低表达【5翻。在我们的研究中喉癌组织fl‘JLet．7f-5p呈低表达，与Tran等㈣的研究(Let一7f-5p为高表达)相反，这可能是因为Tran等的研究是应用包括舌、扁桃体、下咽、喉等多种头颈肿瘤细胞株进行芯片检测，而且没有对Let一7白茬行验证；而我们的研究则选用新鲜冰冻喉癌组织进行研究，而且进行YqRT．PCR验证。这也进一步证明了对喉癌等单病种而非多部位的不同头颈肿瘤合并研究的优势。MiR-195是microRNA．15／16／195／424／497家族的重要成员，在肝癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、慢性淋巴细胞性白血病等多种肿瘤中均存在异常的表达下调【62I，这提示miR．195可能是一个重要的肿瘤抑制因子。大量研究表明其涉及到细胞周期、凋亡、增殖等肿瘤发生发展机制，在促进细胞分裂和凋亡同时抑制细胞增殖。目前研究认为miR-195是通过对靶基因WEEl，CDK6，andBcl一2的调控，实现对细胞周期的调控以及促进凋亡的效应【621。在XuT等№31的一项关于肝癌的研究中，miR．195可以同时抑制cyclinD1、CDK6和E2F3这三个pRb／E2F通路重要调控因子的表达，从而抑制细胞周期G1／S的转换，而抑制miR-195的功能N-口-f促进细胞周期的进展。pRb／E2F通路同时控制着细胞的增殖及凋亡信号。 硕士学位论文我们的研究提示，在喉癌中miR．195可能同样存在异常的低表达，并作为一个抑癌基因发挥着重要作用。但这需要细胞水平的研究以进一步证实。通过本部分研究我们认为，miRNA可能参与了喉癌的形成过程，这些被证实的差异表达的miRNA未来有可能会成为新的喉癌标记物和治疗靶点，通过抑制高表达的miRNA或者添加低表达的miRNA有可能抑制喉癌的发生、进展，最终改善患者预后。当然，芯片筛选出并窒kqRTPCR验证的异常表达miRNA是否真正参与喉癌的发生发展过程，仍需要我们在细胞功能实验以及大规模的临床病例样本中进行进一步验证。 第三章miR-125a抑制喉癌Hep2细胞株增殖的研究一、资料和方法(一)细胞培养及瞬时转染1、细胞株、培养基及相关试剂、仪器1．1细胞株Hep2细胞(购自美国ATCC收藏中心)，培养于含10％FBS的1640培养基中。1．2细胞培养基及相关试剂、仪器试剂：(1)1640基础培养基：购自Gibco公司，4℃保存；(2)1640完全培养基：每90ml基础培养基中加入胎牛血清(Gibco公司)lOml：(3)胎牛血清(FBS)：购自Gibco公司，分装后一20℃保存；(4)PBS：0．29KCI，0．29KH2P04，2．8859NaH2P04‘12H20，8．09NaCI，调节PH至7．2，定容至1L，高压灭菌，4"C保存；(5)0．25％胰蛋白酶：2．59胰蛋白酶，溶于1000mlPBS中，4"C溶解，调PH值至7．6，0．229m滤膜过滤，分装后．20。C保存；(6)脂质体Lipo诧ctamineTM2000转染试剂(Invitrogen公N)。仪器：细胞超净台(广州嘉凡公司)；37。C细胞培养箱(Thermo)，离心机(珠海黑马)。2、实验步骤2．1、细胞培养2．1．1、细胞复苏：从液氮中取出冷冻管，迅速投入37"C水浴中，溶化lmin。室温下5min内用恢复至室温的完全培养基稀释至原体积的5倍。1,000rpm低速离心5min，去上清，加入完全培养基15ml，放入C02培养箱中。2．1．2、细胞扩增：将Hep2细胞分别接种在含10％胎牛血清的RPMI．1640培 硕士学位论文养基中，置于37。C、5％COz、相对湿度90％的培养箱中培养，细胞生长良好，呈单层贴壁生长。实验前于倒置显微镜下观察，细胞形态良好。2天换液1次。2．1．3、细胞传代：镜下观察细胞达到90％融合度时，倒出原培养液，吸取上述配制的完全消化液(0．04％的EDTA溶液+O．25％的胰蛋白酶)，加入培养瓶，使消化液完全覆盖瓶内细胞生长面。并轻微摇晃培养瓶使消化液与细胞充分接触，室温放置约2--、，3min后，倒置显微镜下观察细胞己离开瓶壁、细胞己基本呈游离状态，或少数细胞皱缩后，以吸管吸取细胞完全培养液加入培养瓶，以终止消化。以吸管吸取瓶内液体吹洗细胞生长面，观察到培养瓶细胞生长面光亮透明、未见毛躁现象时，表明细胞已基本脱离瓶壁。然后反复吹打细胞悬液(因细胞之间联结紧密，为使细胞完全分开，吹打时间应足够)。将细胞悬液吸出培养瓶，放入离心管内，1,200rpm离心3min，弃上清后加入完全培养液并调整细胞浓度，各吸取一定量细胞滴入已经加入完全培养液的培养瓶内，于37。C、5％C02孵箱中进行传代培养。2．2、细胞转染化学合成的miRNA模拟物(mimic)是双链RNA分子，转染至细胞后可以模拟内生miRNA发挥作用，增强miRNA的调控作用，从而达到过表达外源性miRNA的目的。化学合成的IniRNA抑制物(inhibitor)是单链RNA分子，转染至细胞后可以特异性_}ql,lJmiRNA的功能。通过结合到成熟的miRNA上、干扰miRNA的生成、阻止miRNA}3I]工、或阻止其从核内转运至胞浆发挥作用，从而达到降低内源性miRNA的目的。细胞瞬时转染实验步骤：1)细胞系Hep2在含有10％胎牛血清的1640培养基(不含任何抗生素)中，37。C恒温培养。转染前24dx时消化和计数细胞，分别在6孔板的每孔中接种4x105个细胞，待细胞达N70—80％汇合进行转染：2)细胞转染：a．稀释miRNAmimic、Inhibitor：分别将miR．125a-mimic，inhibitor，阴性对照(NC)稀释于250”1无血清的基础培养基opti．MEMt0，轻轻混匀，室温孵育5min： 第三章miR-125a抑制喉癌Hep2细胞株增殖的研究b．稀释lip02000：用250肛1不含血清培养基Opti—MEM稀释51allip02000，轻轻混匀并室温孵育5min；c．将a与b轻轻混匀，按下表混合配平，室温孵育20min。表3—1细胞转染试剂配制表。Lipofectamine2000(Lip02000)Tab．3-1Transfectionreagentpreparation．Lipofectamine2000(Lip02000)3)吸弃细胞培养物中的完全培养基，用基础培养基opti—MEM漂洗细胞2次，加入无血清基础培养基opti．MEM1．5mL；4)将c加入细胞中，前后轻晃6孔板使混合液分散均匀。5)6小时后吸弃转染复合物，换入含10％胎牛血清的新鲜培养基，进行后续实验检测。(--)MTT实验四唑盐比色法(MTT)的原理：MTT实验是一种检测细胞存活数量及活性的快速简便的实验方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有细胞存活时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄的MTT还原成蓝紫色结晶产物甲瓒(Formazan)结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度OD值。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，通过OD值高低可间接反映活细胞相对数量和相对活力。该方法己广泛应用于一些生物因子的活性检测、抗肿瘤药物的筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的优点是灵敏度高、经济简便。 硕士学位论文1、实验材料及试剂MTT．3-(4，5)一双甲基·2一噻唑一(2，5)一二甲苯基溴化四氮唑，即噻唑蓝(Sigma)，5mg／ml，滤过除菌，4"C保存，2周内使用；二甲亚砜(DMSO)(Sigma)，96孔板(康宁)，酶标仪(BIO-RAD)2、操作步骤(1)用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。(2)离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。(3)将细胞稀释至O．5～1x104个／mL，每个孔加入200此细胞悬液，注意经常吹打混匀细胞悬液，使每孔细胞数保持一致。每种细胞分4份分别种于4个96孔板，每份细胞至少3复孔。(4)将培养板放回细胞培养箱中继续培养，至第1，3，5，7天时，分别取出1个96孔板进行检测。(5)各细胞培养孔加入20pLMTT(5mg／mL)。用铝箔包裹培养板，于37。C湿润环境中温育4h。(6)弃去孔中的培养基和MTT(轻柔操作，防止结晶丢失)，加入150I．tlDMSO，以溶解残留的MTT-甲躜结晶。(7)水平摇床低速混合10rain，使结晶充分溶解。(8)酶标仪490nm处记录吸光值。(9)结果分析：将1，3，5，7天测得的OD值汇总，绘制细胞生长曲线。(三)克隆形成实验细胞接种后贴壁存活的细胞不一定都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必然为贴壁和有增殖能力的细胞。因此检测肿瘤细胞的克隆形成数量对判断肿瘤增殖能力有重要意义。1、主要实验试剂和仪器六孔板(康宁)，苏木素(上海宏基)，脱色摇床(Qilinbeier)。2、方法步骤l、收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度500细胞／mt，分于六孑L板，每 第三章miR-125a抑制喉癌HeD2细胞株增殖的研究孑L2ml，即1000细胞／孑L。2、观察：培养7～10天，观察克隆出现日期及生长情况，大于50个细胞的集落算一个克隆。3、细胞固定：lxPBS洗3次，加固定液1m1／孔(甲醇固定)摇床上放置10min。4、染色：加1ml／孔苏木素摇床上放置10min，倒掉苏木素，轻轻冲洗干净。5、结果观察：计数每个孔的克隆数并拍照。克隆形成能力是评价肿瘤细胞存活和增殖的一个良好指标。它不但反映细胞增殖能力，还能反映了细胞群体依赖性。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成能力差别也很大，一般原代培养细胞克隆形成能力弱，传代细胞系较强：二倍体细胞克隆形成能力弱，转化细胞系较强。而且克隆形成能力与接种密度有一定关系。在克隆形成数目测定时，接种细胞需分散成单细胞悬液，到细胞形成克隆时终止培养。通过计数克隆形成数目，可对不同肿瘤细胞的存活和增殖潜力进行分析比较。(四)软琼脂集落形成实验(softagar)软琼脂集落形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，如许多恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度。该培养法可选择性地使已转化的细胞进行增殖并形成集落，而抑制正常细胞的增殖。正常细胞仍停留在接种时的状态，几乎不进行增殖。在软琼脂中形成集落的能力和在动物体内进行接种而形成肿瘤的能力一般是平行的。1．实验材料及试剂软琼脂：用蒸馏水分别制备出0．66％弃IO．32％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，4。C保存；2x1640培养基2．基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0．25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20％血清的培养液调整细胞密度至1—2×105细胞／ml。(2)取出0．66％和1．32％的低溶点琼脂糖液加热融化后，维持在40。C中。 硕士学位论文(3)按l：1比例使1．32％的琼脂糖和2x1640培养基混合后，取2mL混合液注入六孔板中，冷却凝固，可作底层琼脂，置C02温箱中备用。(4)按1：1比例让0．66％的琼脂糖和细胞悬液混合(2x104个细胞重悬于lml2x1640+20％FBS的培养液中)，注入铺有1．32％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37。C5％C02温箱中培养10～14天。(5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。(五)BrdU实验检测miR．125a对喉癌DNA合成期(S期)细胞比例的影响BrdU，即5．溴脱氧尿嘧啶核苷，作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物(其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替)，可像胸腺嘧啶核苷一样可插入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期(s期)而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU与单克隆抗体反应后可通过荧光显微镜在细胞爬片上显示。在肿瘤病理学中，通常以S期细胞的数量来判断肿瘤的增殖状态。由于BrdU实验可对细胞周期中S期细胞数量进行快速而可靠的检测，从而准确地反映肿瘤细胞的增殖情况。1．主要试剂及仪器：BrdU(Upstate，Temecula，California，USA)，抗BrdU抗体(Upstate，Temecula，CA)，DAPI，盖玻片，OympusBX5l荧光显微镜2．实验步骤：l、取对数生长细胞，用0．25％胰酶消化细胞，离心弃上清，以完全培养基(含10％FBS的1640)重悬细胞沉淀，将细胞种于coverslip上，孵箱培养细胞，待其贴壁；2、各孔细胞加入10州BrdU标记细胞1h；3、倒去培养基，PBS洗干净。4％多聚甲醛固定30s，再用预冷的甲醇固定20min，注意洗涤及加试剂时动作要轻柔，让试剂沿着孔壁缓慢流入，以免细胞脱落；4、吸去固定液，PBS洗2～3次各5分钟； 第三章miR-125a抑制喉癌HeN细胞株增殖的研究5、O．5％的曲拉通溶液，室温下破膜30分钟，以增加细胞的通透性。注意每一步洗涤应充分彻底，操作时动作要轻柔，并注意防止爬片干燥；6、吸弃曲拉通溶液，PBS洗2~3次各5分钟；7、10％正常山羊血清封闭液，室温下10～30分钟，实验过程中应保持湿润，不能让细胞爬片干燥；8、去除血清，加入anti．BrdU一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜，抗体稀释应遵循“现配现用”的原则；9、PBS洗2～3次各5分钟，加入罗丹明第二抗体，室温下孵育30一60分钟；10、PBS洗细胞5分钟洗3次；11、DAPI染核；12、OlympusBX5l荧光显微镜拍照。(六)流式细胞术检测细胞周期流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是一种应用流式细胞仪对细胞或其它生物粒子进行快速定量分析及分选的检测技术，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中检测多个参数，具有速度快、精度高、准确性强等优势。细胞周期(cellcycle)是细胞生命活动的基本过程，是指从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程。细胞周期可分为四个阶段：1、G1期：指从有丝分裂完成后到DNA复制之前的时间，由于细胞的DNA复制还没有开始，DNA含量是最少的；2、S期：指DNA复制的时期；3、G2期：指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间：4、M期：是指细胞分裂开始到结束，用检测DNA含量的方法是无法与G2期区分开的。细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，ONGO／GI期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，G2／M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。碘化NJ啶_(propidineiodide，Pi)荧光染料可与DNA结合，而且其结合量与DNA含量成正比。因此通过流式细胞术PI染色法对细胞I为DNA的含量进行检测，可将细胞周期区分为GO／G1期、S期和G2／M期，还可分析细胞周期各时相所占的百分比。 硕士学位论文1．主要试剂及实验仪器流式周期试剂盒(Sigma-Aldrich)；流式细胞仪(FACSCalibur；BDBiosciences)．。2．实验步骤(1)用不含EDTA的胰蛋白酶收集处理后的细胞，800rpm离心5min(2)细胞沉淀用PBS重悬清洗2次，800rpm离心5min，(3)细胞沉淀采用300I．aPBS重悬，逐滴加入700I．tl预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70％，4"C避光固定过夜。(4)1000rpm离心10min，去上清。PBS洗两次。(5)重悬细胞于500}L1含100unit／ml的RNaseA的PBS缓冲液中，避光，37。C孵育30min(6)加2mg／ml碘化丙啶(PI)至终浓度50pg／ml，避光孵育30min。(7)流式细胞仪激发波长488nm，发射波长525nm检测。(七)Westernblot检测细胞周期调控因子的表达细胞周期调控因子的异常表达可导致细胞周期的失控，因此我们采用Westernblot检测miR．125a对细胞周期调控因子的蛋白表达水平变化的影响。1．实验试剂和仪器1)电泳仪、电转仪、洗片机、灌胶板、微量加样器、压片盒、Teflon梳子、Nalgene滤器、软铅笔、镊子；2)TBS、Tris碱、SDS、过硫酸铵、TEMED、去离子水、丙烯酰胺、N，N一亚甲双丙烯酰胺、乙醇、甘氨酸(电泳级)、甲醇、二硫苏糖醇(DTT)、乙酸钠溶液(PH5．2)、NaCl、Tween-20、Tris．HCI、溴酚蓝、甘油；3)PVDF膜、Whatrnan3mm滤纸、脱脂奶粉(荷兰乳牛)、发光液(普利莱)、连接有HRP的二抗、一抗、预染Marker、胶片，BCA蛋白定量试剂盒4)主要Buffer的配制10％的SDS：在900ml的水溶液中溶解lOOg电泳级SDS，调节PH值至7．2，加水定容至1L，分装备用；1m01／1的Tris：在800ml的水中溶解12．19的Tris碱，调PH值至6．8，加49 第三章miR-125a抑制喉癌Hep2细胞株堪殖的研究水定容至1L；5moi／ITris：在1000ml的水中加入181．79Tris碱，余同上；10％的过硫酸铵：19过硫酸铵溶解于终体积为10ml的水溶液中，0．45um过滤器过滤，分装后一20。C冻存。lmol／l的二硫苏糖醇(DTT)：用20m10．01tool／1的乙酸钠溶液(PH5．2)溶解3．099DTT：30％的丙烯酰胺：将299丙烯酰胺和lgN，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中溶解，补加水至终体积为100ml。用0．459m滤器过滤除菌，保存于室温；TBST的配制：总体积500mlTris12．19NaCI409Tween．204ml用HCI调PH值至7．61xSDS加样缓冲液50mmol／l的Tris．HCl100mmol／1的DTT2％的SDS0．1％的溴酚蓝10％的甘油封闭液(5％)：109脱脂牛奶+200mlTBST2．实验操作2．1、蛋白提取和变性总蛋白的提取：去掉培养基，lmL预冷PBS洗涤两次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10min。用细胞刮刮下全蛋白裂解液，收集于离心管。总蛋白样品各5099和5XSDS上样缓冲液混匀后，100。C沸水煮5min。 硕士学位论文2．2、WesternBlot步骤11胶的制作：制备12％分离胶和4％积层胶；2)上样：微量加样器上样量：2099总蛋白；3)电泳：电泳槽与电源正负极相连，浓缩胶60V电泳30mm，分离胶100V电泳70min；4)转膜：电泳结束后，剪2张whatm．ann3mm滤纸和一张硝酸纤维素膜，其大小、形状与凝胶一致。将滤纸和膜置于转膜缓冲液中平衡10min。后依次按顺序叠放海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵，成“三明治”。将装好的“三明治”置于转膜缓冲液中，低温稳流，300mA转100min；5)封闭：5％BSA／TBST室温，摇床缓慢摇动，封闭60min；6)一抗孵育：都使用1：3000的稀释度稀释抗体，然后4。C孵育过夜；7)TBST漂洗三次，每次10min；8)二抗孵育：使用HRP标记的Goatanti—Rabbit二抗(Boster公司)或HRP标记的Goatanti．Mouse二抗(Boster公司)1：6000孵育相应的膜，摇床缓慢摇动，室温120min：9)TBST漂洗三次，每次10min；10)ECL检测，暗室曝光10sec至10min，立即以KODAK显影液和定影液，冲洗胶片；11)结果以培清凝胶成像分析系统拍照分析；(八)统计学处理所得数据以均数4-标准差(Mean4-SD)表示，采用统计学软件SPSS13．0进行分析，MTT实验结果采用重复测量的方差分析进行比较，克隆形成、软琼脂、BrdU等实验结果中的两组均数比较用t检验(t．test)；两组率的比较采用卡方检验。比较采用双尾检验，P>0．05表示无统计学差异，P<0．05表示差异具有统计学意义。 1、MTT实验检测细胞增殖情况转染miR·125a‘mimic组Hep2细胞与对照组相比，活细胞数量明显降低，对各个时间点的吸光度值进行比较，结果表明两组之间差异有统计学意义(P<0．001)，增殖能力受到抑制；转染miR一125a—inhibitor组Hep2细胞与对照组比较，活细胞数量明显增加，两组之间差异有统计学意义(P<0．001)，增殖能力得到增强，见图3—1，表3-2，表3-3。A135Time(dIR一121囤：王7l357Time(dJN3—1MTTG@结果。AN：喉癌细胞Hep2．转染miR．125a后增殖能力受到抑制；B图：喉癌细胞H印2转染f11iR．125a。inhibitor后增殖能力增强。Fig‘3—1Results。fMTTassaYs．A：Upregulati。n。fmiR一125asuppressedcellgrowtb。fhuIllanepidermoidcarcinolnacelllines。fHep2．B：Inhibiti。n。fmiR一125apr。m。tescell黟。wmofhumanepidermoidcarcinomacelllineofHep2．矗s，n=3．52r_|876543210∞3一∞>《o>；∞一山芷o：一仃>《0，、；巾一山芷 硕士学位论文表3．2miR一125a—mimic的MTT实验中重复测量各时间点OD值的方差分析结果Tab．3-2RepetitivemeasurementandanalysisofvarianceinMTTassaysofmiR一125a—mimic．表3—3miR一125a—inhibitor的MTT实验中重复测量的方差分析结果Tab．3-3RepetitivemeasurementandanalysisofvarianceinMTTassaysofmiR-125a—inhibitor2、克隆形成实验结果细胞克隆形成实验结果显示：转染miR一125a—mimics组Hep2细胞克隆形成数显著低于NC组(P<0．001)；而转染miR．125a-inhibitor组的克隆形成数显著高于NC组(P