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学校代号10199学号20134118064硕士学位论文冠心病中医证候与伏邪发病机制的流行病学调查及代谢组学研究Thepathogenesisofcoronarysyndromesandfuevilepidemiologicalinvestigationandmetabonomicsstudies学位申请人陈浩导师姓名职称邓悦教授专业名称中医内科学研究方向心病培养方式全日制申请学位类型专业学位论文提交日期2016年3月 密级分类号ＵＤＣ编号学位论文濟＇。病中医征候与伙邪发病机制的流行病学调查及代谢组学研究炼浩）指导教师姓名：邓悦教授（长春中医药大学附属医院申请学位级别；硕±专业名称：中医内科学研究方向：心病论文提交日期：２０１６年３月论文答辩日期；２０１６年６月学位授予单位：长春中医药大学－—一－／提交确认：作者签名巧导师签名： 长春中医药大学学位论文原创性声巧本人銳宝声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加Ｗ注巧引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出至要贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标巧并致谢。本人完全意识到本靑明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名接年月。日＾关于学位论义成果归属权的声巧本人巧重寅明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下自选课题或导师承担的国家立项资助一的计划课题的部分，系本人在导师指导和资助下独立进巧研究工作所取得的成果，归属权为长春一切法律责任宙本人承担中医巧大学和本人导师所有。特此再巧，本齊明的。／论义作者签名＞Ａｖ指导教师签名年月日＾／之关于学位论文使巧授权的声明本人完全了解长春中医药大学有关保留使巧学位论文的规定，同惠学校保留并向中国科学技术值患硏究所及中国学术巧刊（化盘Ｉ及）电子無志社送交论文的复巧件和电子版，允许被查閒和借阅。本人授权长春中医药大学可ｔ义将本学位论文的全部或部分内容编乂＜中国学位论文全文巧据库》及（中国优巧簿硕古学位论文全文巧巧库》进行检索，可采巧影印、縮印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密盾应遵守此规定）论文作者签名指导教师签名月如／／三曰 长春中医药大学2016届硕士学位论文目录目录中文摘要····························································································································1英文摘要····························································································································2英文缩略语························································································································4前言····························································································································5文献综述····························································································································6综述1冠心病中医证候与伏邪的研究进展·····································································61.冠心病中医病名的探讨·································································································62.冠心病病因病机的探讨·································································································73.冠心病中医证候的研究现状·························································································84.伏邪································································································································115.伏邪理论对冠心病治疗的启发·····················································································13综述2代谢组学在中医药方面的研究············································································141.代谢组学的简介············································································································142.代谢组学的研究方法·····································································································143.代谢组学与中药研究的相关性·····················································································174.代谢组学与中医证候研究的相关性·············································································18冠心病中医证候流行病学调查研究·················································································211.研究目标························································································································212.研究内容························································································································213.研究资料························································································································214.研究方法························································································································215.研究结果························································································································246.讨论································································································································29冠心病中医证候代谢组学比较研究·················································································31（一）健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组尿液代谢的研究···································311.病例来源························································································································312.诊断标准························································································································313.研究对象························································································································31 长春中医药大学2016届硕士学位论文目录4.样品取材与预处理·········································································································315.实验器材及条件············································································································316.检测前样品的准备·········································································································317.数据采集························································································································328.数据分析························································································································329.讨论································································································································38（二）健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组血清代谢的研究···································401.病例来源························································································································402.诊断标准························································································································403.研究对象························································································································404.样品取材与预处理·········································································································405.实验器材及条件············································································································406.检测前样品的准备·········································································································407.数据采集························································································································408.数据分析························································································································419.讨论································································································································45结论····································································································································47致谢····························································································································49参考文献····························································································································50 长春中医药大学2016届硕士学位论文中文摘要中文摘要目的：本研究是通过对冠心病患者临床资料进行调查与分析，把握冠心病中医证候特征规律,利用代谢组学技术探测中医证候中潜在的生物标志物，对潜在的生物标志物进行代谢通路分析，探讨证候、伏邪、潜在的生物标志物之间的关系，为冠心病患者的预防和治疗提供参考依据。方法：1、冠心病心绞痛患者的流行病学调查：运用流行病学调查中的前瞻性研究，采取直接观察法，搜集冠心病心绞痛患者的四诊信息，填写证候调查表，建立数据库，利用描述性统计方法探讨冠心病心绞痛患者的证候分布规律；2、冠心病心绞痛患者的尿液及血清的代谢组学研究：采集证候谱排名在前的患者的尿液及血清，利用代谢组学中的液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术采集数据，通过主成分分析（PCA）和正交信号校正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析数据，研究不同中医证候之间的尿液及血清的代谢物谱差异。结果：通过流行病学调查和代谢组学技术的相结合，气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证是冠心病心绞痛的主要证型；对健康组、气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证患者尿液和血清进行代谢组学分析，三组可以明显区分开来，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组中的生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸低于健康组，并且检测到天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸可能为气虚血瘀证型的潜在特异性标志物；马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯可能为痰浊证型的潜在生物标志物。关键词：冠心病心绞痛中医证候伏邪代谢组学液相色谱-质谱联用气虚血瘀证气虚血瘀痰浊证1 长春中医药大学2016届硕士学位论文英文摘要ABSTRACTPurpose:Thisstudyaretoinvestigatetheclinicaldataofpatientswithcoronaryarterydiseasethroughtheanalysis,graspthelawofTCMsyndromecharacteristicsofcoronaryarterydisease,usingmetabonomicstechnologytodetectpotentialbiomarkersinTCMsyndrome,metabolicpathwayanalysisofpotentialbiomarkerstoexploresyndrome,fuevil,therelationshipbetweenthepotentialbiomarkers,provideareferenceforthepreventionandtreatmentinpatientswithcoronaryheartdisease(CHD).Methods:1.Epidemiologicalinvestigationinpatientswithcoronaryheartdiseaseangina:usingepidemiologicalinvestigationintheprospectivestudy,takedirectobservationmethod,tocollectfourdiagnosticinformation,inpatientswithcoronaryheartdiseaseanginasyndromequestionnairefilledout,setupthedatabase,usingthemethodofdescriptivestatisticsonpatientswithcoronaryheartdiseaseanginapectorissyndromesdistributionrule;2.Urineandseruminpatientswithcoronaryheartdiseaseanginaofmetabonomicsresearch:collectsyndromespectrumrankedinthetopofthepatient'surineandserum,theuseofmetabonomicsliquidchromatography-massspectrometry(LC-MS)technologytocollectdata,throughtheprincipalcomponentanalysis(PCA)andorthogonalsignalcorrectionpartialleastsquaresdiscriminantanalysis(OPLS-DA)dataanalysis,researchbetweendifferentTCMsyndromeofurineandserummetabolitesspectraldifferences.Results:Throughtheepidemiologicalinvestigationandmetabonomicstechnologycombination,deficiencyofqideficiencyandbloodstasisphlegmturbiditysyndromeofbloodstasissyndromeisthemainsyndrometypeofcoronaryheartdiseaseanginapectoris.Todeficiencyofqideficiencyandbloodstasisphlegmturbiditysyndromeofbloodstasis2 长春中医药大学2016届硕士学位论文英文摘要syndromeinpatientswithurineandserummetabolomics,Aspartyl-Methioninedetectedand3-Sulfinylpyruvicacidmaybepotentialtumor-specificmarkersofqideficiencybloodstasistype；hippuricacid、glucosamine,fructosamine、triglyceridemaybepotentialtumor-specificmarkersofphlegmturbiditysyndrometype.Keywords:Coronaryheartdisease,TCMsyndrome,Fuevil,Metabonomics,Liquidchromatography-massspect,Qideficiencyandbloodstasissyndrome,Qideficiencyandbloodstasisphlegmturbiditysyndrome3 长春中医药大学2016届硕士学位论文英文缩略语英文缩略语英文缩写英文全称中文名词CHDCoronaryheartdisease冠心病NMRNuclearmagneticresonance核磁共振GC-MSGaschromatography-mass气相色谱-质谱联用spectrometryPCAPrincipalcomponentanalysis主成分分析OPLS-DAOrthogonalsignalcorrection正交信号校正偏最小二partialleastsquaresdiscriminant乘判别分析analysisUPLC-MSUltraperformanceliquid超高效液相色谱-质谱chromatographymassspectrometryLS-MSLiquidchromatography-massspect液相色谱-质谱联用4 长春中医药大学2016届硕士学位论文前言前言冠心病是严重威胁人类健康的疾病，它具有病情重，病位深，病程长，且多反复发作、正气多虚、脏腑多损等特点。人们意识到，如果能在器质性疾病形成之前及早的预防，或是延缓病情的发生发展，将会有效的降低冠心病乃至心血管事件链的死亡率。进入二十一世纪以来，现代医家秉承古人“未病先防，已病防变”的思想，对冠心病的防治进行了深入的探索和研究。学者们在“治未病”的思想上提出了“伏邪”，如任继学教授在《伏邪探微》中就提出许多疾病的发生发展都与伏邪相关。如果在冠心病中医证候形成的过程中抓住主要病因病机，即明确冠心病发生的伏邪致病规律，就可以在“伏邪”伏而未发之时给予一定的干预，可以有效的减少冠心病的发生率及病死率。本研究通过对冠心病患者临床资料进行调查与分析，把握冠心病中医证候特征规律,提炼伏邪的致病特点，再通过代谢组学技术得到相应证候的潜在生物标志物，为中医辨证提供一定的量化标准，有助于我们从预防、临床分型判断、临床治疗、改善预后等诸多方面起到科学的指导意义，从而提高患者的生存质量。5 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述文献综述综述1冠心病中医证候与伏邪的研究进展1.冠心病中医病名的探讨冠心病一词在古代文献中，被赋予了很多相类似的病名描述，每个时期都有其特定的临床意义，如心痛、真心痛、厥心痛、心痹、胸痹等不同的病名，根据症状或是病名的描述，都为现代医学对冠心病的深入研究奠定的基础。“心痛”一词最早出现于古代公元前11世纪的《山海经》中，《山海经·西[1]山经》曰:“……状如乌韭，而生于石上，亦缘木而生，食之已心痛。”这大概是最早出现的“心痛”一词。约成书于秦汉时期的《黄帝内经》中多篇提到“心痛”，但并未对其作详细表述。《素问·标本病传论》以及《灵枢·五邪》[2][3]中分别记载“心病先心痛”、“邪在心，则病心痛喜悲”。宋代的《圣济总录》在《金匾要略》、《肘后备急方》、《诸病源候论》上的基础上，对“心痛”作了较为详细的记载，根据病情发展速度把“心痛”分为“卒心痛”和“久心痛”；根据心痛的原因又分为九种:“曰虫，曰注，曰风，曰悸，曰食，曰饮，曰冷，[4]曰热，曰去来者是也”。“真心痛”和“厥心痛”则在《灵枢·厥病》有所记载。“真心痛，手足青至节，心痛甚”，“厥心痛……痛如以锥针刺其心”。之后的《难经》对其病因病机做了最早的概括，“其五脏气相干，名厥心痛；其痛甚，但在心，手足青者，[5]即名真心痛。其真心痛者，旦发夕死，夕发旦死”。“心痹”在《诸病源候论》中则形容是成心胸满闷而痛，“思虑烦多则损心，心虚故邪乘之。邪积而不去，则时害饮食，心里愊愊如满，蕴蕴而痛，是谓之心[6]痹”。《灵枢·本脏》曰:“肺小则少饮，不病喘喝；肺大则多饮，善病胸痹、喉痹、逆气”。这里“胸痹”一词的出现，并没有明确的定义，它包括了胸部、肺部等疾患。汉代张仲景《金贵要略》对胸痹展开了详细的论述，丰富了这一病名的含义。出自《胸痹心痛短气病脉证治》中“阳微阴弦，即胸痹而痛……责其极虚也……所以胸痹心痛者，以其阴弦故也”；“胸痹之病，喘息咳唾，胸背痛，[7]短气，寸口脉沉而迟，关上小紧数”；“心痛彻背，背痛彻心”。从这些论述6 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述中可以看出，已经与冠心病很相似，并且对冠心病的症状做了形象的描述。同样在《诸病源候论》中“胸痹”也有详细的描述，“寒气客于五脏六腑，因虚而发，上冲胸间，则胸痹。胸痹之候，胸中愊愊如满，噎塞不利，习习如痒……甚者，心里强否急痛，肌肉苦痹，绞急如刺……手不能犯，胸满短气，咳唾引痛，烦闷，[8]自汗出，或彻背膂”。2.冠心病病因病机的探讨2.1古代医家对冠心病病因病机的认识2.1.1外感六淫外感六淫邪气，尤其是寒邪，都可诱发冠心病。《脉经》中就强调了寒邪的重要性:“厥心痛者，乃寒气客于心包络也”，《诸病源候论》也同样认为寒气客于五脏六腑，因虚而发，上冲胸间，就会发为胸痹。《素问·至真要大论》提出“经脉流行不止，环周不体。寒气入经而稽迟，泣而不行，客于脉外则血少，客于脉中而气不通，故卒然而痛”。这些都说明外界寒邪会使血液运行受阻，不通则痛，体现冠心病与气候的变化密切相关。2.1.2情志失调从明朝龚倍的《古今医鉴》中就可以看到“顽痰死血，恼怒气滞”的病因。《诸病源候论》中“思虑烦多则损心，心虚故邪乘之”。陈无择《三因极一病证方论·九痛叙论》中记载了三类病因，指出内因“皆脏气不平，喜怒忧郁”所致。七情的变化可导致气机逆乱，气滞不行，瘀血阻络，不通则痛，引发胸痹。2.1.3饮食失节“膏梁厚味”易损伤脾胃，聚湿生痰，阻塞血脉，或饱食伤气，气血无力运行阻塞血脉，皆可引发胸痹。《儒门事亲》中就有记载：“夫膏粱之人，起居闲逸，奉养过度，酒食所伤，胀闷痞满，酢心。”《济生方》中也指出“夫心痛之病……皆因外感六淫，内沮七情或饮啖生冷果食之类”。《症因脉治》、《寿世保元》也都有指出胸痹的原因是饮食不节，饥饱损伤、饮酒过度而致。2.1.4劳倦内伤，年迈体虚本病的病位虽然是心，但是也与其他脏腑功能息息相关。若过度劳累或是年老体弱，心肝脾肾气血阴阳虚弱，在一定条件下可累及心而引起胸痹心痛。《太平圣惠方》中就有明确的论述：“脏腑虚弱，肾气不足……上攻于心”。《景岳全书》则指出心痛的病因是由于心脾肝肾的气血虚弱，不仅明确了脏腑，而且定7 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述位于气血，“气血虚寒，不能营养心脾者，最多心腹痛证……乃有此病，或心脾肝肾气血本虚，而偶犯劳伤……亦有此证”。2.2现代医家对冠心病病因病机的认识现代学者在古人的基础上对冠心病的病因病机做了更深入的研究，也取得了相关的研究成果，总结出冠心病的病理因素主要和痰浊、血瘀、气滞、寒凝、正虚等相关，下面对各学者或研究团队对冠心病病因病机学说做简单的介绍。以陈可冀院士为代表的研究团队在20世纪70年代提出了“血瘀”学说，认为冠心病的基本病机为血脉瘀滞，并且贯穿于冠心病发生发展的始末。宏观上血瘀证的临床表现包括胸前区的刺痛、痛处不移，舌质紫暗，舌下脉络迂曲等，在微观上血瘀证的病理表还会有血小板聚集、脂质沉积、血管狭窄等。临床中一些患者既有血瘀之表现，又有形体肥胖、舌苔厚腻痰浊之象，冠心病病程较长，单纯的化痰或活血化瘀的效果不理想，由此，学者们根据此类冠心病的特点，提出[9]冠心病“痰瘀互结”的病机学说。如韩学杰等提出痰浊瘀血是冠心病的始动因素。实验研究也表明，痰瘀互结型冠心病不但具有脂质代谢紊乱，而且存在微循环障碍，痰瘀互结也可致血管内皮损伤，因此痰瘀同治是痰瘀互结型冠心病的重[10-11]要治则。随着进一步的研究，在“血瘀”的基础上，不但有痰瘀学说，还有气虚血瘀、[12]阳虚血瘀、气滞血瘀等观点。如宋崇顺等根据实验研究提出绝大多数的冠心病[13]患者都存有不同程度的气虚血瘀的舌、脉、症表现。解民提出冠心病的发生与情志因素相关，若肝气郁结不畅，气机不利，日久则会气滞血瘀。3.冠心病中医证候的研究现状3.1国家统一标准现代学者对冠心病中医症候的分析处于不断探索中。1980-2002年，冠心病中医症候分型就在不断完善和丰富。全国冠心病辨证论治研究座谈会在1980年进行冠心病中医辨证试行标准。主要分为本虚、标实两类：气虚、阴虚、阳虚证[14]型为本虚；痰浊气滞、痰浊血瘀、痰浊偏寒、痰浊偏热四个证型为标实。1987年的全国中医急症研究会重新修订胸痹心痛，诊疗规范分为气阴两虚、心阳不振、[15]心血亏损、痰浊闭塞、心血瘀阻、寒凝气滞6个证型。1990年在青岛会议上中国中西医结合学会心血管学会对冠心病再次重新分型，包括8个证型，分别为[16]气滞型、血瘀型、痰浊型、寒凝型、气虚型、阴虚型、阳虚型、阳脱型。19948 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述年卫生部颁布实施了《中药新药治疗胸痹心痛的临床研究指导原则》，冠心病中[17]医证型又以心血瘀阻、寒凝心脉、痰浊内阻、心气虚弱、心肾阴虚、心肾阳虚[18]为主。直到2002年《中药新药临床研究指导原则》将其分为8个证型，具体为气虚血瘀、心血瘀阻、气滞血瘀、痰阻心脉、阴寒凝滞、心肾阴虚、气阴两虚、[19]阳气虚衰。现在大家一直沿用的是新版《中医内科学》的分型，包括心血瘀阻、痰浊内阻、阴寒凝滞、气阴两虚、心肾阴虚、心肾阳虚。3.2现代学者对冠心病中医证型分布规律的研究[20]如吴氏等在对116例住院患者的证候进行调查分析后得出实证(68.94%)明显多于虚证，实证中以血瘀(36.2%)、痰浊(30.2%)最常见，虚证中气阴两虚相对多见；病程较短、年龄偏低者以实证为多，病程较长、年龄较高者以虚证为多；虚、实证与西医分类无关，虚、实二证的分布在稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、[21]心肌梗死3种类型间无明显差别。张琳等随机选择14210例病例进行中医证候特点分析后得出结论，明确诊断为冠心病的为5599例，其中血瘀证3037例(54.24%)、气虚证2687例(47.99%)、痰浊证1564例(27.93%)、阴虚证1263例(22.56%)、气滞证1009例(18.02%)、阳虚证611例（10.91%)、寒凝证429例[21](7.66%)、热蕴证202例(3.61%)。王阶等收集了1069例经冠脉造影确诊的冠心病患者，对其常见的69个症状运用因子分析统计方法提取公因子进行统计分析，结果显示气虚血瘀证占33%最常见，依次为气虚痰浊22%，气阴两虚17%，[22]心肾阳虚11%，气滞血瘀11%，心脾两虚6%。郭氏在对1985--1996年国内公开报道的各类学术刊物上的2432例冠心病心绞痛(据不完全统计)进行了统计分析,将证候分为心血瘀阻、气阴两虚、寒凝心脉、痰浊闭塞、气滞心胸、心阳不振、心阳暴脱、心血亏损和其它少见证型共9种临床分型，总结了证候分型中以[23]心血瘀阻型最多，占总病例的31%。张氏等在对1989---2004年公开发表于国内各学术斯刊上的425篇学术论文的18698例病例进行了分析，总结出常见的主要证型，发作期以实证表现突出，实邪主要为血瘀、寒凝、痰浊、气滞4类，血瘀是本病的主要实邪；虚证之中以心气亏虚证最多。3.3冠心病中医证型的客观化研究我们现代学者一直致力于冠心病中医证型的客观化研究，从20世纪70年代到现在，也取得了硕果。冠心病危险因素如血糖血脂、血液流变学、心电图、心功能、冠脉CTA等诸多客观指标均丰富了冠心病中医证型的研究进展。9 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述冠心病危险因素中血脂、血糖在中医辨证分型中就存在明显差异：如鲍氏等[24]对54例冠心病患者做血脂的历年回顾性研究，发现了血脂与证型之间密切的关系，认为胆固醇升高以阳虚及阴阳两虚为主，阳虚与阴阳两虚之间无差异，而[25]阳虚型胆固醇显著高于阴虚型。王洪泉对200例冠心病患者也进行了血脂的检测，痰浊壅塞型患者血脂变化更大，其余两型（心血瘀阻型和气阴两虚型）之[26]间无统计学差异。同样，蔡氏等对166例不同证型冠心病患者的血脂检测发现:痰浊内阻型冠心病患者血清TG、TC、LDL-C明显增高,认为胆固醇及甘油三脂是[27]半液体状脂质混合物，即我们祖国医学所称的“痰浊”。毛氏等对50例冠心病患者及20名健康者检测了空腹血糖、胰岛素浓度和胰岛素抗体、胰岛细胞抗体和谷氨酸脱竣酶，研究发现:CHD组空腹血糖、胰岛素浓度高于健康组，胰岛素敏感性就低于健康组；胰岛素抗体阳性率高于健康组；心血瘀阻和痰浊壅塞两型的胰岛素敏感性指数低于健康组和气阴两虚型，胰岛素抗体阳性率就高于健康组和气阴两虚型。除了血脂血糖等危险因素，部分学者在血液流变学与中医证候方面也做了大量研究。将血液流变学检测运用于临床，可以从微观上帮助指导临床诊疗。陈氏[28]对96例冠心病患者血液流变学指标研究发现:冠心病中医实证患者的血液呈一定的粘聚状态，心血瘀阻证患者的血液流变学的变化明显大于较痰浊壅塞证和[29]阴寒凝滞。周中山通过血液流变学检测发现在97例冠心病心绞痛的患者中，红细胞压积增高的证型有心血瘀阻、气阴两虚和心肾阴虚；其中心血瘀阻型的血液是高凝状态。[30]在心电图方面，赵亚莉发现冠心病心血瘀阻型患者的心电图阳性率达到[31]63.24%；尹承娥等采用动态心电图技术分析冠心病心绞痛患者，发现冠心病心绞痛患者的自主神经功能存在紊乱的状态，如交感与迷走神经平衡失调主要存在于气滞血瘀证型中；迷走神经张力下降主要存在于血瘀证型中；迷走神经张力、交感神经活性以及交感与迷走神经的平衡关系等在不同的中医证型中存在着显著差异性。[31]在心功能和冠脉造影方面，林金忠等对冠心病属实证者观察发现其舒张末和收缩末室间隔厚度、左室后壁厚度，与正常对照组比较显著增厚，其中心血瘀阻证心功能减退程度较痰浊壅塞证和阴寒凝滞证更为严重P(<0.01)。从中推测[31]心室重塑可能与心血瘀阻证有关。而在冠脉造影方面，张敏州等对375例胸痹10 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述患者作冠状动脉造影，冠脉狭窄组的血瘀证和痰浊证均高于冠脉正常组，痰浊证的双支病变程度较无病变组严重，血瘀证和痰浊证的三支病变程度较无病变组严重，不同的证型可能代表不同的造影结果，由此推测，冠心病的危险证型是血瘀证和痰浊证。由此看来，冠心病的中医辨证分型现代研究虽已取得一定成果,但有些指标的特异性、针对性不强，对于证候的诊断、评价意义尚存有很大争议，需要我们做进一步的努力，对冠心病中医证型的客观化进行深入研究和探讨。4.伏邪4.1伏邪的概念人体的体质是在先天禀赋和后天获得的基础上形成的形态结构、生理功能和心理状态综合的、相对稳定的固有特质,即“阴平阳秘，精神乃治”的健康状态。阴阳调，正气足，方能抵御邪气。而当人体的脏腑功能失调，气血阴阳失衡，这种相对稳定的体质就会被破坏，正邪交争之时，人体的正气不足，不能清除体内的邪气，以致邪气留连，潜伏于人体正虚之处，伺机而发病，即“伏邪”。伏者，匿藏也。《中医大辞典中》记录“所谓伏邪者，指藏于体内而不立即发病的病邪”。4.2伏邪的分类现代医家对伏邪并无统一观点，但就其分类而言，伏邪可分为外感伏邪和杂[33]病伏邪。中医伏邪与外感疾病和内伤杂病有密切关系，伏邪既可外感六淫生成，[34]也可由机体不调生成，如伏痰、伏瘀。4.2.1外感伏邪早在《素问·阴阳应像象论》中就描述了四时之气侵袭人体后，伏而未发，过时才引发疾病：“冬伤于寒，春必温病；春伤于风，夏生飧泄；夏伤于暑，秋必截疟；秋伤于湿，冬生咳嗽。”王叔和在《伤寒论序例》中首次提出”冬伤于寒，春必温病”的病机:“冬令严寒……中而即病者，名为伤寒；不即病者，寒毒藏于肌肤，至春变为温病，至夏变为暑病，暑病者热极重于温也……”为伏气温病的形成奠定了基础。清·田云搓在《伏阴论》中指出了寒湿之邪发病的的部位、条件，如果春夏感受寒湿阴邪，伏于肺脾肾三经孙络，在人阴气内生的时候发病。4.2.2杂病伏邪杂病伏邪的来源方式有很多。如先天禀赋不足，男女媾精,伏邪内遗；后天11 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述失养,邪气未尽,匿伏体内，如脾失健运，伏痰内生，气机运行不畅，影响气血津液的输布，易致伏痰伏瘀。如朱丹溪在《脉因证治》中说:“夫郁愤而不伸，则肝气乘脾之气而不流，亦为留饮……脾主思，久则脾结，亦为留饮……”。疾病治疗后期，驱邪未尽，余邪存在体内，伺机而发而致病。清·沈源在《奇症汇》中所载的胎瘤，为父母“肾中伏火，精气必有红丝，以气相传，故生子有此疾”，说明在父母体内的伏邪也可遗传给子代，胎瘤源于父母肾中伏火，对于子女的胎瘤而言就是伏邪。外感伏邪和杂病伏邪的来源不同，外感伏邪主要是邪自外入，杂病伏邪是邪由内生、秉承于父母或是失治误治导致邪气未尽等。伏邪久病入络，具有病程长的特点，在暗耗正气的基础上，易成痰成瘀，加深伏邪的毒性，使正虚不能抵御[35]邪气，加重了疾病的难治性。4.3伏邪的特征[36]4.3.1动态时空动态时空是指随着时间的改变，随着机体内外环境之改变，伏邪有可能发生由此至彼的改变，伏邪的位置可能由浅入深或是由深入浅的改变。4.3.2隐匿特征侵犯人体的邪气在其入侵时没有被察觉，待其潜伏后发生了种种变化却从知晓，最终发病，而病人尚不知缘何发病。《灵枢·贼风》就有记载伏邪看不到。听不到。闻不到。无论是医生还是患者都不会通过感官发现伏邪存在人体的内外环境，伏邪既看不到，摸不到，用实证的办法不能证明伏邪的存在，只能依据经验进行推理和判断，从结果去推导病因来证明伏邪的存在。依据的经验有疾病的发生发展，或根据个人史、既往史或是现病史等临床资料，从而论证在发病前的时间段是有伏邪侵入，所以伏邪具有隐匿性。4.3.3自我积聚性伏邪的自我积聚性是指，当没有正气与邪气抗争时，邪气会直接损害人体，而不会自动减少。当伏邪累计到一定程度时，超过人体所能承受的程度，就会引发病。伏邪潜藏和损害的部位可以由小到大，由少到多。根据伏邪的隐匿特性，伏邪潜伏部位相对在内不在外，其发病往往会从内向外而发。4.3.4潜证向导12 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述潜证导向是指伏邪具有导致机体呈现潜证状态的特征。潜证阶段没有症状、[37]体征表现，或仅有一些孤立的、次要的症状，或某些微观指标异常。所以，潜证是对致病因素作用于机体后，机体发病前这一阶段生理反应状态的概括，属于[38]中医学证候范畴。伏邪的四个特征相互依赖、不可分割，“隐匿”为最基本的特征，是导致临床资料难以收集的根本原因。“潜证导向”也是由伏邪隐匿的特征发展而来。“动态时空”“自我积聚”是伏邪在“隐匿”特征基础上的动态变化过程。5.伏邪理论对冠心病治疗的启发伏邪是机体感受邪气后而不立即发病，潜藏在人体内遇到诱因引诱而发病的一类邪气。临床中很多冠心病的患者并有明显的症状，但是冠状动脉硬化等正邪[39]相争却是客观存在的，这些都符合伏邪发病的特点。在临床治疗中，利用中医的辩证思维如果在冠心病症状中抓住病机实质，并在伏邪伏而未发时，采取有效措施，调动机体自身的潜在功能，驱除伏邪，就会及时干预冠心病的发生发展。[40]如邓悦等认为伏邪（伏痰、伏瘀）自始至终存在冠心病乃至心血管事件链中，并且运用益气活血、化痰通络的治疗原则，进行随证用药和早期干预，临床中取得了很好的疗效。因此在冠心病的治疗中，把握伏邪的致病特点，如伏痰、伏瘀的病理转归，将对冠心病的临床治疗、早期防治具有重要的指导意义。13 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述综述2代谢组学在中医药方面的研究1代谢组学的简介代谢组学这一概念是Nicholson等人在以核磁共振(NMR)技术为基础的药物[41]毒性评价体系建立的系统工作中首次提出的。代谢组学作为新兴起的一门学科，它的核心思想是对生物体特定生理时期内所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析。正常状态下，机体中代谢物的组成处于一种动态平衡。代谢组学就是通过考察生物体系在受到外界刺激后对其体液（血液、尿液、淋巴液、唾液等）及组织代谢产物的组成变化或其随时间的变化来研究生物体系代谢途径的一种新方法。根据研究对象及目的Fiehn将代谢组学分为四类（1）代谢物靶标分析(metabolitetargetanalysis)，即对某个或某几个特定的代谢物进行分析，这种分析通常需要对样品进行一定的预处理，以减少其它物质的干扰，从而提高灵敏度；（2）代谢轮廓分析(metabolicprofilinganalysis)，即对所预设的某些结构类似、性质相关或处于某一代谢途径的代谢产物进行定量分析；（3）代谢组学(metabonomics)，即对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量分析，这种分析是当前研究最为广泛的，也是我们下面要重点介绍的；（4）代谢指纹分析(metabolicfingerprintinganalysis)，对样品进行快速分类而[42-43]不分离鉴定具体单一组分。2代谢组学的研究方法：完整的代谢组学流程包括（1）样品的采集与预处理；（2）代谢物分析-数据的采集；（3）数据处理与分析；（4）对生物标志物的解释与应用。可用做代谢组学的样品如血液、尿液、淋巴液、唾液等，根据需要进行预处理，再进行数据的采集和数据分析，下面主要介绍数据的采集和分析方法。2.1数据采集代谢组学常用的数据采集方法有核磁共振(NMR)和质谱联用(MS)，每一种检测方法都有各自的优势及局限性，NMR可以准确的定性并且对微摩尔级别的有机物进行定量分析，它对样品没有破坏性，样品可以进行下一步分析。同MS相比，较低的灵敏度是NMR最大的缺点，不适合分析样品中含量较低的代谢物。MS具14 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述有较高灵敏度、较广适用范围和可实现定量分析的特点，与分离技术联用后，特别适合分析生物复杂样品。随着质量精度的提高，增加了代谢物结构鉴定的准确性。但由于NMR可以得到大量的结构信息以及其不破坏样品的特性，NMR在代谢组学研究中得到了广泛的应用。使用NMR进行数据采集时每个样品仅需几分钟，[44]这要远远优于GC-MS和LC-MS。2.1.1核磁共振(NMR)NMR作为代谢组学中的一种分析技术，它是Nicholson等在长期研究生物体液的基础上提出的。NMR技术可以深入物质内部而不破坏样品，具有迅速、准确、[45]分辨率高等优点。NMR方法具有无损伤性，不会破坏样品的结构和性质，可在接近生理条件下进行实验，可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，具有良好的客观性和重现性；可以进行实时和动态的检测；也可设计多种编辑手段，实验方法灵活多样。NMR的技术被广泛应用于临床医学中。如李林等[I9]利用氢核磁共振的分析方法，发现了气虚血瘀证大鼠和正常大鼠的尿液存在差异性改变，这些差异性的代谢物有肌氨酸酐、a-酮戊二酸、柠檬酸、牛磺酸、氧化三甲胺、琥珀酸、马尿酸等，为揭示气虚血瘀证的发生机制和病证治疗提供了新思路[46]。但是与质谱相比，NMR的灵敏度相对较低，动态范围有限，很难测定浓度差异大的代谢物。2.1.2液相色谱-质谱联用(LC-MS)液质联用(LC-MS)虽然起步较晚，但目前也被广泛地应用疾病诊断、中医药机理等方面。液相色谱技术强大的分离能力和高灵敏度使人们认识到它也可以用于生物体液指纹谱。LC-MS技术经济实用，适用于那些热不稳定，不易挥发、不易衍生化和分子量较大的物质。目前，寻找与疾病相关的生物标记物成为代谢组学研究中的热门领域，它主要是通过对待测样品与对照样品的液质连用分析，从得到的色谱图和质谱图中提取数据，再应用一系列的数据处理手段，使大量复杂的数据简单化，样品之间的的差异就可以从图谱上体现出来。这种被简化后的数据所呈现出的谱图很容易就能观察到样品之问的差异。LC-MS的分析对象主要为尿液、血清、或是血浆，目前很多学者都通过检测体液来获取更多的临床信息，[47]如于晓红等利用LC-MS技术，研究养心汤对不稳定型心绞痛患者的血浆代谢组学研究的影响，发现UA的潜在性标志物为神经酞胺、甘氨胆酸、别胆酸、石胆酸、白三烯B4。15 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述2.1.3气相色谱-质谱联用(GC-MS)GC-MS是被公认的最宝贵的分析手段，它可以同时检测出几百个化学性质不同的化合物，例如有机酸、各种氨基酸、糖、芳胺和脂肪酸等。尤其是最近发展起来的二维GC(GC×GC)MS技术，它的优势为分辨率高、峰容量大、灵敏度高及分析时问短等，备受代谢组学研究者的青睐。另外，GC-MS另一大优势是有大量可检索的质潜谱库。但是GC能对其中的挥发性组分实现直接分析，而难挥发的大多数代谢组分的信息却很难得到。2.1.4毛细血管电泳与质谱联用(CE-MS)CE-MS主要适用于极性或带电荷的代谢物的分析，CE主要根据代谢物的大小和所带电荷进行分离。CE-MS最大的有点在于它的分析时间短以及所需的样品量极少仅需1-20nL样品。CE-MS通常可以分析无机离子、有机酸、氨基酸、核苷酸、核苷、维生素、硫醇、碳水化合物以及肽。2.2数据分析通过以上介绍的分析手段，对体液或组织中的代谢产物进行分析后，得到了大量的、多维的分析数据，将数据中潜在的信息与生物学特性相关联，进而解释生物标志物，这就是代谢组学最终目的。因此，在代谢组学数据分析中会应用到一系列的分析方法，包括主成分分析（PCA）、正交信号校正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等，设计和选择适宜的分析方法，将会获得最大限度的信息，下面对代谢组学中常用的数据分析方法做简单探讨。不管使用哪种测定方法，都可以得到许多内源性的定量、定性分析，这些信息在输出的图谱上表现为许多信号峰，在色谱质谱图上表现为不同保留时间出现的色谱峰，在核磁共振谱图上表现为不同化学移位出现的色谱峰，其定性信息就是该化合物的特征谱图和色谱保留时间，是化合物鉴定的基础；其定量信息就是该化合物的色谱响应强度，如峰高、峰面积，是定量比较不同样品或组别之间差[48]异的基础。2.2.1主成分分析（PCA）[49]主成分分析是一种基于投影技术的数据分析方法。每分析一个样品，都会出现大量的色谱峰（变量），这些原始数据产生的数学模型就无法直观的反映样品或组别之间的差异，这时需要用投影的方法进行降维处理。根据方差最大化原理找到一条直线使所有样品距离该直线的残差平方和最小，投影在此数轴方向上16 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述的矢量平方和最大，该直线体现了样品间的最大差异，由此得到第一个主成分，沿着第一个主成分的垂直方向找到第二个主成分，主成分所在的直线都是正交。反复通过此方式，最终得到只有几个主成分的数学模型，使数据易于理解和展示。经过投影方式得到第一个主成分后，计算各个样品在各个主成分上的得分，最终得到得分图，得分图可以观察到样品的分类或变化趋势，距离点相近性质相似。同样，载荷图中的样品分布和位置与得分图一样，它反映了变量或组别之间的差[49]异性。主成分分析方法广泛应用于中医药的现代研究中。很多学者利用主成分分析[50]方法研究患者体液中的小分子代谢产物，如王广基等通过研究冠心病不同证型患者血浆中小分子化合物，提示这些小分子代谢物可能就是区分不同证型的物质基础。[51]朱明丹等对冠心病不同证型的患者的血浆进行代谢组学研究，同样采用了PCA方法，探讨一些小分析代谢物如葡萄糖、花生四烯酸、亚油酸、苯丙氨酸、磷酸肌酸等与能量代谢、脂质代谢、糖代谢紊乱密切相关。2.2.2.正交信号校正偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）OPLS-DA是判别分析中最常用的一种数据分析处理方法，它在偏最小二乘判别分析（PLS-DA）上进行了改进，它是通过PLS对样本进行降维处理后，再利用[52]传统的判别方式对样本进行统计分析。作为一种新型的数据统计方法，它的主体思想是把X变量分成两部分，一部分是与Y变量线性相关的，另一部分是与Y变量正交的，然后从X变量中剔除与Y变量正交的部分。在进行OPLS-DA分析之前，要先除去明显的异常值，因为异常值可能导致校正后数据偏离X变量。它可以把[53]组间差异和组内差异分开。PLS-DA就会有局限性.。2.3代谢组学与中药研究的相关性中药或是中药复方含有复杂的成分，想要完全阐明中药及其复方内的组成成分基木不可能，而代谢组学具有终点放大的功能，通过分析各种体液的代谢产物，找出特异性的标志物，再利用生物信息去分析这些标准物，从而解释中药的治疗[54]机制。Gu等通过超高效液相色谱质谱（UPLC/Q-TOFMS）技术对应用黄连素治疗的2型糖尿病患者的血清进行了代谢组学研究，发现服用黄连素后有13中脂肪酸的浓度在患者血清中显著降低。[55]Xiang等研究麝香保心丸的治疗机制，通过对心肌梗塞大鼠的血清代谢组17 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述学，发现氧化损伤、氨基酸代谢、能量代谢和炎症与心肌梗塞的发病机制相关，证明了麝香保心丸在氧化损伤、能量代谢和炎症的调节方面有很好的治疗效果。[56]毕建璐在补中益气丸干预气虚质的临床观察及其血浆代谢组学机制研究中发现补中益气丸可以改善代谢紊乱的现象。平和体质中的异亮氨酸、谷氨酞胺、甜菜碱、脯氨酸、丙氨酸、甘油酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸这9中代谢物表达较高，而补中益气丸干预后，这9中代谢物表达明显下降。2.4代谢组学与中医证候研究的相关性中医证候反映机体在某一时刻的宏观表现，而代谢组学则阐释了内在的微观变化，代谢组学更能揭示中医证候的本质。中医证候包括生理、病理、生物化学、分子、代谢等各方面特定的生物学基础。每一个证候都有其外候与内涵，外候就是通过四诊信息进行整理分析出的对疾病本质的判断，内涵也就是每个证候支持的生物学背景。[57]简维雄等采用GC-MS技术结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对健康人、冠心病心血瘀阻证型、冠心病非心血瘀阻证型的尿液进行代谢组学研究，发现心血瘀阻证型中的代谢物有葡萄糖、甘油、木糖醇、马尿酸、油酸酰胺、丙酮，这些物质反应了脂类代谢的紊乱，可能与肝肾脏腑的病变有一[58]定的相关性。同样，简维雄对三组也进行了血浆代谢物的检测，发现心血瘀组型患者的血浆代谢物有花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、柠檬酸、β－羟基丁酸、油酸、葡萄糖和丙氨酸，这些物质不但与糖脂类代谢相关，同时也反应了缺氧和剧痛的应激性。[59]华何与等研究了有关血瘀证的血浆代谢组学，他选取了气滞血瘀证、心血瘀阻证、气虚血瘀证各6例进行NMR检测，发现气虚血瘀证组与其他两组的代谢物存在显著差异，而气滞血瘀证和心血瘀阻证之间没有显著差异；并且检测到冠心病心绞痛患者血瘀证中存在以下代谢物：柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、3－羟基丁酸、谷氨酸、脯氨酸及亮氨酸、高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、苏氨酸、组氨酸。其中高密度脂蛋白、不饱和脂肪酸、苏氨酸、组氨酸含量则较低。这些小分子化合物对冠心病心绞痛的中医证候客观化研究提供了物质基础。[60]王广基等采用气相色谱-质谱联用的技术，对冠心病痰阻心脉证、气阴两虚证和健康人的血液做代谢组学研究。发现病理性两组患者的内源性代谢物有显18 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述著差异，这些显著差异和能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢相关；同时，利用偏最小二乘法判别分析法建立的两组数学模型也可以反应出体内小分子化合物的差异性，从而推测这些小分子化合物可能是中医辨证分型的物质基础。[61]朱萱萱等也对冠心病痰阻心脉证、气阴两虚证进行了血清代谢组学研究。但没有像王广基局限于两个证型的研究，朱萱萱还研究了气虚血瘀证和气滞血瘀证，同样采用气相色谱-质谱联用的方法，结合PLS-DA的分析方法，区分了男性患者中的气虚血瘀型和痰阻心脉型；女性患者中的气虚血瘀型、痰阻心脉型和气阴两虚型，这些组别的区分提示了代谢组学技术在揭示传统中医理论本质上有着广泛的应用前景。各学者不仅将代谢组学应用在冠心病中，同样对心力衰竭也做了小分子代谢[62]物的研究。王鹏军等选取缺血性心肌病的气虚血瘀证18例、阳虚水停证18例进行血浆LC－MS数据采集和PCA及PLS－DA数据分析，结果显示气虚血瘀证和阳虚水停证存在显著差异，两组血浆代谢物含量也存在明显差异。缺血性心力衰竭阳虚水停证较气虚血瘀证比较发现：3种溶血磷脂酰胆碱类物质含量降低，3种肉碱类物质含量升高，2种脂肪酸类物质含量升高，肌酐含量升高。这说明两组证型之间存在着不同的代谢模式，从而反映了两组能量代谢和磷脂代谢的差异性。这些小分子代谢物的差异性为我们在临床中对这两种证型的诊治提供了相应的依据。[63]郑海生等对心力衰竭患者中的肾阳虚证、非肾阳虚证和正常人的尿液进行了代谢组学的检测。他采用了气相色谱/质谱（GC/MS）联用的数据采集方法，通过主成分分析、正交偏最小二乘判别分析方法，将慢性心力衰竭肾阳虚证组、非肾阳虚证组和正常组的代谢成分积分在空间分布上明显区分，且样本均投影到2SD（标准差）的区域内，表示其值可信，说明所建模型能准确区分3者。研究表明柠檬酸、丙氨酸、3-甲基戊烯二酸、丙胺、组胺是两组证型中的差异性代谢物。随着系统生物医学思维模式的建立，现代医学的研究正由微观、实体的探索向宏观、系统的角度转变。陈竺院士指出:“中医强调整体论，西医则强调还原论，所以多年来许多学者认为两者格格不入，但事实证明，到了系统生物学时代，它们找到了共同语言。”可见，以整体观念和辨证论治为特点的中医学，其现代19 长春中医药大学2016届硕士学位论文文献综述研究融入当前系统生物学的学术内涵将是必然的趋势。代谢组学具有终点放大的特点它可以从网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平，与中医学的整体观念相近。因此，代谢组学技术的引进和利用为中医证候的客观化提供了崭新的平台。20 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究冠心病中医证候流行病学调查研究1.研究目标研究以中医逻辑思维模式为指导思想，采用流行病学横断面调查研究方法，观察冠心病心绞痛临床中医证候特征的分布规律，掌握伏邪在冠心病中的致病特点。2.研究内容通过对冠心病心绞痛进行前瞻性研究，按照纳入标准，对纳入患者进行横断面中医临床证候信息采集，填写冠心病心绞痛中医证候调查表，运用统计方法对所得调查资料进行统计学分析，明确中医证候的主要致病特点，总结“疾病-证候-伏邪”的相互关联。3.研究资料前瞻性研究病例：选取吉林省三家中医院2014年9月--2015年9月住院或门诊的冠心病心绞痛患者。4.研究方法4.1诊断标准4.1.1西医诊断标准：参照1979年国际心脏病学会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》以及2010年《稳定型冠心病诊治指南》制定冠心病心绞痛的诊断。①冠心病诊断标准a心电图出现动态ST-T改变或运动试验阳性b心肌核素扫描阳性c冠脉CT阳性（一支血管狭窄50%）d冠脉造影确诊e既往心肌梗死史具备1件项即可诊断②心绞痛诊断标准劳累性心绞痛：劳累性心绞痛的特征是由于运动或其他增加心肌需氧量的情况下所诱发的短暂胸痛发作，休息或含服硝酸甘油后，疼痛常可迅速消失。可分为三类：21 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究a.初发型劳累性心绞痛：病程在一个月以内。b.稳定型劳累性心绞痛：病情稳定在一个月以上。c.恶化型劳累性心绞痛:同等程度劳累所诱发的次数、严重程度及持续时间突然加重。自发性心绞痛：自发性心绞痛的特征是胸痛发作与心肌需氧量的增加无明显关系。d.静息性心绞痛：心绞痛发生在休息或安静状态下，发作时间相对长，含硝酸甘油效果欠佳，病程在１个月内。e.梗死后心绞痛：指心肌梗死发病后24小时至1个月内发生的心绞痛。f.变异性心绞痛：休息或一般活动时发生的心绞痛，发作时心电图显示ST段抬高。a、c、d、e、f为不稳定性心绞痛。4.1.2中医辨证分型标准参照中国中西医结合学会心血管学会1990年10月修订《冠心病中医辨证标准》气虚：指疲乏，气短，舌质淡胖或有齿痕，脉沉细。阴虚：指舌红少苔或无苔，或五心烦热，口干，脉细数。阳虚：指疲乏，气短，身寒，肢凉，舌淡胖或有齿痕，脉沉细或结。阳脱：四肢厥冷，大汗出，脉微欲绝，表情淡漠，面色恍白或暗淡，舌质黯淡。血瘀：胸痛，痛有定处，舌质紫暗，或有瘀点瘀斑。痰浊：胸脘痞满，苔厚腻，脉滑。偏寒：苔白厚腻。偏热：舌苔黄厚腻，或脉滑数。气滞：胸闷痛，憋气，苔薄。寒凝：胸痛甚，遇寒常发。4.1.3纳入标准(1)确诊为冠心病心绞痛的患者(2)符合冠心病中医辨证标准(3)意识清醒，能够配合采集临床资料者(4)年龄在40岁以上，,80岁以下22 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究(5)对调查知情并同意者。4.1.4排除标准(1)不符合上述诊断标准者(2)年龄在40岁以下，80岁以上(3)合并其它心脏疾病如甲亢性心脏病、心脏瓣膜病或合并严重肝肾功能不全、血液系统肿瘤内分泌疾患等(4)其它全身疾病者凡能增加死亡率的因素：如心源性休克、高度房室传导阻滞、严重室性心律失常、梗阻型心肌病、缩窄性心包炎、未修补的瓣膜病、心包填塞、肺栓塞、有明显感染者(5)拒绝合作或因患有精神疾患等无法合作者4.1.5剔除试验标准(1)凡不符合纳入标准，资料不全等影响中医证候诊断判断者(2)不应统计及无法统计的病例（如：误纳、误诊、全无检查测试记录者）4.2研究项目（1）人口学资料：包括姓名、年龄、性别、体重、身高、BMI等。（2）相关病史：糖尿病、高血压病、血脂异常等病史，既往史、个人史、家族史等。（3）一般体格检查：心率、心律、血压、呼吸等。（4）相关心血管危险因素：血糖、血脂、高血压、吸烟、饮酒等。（5）中医证候情况：包括主症及相关症状、全身症状、舌脉等。4.3临床实施4.3.1调查时间2014.9——2015.94.3.2调查地点长春中医药大学第一附属医院、吉林省中医药科学院第一临床医院、长春市中医院。4.3.3调查方式横断面研究设计方案4.3.3.1前瞻性研究（1）病例资料：观察600例明确确诊冠心病心绞痛患者。23 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究（2）病例来源：3家中医院住院及门诊病人中冠心病心绞痛患者。（3）调查方式：采取直接观察法，以医生对患者的诊察、访谈的方式，搜集冠心病心绞痛的中医证候及四诊等相关信息，同时24小时内填写临床调查表。4.4资料的分析和质量控制由于调查项目多，所用的数据量庞大，易出现各种差错，数据管理员需在数据录入前再次核查，发现问题及时与原始调查表相对照。数据管理员录入数据可采用二次录入。录入过程发现问题或意外情况，应做好登记并及时报告，以便迅速处理问题，数据录入结束后应抽查部分调查表，了解录入质量，分析并处理存在的问题，以保证数据的信度、效度。4.5统计分析方法通过双人双机录入的方法，将数据输入统计软件SPSS17.0中，建立数据库，运用描述分析和计算功能统计出各变量的频数及构成百分比。5.研究结果5.1患者人口统计学资料研究对象为2014年9月---2015年9月3家吉林省中医院住院及门诊病人中冠心病心绞痛患者。5.1.1患者年龄、性别构成比600例患者中，男性患者319人，女性患者281人，男、女比例约为1.1:1，患者中最大年龄为79岁，最小年龄为39岁。表1不同年龄段男女比例构成情况表年龄段男性女性总计（岁）频数百分比（%）频数百分比（%）频数百分比（%）39-50193.2142.3335.551-607712.86110.21382361-7010417.38113.518530.871-7911919.812520.824440.7总计31953.228146.8600100从上表可以看出，71-79岁年龄段所占比例最大，是冠心病心绞痛的好发人群，其中女24 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究性多于男性，女性所占比例20.8%，男性所占比例19.8%。5.1.2患者危险因素分布情况表2患者危险因素构成比危险因素频数百分比（％）年龄>50岁56794.7高血压病28146.8吸烟27245.3饮酒17429.0糖尿病15225.3急躁易怒14123.5血脂异常12520.8肥胖10918.2冠心病家族史8714.5从上表可以看出，各危险因素依次排序为：年龄因素>高血压病>吸烟>饮酒>糖尿病>急躁易怒>血脂异常>肥胖>冠心病家族史。5.2伏邪发病时各症状构成比本研究制订的横断面调查表涵盖了患者的一般信息、相关病史、中医临床四诊信息、疾病诊断、证候描述、家族史等观察指标共计126余项，其中涉及中医临床症状指标71项。对600例患者的主要症状进行描述性的统计分析，将构成比<3.0%的症状删除，现统计56个症状如下。表3伏邪发病时各症状构成比症状频数百分比（%）症状频数百分比（%）胸闷48681大便秘结12220.3气短乏力43873裂纹舌11419.0胸痛43071.7面色淡白11118.5少气懒言40868潮热10217.0舌暗红40467.3盗汗10217.025 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究苔白37061.7脉涩9916.5食少纳呆34357.2善太息9816.3苔腻34156.8心烦9415.7失眠多梦31352.2脉沉8914.8舌底青紫30250.3情志抑郁8714.7脉细28747.8面色淡暗8313.8口干口苦27946.5脉迟缓8313.8形体肥胖27245.3面色萎黄7813.0脉弦26544.2夜尿频7612.7口唇紫暗26143.5胁胀7612.7心悸24140.2口唇淡暗6911.5大便不爽22237皮肤粗糙6911.5舌胖齿痕19833小便清长6611.0苔黄18430.7舌有瘀斑6510.8脉滑18130.2脘痞569.3急躁易怒17929.8小便短赤538.8肢体困重17228.7遇寒加重538.8面色晦暗16928.2脉数498.2头晕16527.5渴不欲饮447.3舌淡暗15325.5恶心呕吐427.0苔少13322.2腰酸痛416.8自汗13121.8大便溏406.7形体瘦小12821.3脉结223.7通过对以上各证候排序，排名前二十的证候有：胸闷、气短乏力、胸痛、少气懒言、舌暗红、苔白、食少纳呆、苔腻、失眠多梦、舌底青、脉细、口干口苦、形体肥胖、脉弦、口唇紫暗、心悸、大便不爽、舌胖齿痕、苔黄。通过上表，结合中医专业知识，胸痹的主要症状为胸闷、胸痛，同时根据中医诊断学相关知识综合分析发现，其余出现频率较高的症状大致可分为三类：一26 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究类以少气懒言、气短乏力、心悸、失眠多梦、舌胖边有齿痕、脉细等气虚证为主；一类以形体肥胖、口干口苦、纳食减少、大便不爽、苔腻、苔黄或苔白、脉弦等痰浊证为主；一类以面色晦暗、唇色紫暗、舌暗红、舌底青紫、脉涩等血瘀症状为主。5.3冠心病心绞痛中医证型分布情况根据中国中西医结合学会心血管学会1990年10月修订的《冠心病中医辨证标准》以及《中医诊断学》、《中医内科学》制定临床病例观察表。将600例患者的证候要素、单一证型和复合证型进行描述性统计分析。5.3.1证候要素分布特征表4证候要素构成比证候要素频数百分比（%）气虚38764.5血瘀37562.5痰浊24941.5阴虚11318.8血虚599.8阳虚477.8水饮416.8热蕴345.7气滞284.7寒凝61.0通过以上证候要素分析，各证候要素分布依次为气虚、血瘀、痰浊、阴虚、血虚、阳虚、水饮、热蕴、气滞、寒凝。5.3.2各证型分布特征表5证型构成比组合类型组合形式频次频率（%）单因素心气不足315.227 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究痰浊闭阻183.0心血瘀阻142.3气滞心胸71.2寒凝心脉61.0心阳不振40.7心火亢盛20.3心阴亏虚20.3水饮内停10.2双因素证气虚血瘀8714.5痰瘀互结6210.3气血亏虚599.8气阴两虚396.5痰热内蕴325.3气滞血瘀213.5阳虚水停152.5阴阳两虚71.2阳虚血瘀40.7气阳两虚20.3阴虚血瘀20.3三因素证气虚血瘀痰浊9816.3气阴两虚血瘀233.8阳虚血瘀水停152.5气虚血瘀水停91.5阴虚血瘀水停10.2四因素证气阴两虚，痰瘀互结396.5气阴两虚，血瘀水停00.0通过对以上证候统计分析，从上表可以看出，单一证型中心气不足占首位，而双因素证型中气虚血瘀位居第一，三因素证型中气虚血瘀痰浊位居第一，四因素证型中气阴两虚，痰瘀互结位居第一。28 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究5.3.3单因素、多因素证型分布比例如下图：图1单因素、多因素柱状图由上图可以看出，临床中复合证型中双因素证型所占比例最大，其次为三因素证型。6讨论通过对患者的中医临床证候信息采集、填写冠心病心绞痛证候调查表、并建立数据库的方法，对患者的年龄、性别、病史、症状、临床分型、主要症状指标等相关资料进行描述性分析，将构成比小的删除，同时结合专家临床经验，分析并探讨冠心病心绞痛患者中医证候分布特点，得出结论：6.1冠心病心绞痛患者的好发年龄是71-79岁，其中女性多于男性；其次是61-70岁年龄段，男性多于女性；6.2冠心病心绞痛的危险因素主要有年龄因素、高血压病、吸烟、饮酒等，其中作为冠心病并发症的糖尿病也是危险因素之一，对于脾气暴躁以及血脂异常、体态肥胖的人群也要预防冠心病的发生发展；6.3对伏邪发病时各证候出现的频数进行统计，整体上分为三类证候群，一类以少气懒言、气短乏力、心悸、失眠多梦、舌胖边有齿痕、脉细等气虚证为主；一类以面色晦暗、唇色紫暗、舌暗红、舌底青紫、脉涩等血瘀症状为主，一类以形体肥胖、口干口苦、纳食减少、大便不爽、苔腻、苔黄或苔白、脉弦等痰浊证为主；29 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究6.4对证候要素进行统计后，发现气虚、血瘀、痰浊可能为主要的致病病理因素，这一点在证型分布情况中也有所体现，如双因素证型中气虚血瘀和痰瘀互结占据前两位，而三因素证型中气虚血瘀痰浊占据首位；由此，我们推测气虚、血瘀、痰浊可能为冠心病心绞痛发生发展的潜在的病理因素，可能也就是冠心病发生发展的潜在伏邪；6.5对单一证型和复合证型进行统计后，发现冠心病多数以复合证型出现，而复合证型中又以双因素和三因素最多，其中气虚血瘀在双因素中比例最大，气虚血瘀痰浊证型在三因素中比例最大，对双因素和三因素证型的频数进行对比后，发现气虚血瘀痰浊证型所占比例最大，也是冠心病心绞痛中所占比例最大的证型。30 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究冠心病中医证候代谢组学比较研究（一）健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组尿液代谢的研究1.病例来源观察病例为就诊于长春中医药大学附属医院心内科住院部的患者。所有患者都符合相应的中西医诊断标准和病例纳排标准。健康人为在长春中医药大学附属医院体检确定其身体健康的志愿者。2.诊断标准诊断标准、纳入标准及排除标准参照冠心病中医证候流行病学调查研究的纳排标准。3.研究对象选取健康人20例(A组)、气虚血瘀证患者16例(B组)、气虚血瘀痰浊证患者(C组)15例患者的尿液进行代谢组学检测。4.样品取材与预处理受试者取清晨空腹尿液10ml，3000r/min离心10min后,取上清分装至-80℃冰箱保存；健康人取样方法同上。5.实验器材及条件使用WatersAcquityUPLC液相色谱系统、Q-TOFSYNAPTG2HDMS质谱仪和WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)进行液相色谱质谱联用分析。色谱柱温度为40℃，进样量为5μL，流动相为A相0.1%甲酸水（v/v）和B相乙腈，流速为0.5mL/min，梯度洗脱条件为5-20%B0－3min,20－40%B3－4min,40－100%B4－6min,100%B6－7min,100%－5%B7－7.1min，5%B7.1－11min。质谱使用ESI电离源，质量扫描范围是m/z100－1000Da。电离源温度为120℃，去溶剂气温度为350℃，锥孔气和去溶剂气均为氮气，流速分别为50L/h和700L/h。正离子模式下毛细管电压为3.0kV，锥孔电压为30V，提取锥孔电压为5.0V；负离子模式下毛细管电压为2.0kV，锥孔电压为30V，提取锥孔电压为5.0V。甲酸钠建立质量轴标准曲线，亮氨酸脑啡肽进行实时质量E校正。使用MS方法进行MS/MS分析，使用氩气做碰撞气，低碰撞能为5eV，高碰撞能为25-35eV。31 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究6.检测前样品的准备在进行UPLC-MS分析前，尿样在室温条件下解冻后，10000rmp离心10min，取上清液用水稀释10倍。稀释后样品过0.22μm滤膜进行UPLC-MS分析。7.数据采集使用WatersAcquityUPLC液相色谱系统、Q-TOFSYNAPTG2HDMS质谱仪和WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)进行液相色谱质谱联用进行数据采集分析。8.数据分析数据分析使用EZinfo2.0软件中的PCA和OPLS-DA进行多元变量分析。使用SPSS17.0软件进行组间独立样本方差检验。使用生物学数据库，如HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、Massbank(http://www.massbank.jp/)和KEGG(http://www.kegg.com/)进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。8.1PCA分析结果采用主成分分析考察健康人（A组）、气虚血瘀证（B组）、气虚血瘀痰浊证（C组）的尿液中代谢物的变化。正离子模式下和负离子模式下的得分图能够很好的将三者区分。在PCA得分图中每一个点代表一个样品，每个样品的位置由其自身的代谢决定，处于相同生理病理的样品通常具有相似的代谢物，因此得分图上处于相近的地理位置。若彼此间的差距越大，也就表明其生理病理状态相差越大。如图2正离子模式的的PCA得分以及图3负离子模式下的PCA得分图。图2正离子模式图3负离子模式*健康组(▲)气虚血瘀(▲)气虚血瘀痰浊(▲)32 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究8.2OPLS-DA分析结果对气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的尿液进行OPLS-DA分析，建立模型，得出S-plot图，分散在S型两端的标志物可能具有潜在的特异性。图4B组在正离子模式（左）和负离子模式（右）下的S-plot图图5C组在正离子模式（左）和离子模式（右）下的S-plot图用交叉验证法进行检验，得到R2Y值和Q2值，R2Y值代表了对模型的验证能力，Q2值代表了对模型的预测能力，它们可以对模型进行有效性评价。理论上R2Y值和Q2值越高，越接近1，说明所建立的OPLS-DA模型质量良好，能够反应原始变量的信息，预测能力也就越强。其中气虚血瘀组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.89，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=0.97、Q2=0.85；气虚血瘀痰浊组在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.97，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=0.98、Q2=0.87。正常情况下，R2Y和Q2的值高于0.5较好。33 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究8.3潜在生物物标志检索分散在S型两端的点作为潜在的生物标志物，选择其中VIP值大于1.0的分子量且独立t检验的P<0.05的化合物作为潜在的生物标志物，通过精确分子量在生物数据库进行正谱和负谱检索，选取得到如下物质：3-Methylthiopropionicacid、Pyrrolidonecarboxylicacid、Estrone、Alpha-Hydroxyhippuricacid、Hippuricacid、Mesaconicacid、Glutaconicacid、Uricacid、L-Glutamine、Aspartyl-Isoleucine、Malonicacid、Ribonicacid、Galactonicacid、D-Arginine、Benzoicacid、Threoninyl-Glutamate、Biotin、Isobutyryl-L-carnitine、Mesobilirubinogen、Valyl-Aspartate、Hydroxyprolyl-Threonine、Aspartyl-Methionine、Pantothenicacid、2-Aminomuconicacid、Tryptophan、Fructosamine、Porphobilinogen、Oxitriptan、N-methylvaline、D-Leucine、Oroticacid、Lysyl-Tyrosine、3-Chlorotyrosine、L-Phenylalanine、3-Sulfinylpyruvicacid、Stearicacid、Leucyl-Hydroxyproline、Pregnanediol-3-glucuronide、Etiocholanoloneglucuronide、VitaminK12,3-epoxide、Glucosamine、4-Hydroxyhippuricacid、Orotidine、Lactose6-phosphate、D-Glucaro-1,4-lactone、Lorcaserinsulfamate、Valproylglycine、Dimethylallylpyrophosphate、Oleicacid、Asparaginyl-Asparagine、Pregnenolonesulfate、Wyeronicacid、Chenodeoxycholicacidsulfate、Acetylcysteine、Glycocholic、Hydroxyprolyl-Isoleucine、Valyl-Threonine、Imidazoleacetol-phosphate等。在以上物质中，选取10个可以解释代谢通路且具有代表意义的潜在生物标志物进行整理和翻译，如下表634 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究表6生物标志物PreciseCommonRTMeasuredErrorNamemolecularName（min）Mass(ppm)weightHippuric-8acid马尿酸3.69180.0664179.17270.49×10Uricacid-8尿酸1.08169.0361168.11030.55×10Biotin-8生物素4.19245.0948244.3110.32×10Aspartyl-M天冬氨酰-8ethionine0.84265.0823264.2990.29×10蛋氨酸Lysyl-Tyro赖氨酰酪-8sine4.90310.2007309.36080.27×10氨酸3-Sulfinyl半胱氨酸-8pyruvic0.83152.0238151.1180.59×10亚磺酸acidGlucosamin氨基葡萄-83.79178.0553179.1711-O.62×10e糖Fructosami-8果糖胺3.14180.0901179.17110.51×10neHydroxyprolyl-Isoleu羟脯氨酰-83.85243.1383244.2875-.047×10cine异亮氨酸2-stearoylglyceropho磷脂酰甘-85.14511.291512.6142-0.26×10sphoglycer油ol35 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究对以上的潜在生物标志物进行三组间的方差及标准差统计，如下表7表7生物标志物三组间均值与标准差比较均值标准差NameA组B组C组A组B组C组马尿酸30.1635.1068.4118.7020.8040.14尿酸50.6074.4468.5837.0147.2050.79生物素12.978.266.405.174.984.66天冬氨酰2.439.196.803.685.146.71蛋氨酸赖氨酰酪172.32104.7286.9471.6366.6947.14氨酸半胱氨酸13.9228.1224.025.627.249.74亚磺酸氨基葡萄57.7978.36182.1320.5135.3596.51糖果糖胺2.784.5716.061.093.0419.50羟脯氨酰17.5611.2212.189.4010.898.15异亮氨酸磷脂酰甘23.6013.9114.0611.478.037.80油36 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究对各组别进行组与组的差异性分析，变化趋势a表示气虚血瘀组和健康组之间的比较，若气虚血瘀组高于健康组则箭头显示升高，气虚血瘀组低于健康组则箭头显示下降；同样，变化趋势b则代表气虚血瘀痰浊组和健康组之间的比较；变化趋势c代表气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间的比较。整理如下表8表8三组之间变化趋势Name变化趋势a变化趋势b变换趋势c马尿酸—↑↓尿酸———生物素↓↓—天冬氨酰蛋氨酸↑↑—赖氨酰酪氨酸↓↓—半胱氨酸亚磺酸↑↑—氨基葡萄糖—↑↓果糖胺—↑↓羟脯氨酰异亮氨酸———磷脂酰甘油↓↓—a：气虚血瘀组vs.健康组，P<0.05；b：气虚血瘀痰浊组vs.健康组，P<0.05；c：气虚血瘀组vs.气虚血瘀痰浊组，P<0.05“－”表示两组间没有差异37 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究9.讨论国内一些学者发现代谢组学在中医药研究中的广泛前景，不仅仅把代谢组学应用于冠心病的诊断中，也将代谢组学这项新技术应用在冠心病中医证候客观化的研究中，在传统中医辨证的基础上，寻找可以量化冠心病中医证候的新标准，从机体代谢物的小分子化合物入手，通过代谢通路的分析，为中医证候的辨证施治提供了新大陆。通过对不同证型患者的不同体液进行代谢组学检测，得到了相应证型的特异性标志物。对比国内一些相关研究，我们将健康组、气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组在PCA得分图中明显区分开来，并且通过组与组之间的对比，发[64]现气虚血瘀证型和痰浊证型的可能性潜在生物标志物。张红栓等通过对冠心病心绞痛患者的尿液代谢组学检测，发现血瘀证和痰浊证两组的代谢物可以明显区分，痰浊证组的柠檬酸、a酮戊二酸、顺式乌头酸、葡萄糖、3羟基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、马尿酸的含量高于血瘀证组，而胆汁酸、组氨酸的含量低于血瘀证组，和我们检测出马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺这三种[65]物质可能是痰浊证潜在的生物标志物具有高度相似性。简维维等对心血瘀阻证，非心血瘀阻证和健康人进行了尿液代谢组学的检测，得到了冠心病心血瘀阻证尿液生物代谢产物谱:葡萄糖、甘油、木糖醇、马尿酸、油酸酰胺、丙酮；认为心血瘀阻证代谢途径涉及脂质代谢紊乱以及应激因素，同时也与肝肾有一定相关性。以下从PCA分析和OPLS-DA分析分别进行讨论：9.1在PCA分析中，PCA得分图中每一个点代表一个样品，相同的地理位置代表具有相似的代谢物，在正离子模式下我们可以看到，红、绿、黑之间的地理位置存在着明显差异，健康组的20个样本的代谢物相似，气虚血瘀组的16个样本的代谢物相似，气虚血瘀痰浊组的15个样本的代谢物相似，三组之间的代谢物存在着明显差异，提示健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的体内代谢通路存在本质的差异；在负离子模式下，红色样本的地址位置主要分布在右侧，而绿色和黑色样本主要集中在左侧，并且绿色和黑色并没有明显区分开来，提示健康组和气虚血瘀、气虚血瘀痰浊这两组的代谢通路有明显差异。9.2在OPLS-DA分析中，分别得到了气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组的S-plot图，气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组中，正离子模式和负离子模式下均呈现出具有特异性的物质，分散在S型两端的散点越远，越具有代谢通路的特异性，这种潜在的38 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究生物标志物可能就是与其他组别区分开来的主要物质，对这些潜在的生物标志进行分析和检索，以区分三组之间的差异。9.3在三组中，找出10个具有代表意义的潜在生物标志物，从表中可以得到以下提示：9.3.1尿酸和羟脯氨酰异亮氨酸在三组间没有统计意义；9.3.2马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺：B组和C组虽然均高于A组，但是B组和A组之间没有差异性。提示这三种物质可能代表了C组的特异性。马尿酸是由肠道菌群中的苯甲酸分解而产生，过多的马尿酸反应了肠道微生物的菌群失调。气虚血瘀痰浊组明显高于气虚血瘀组和健康组，且气虚血瘀组和健康组没有差异，提示气虚血瘀痰浊组存在着严重的肠道微生物的菌群失调，这种菌群失调可能会导致胃肠功能紊乱而致肠道疾病，因此马尿酸可能会是痰浊病理因素的潜在标志物。氨基葡萄糖是俗称氨基糖，存在于生物体内的多糖或结合多糖中；而果糖胺是蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的高分子物质，它反应了血糖的水平，气虚血瘀痰浊组明显高于气虚血瘀组和健康组，且健康组和气虚血瘀组没有差异，提示气虚血瘀痰浊组可能均存在着严重的糖代谢紊乱，氨基葡萄糖、果糖胺可能是痰浊的潜在生物标志物。9.3.3生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油：B组和C组均低于A组，B组和C组之间没有差异性。生物素又称维生素H、辅酶R，也属于维生素B族中的B7。它是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。根据组间之间的比较，提示气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的生物素均低于健康组，两组之间没有差异，生物素是脂肪，碳水化合物能量代谢所必须的物质，所以在两组病理体质中生物素的缺乏可能会引起脂肪、蛋白质、能量代谢的紊乱。赖氨酰酪氨酸是赖氨酸和酪氨酸形成的双肽，也代表了这两种氨基酸。赖氨酸是人体必须的氨基酸，酪氨酸是非必须氨基酸，两种氨基酸都是人体所需要的营养物质，为蛋白质的吸收和利用提供基础，在气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组中两种物质均低于健康组，提示两组病理体质缺少氨基酸种类的营养物质。磷脂酰甘油是一种酸性磷脂，磷脂具有促进脂肪代谢，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。同样，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组均缺少这种保护心脏的有益物质，临床治疗中就要注意血脂和胆固醇的治疗。39 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究9.3.4天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸：B组和C组均高于A组，B组和C组之间没有差异性；天冬氨酰蛋氨酸是由天门冬氨酸和蛋氨酸组成的二肽，这是蛋白质分解代谢的不完整的的分解产物，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组明显高于健康组提示机体内存在着大量不完整的蛋白质分解产物，表明蛋白质处于高代谢的一个状态，所以病理体质的组别在饮食上是需要补充一定的蛋白质营养。半胱氨酸亚磺酸是氧化还原酶和天门冬氨酸氨基转移酶的副产品，当天门冬氨酸氨基转移酶升高时，提示肝脏疾病可能引起的肝损伤。气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的半胱氨酸亚磺酸明显高于健康组，提示对于病理体质可能存在潜在的肝损伤，临床中用药治疗需要谨慎。对于天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸这两种物质，B组和C组均高于A组，说明它们存在于气虚血瘀中，但是B在和C组之间没有差异，提示天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸可能为气虚血瘀中特异性标志物，而在气虚血瘀痰浊中并无特异性，表明这两种物质可能不是痰浊证的潜在标志物。40 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究（二）健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组血清代谢的研究1.病例来源观察病例为就诊于长春中医药大学附属医院心内科住院部的患者。所有患者都符合相应的中西医诊断标准和病例纳排除标准。健康人为在长春中医药大学附属医院体检确定其身体健康的志愿者。2.诊断标准诊断标准、纳入标准及排除标准参照流行病学研究的纳排标准。3.研究对象选取健康人9例(A组)、气虚血瘀证患者7例(B组)、气虚血瘀痰浊证患者(C组)8例患者的血清进行代谢组学检测。4.样品取材与预处理冠心病稳定性心绞痛患者采血前1天素食，次日清晨经肘静脉抽取受试者空腹12h静脉血2--3ml,室温下经3000r/min离心后10min后，取血清至-80℃冰箱保存；健康人同上。5.实验器材及条件使用WatersAcquityUPLC液相色谱系统、XevoTQ质谱仪和WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)进行液相色谱质谱联用分析。色谱柱温度为35℃，进样量为5μL，流动相为A相0.1%甲酸水（v/v）和B相甲醇，流速为0.3mL/min，梯度洗脱条件为10－20%B0－1min,20－25%B1－4min,25－100%B4－6min,100%－5%B6－6.1min，5%B6.1－11min。使用ESI电离源正离子模式，采用多反应检测模式（MRM）检测。电离源温度为120℃，去溶剂气温度为350℃，电源电压2.0kV。锥孔气和去溶剂气均为氮气，流速分别为50L/h和700L/h。6.检测前样品的准备取血样，4度复溶，200μL血样加入800微升-20℃预冷异丙醇，涡旋3min，离心14000rmp，取定量上清，过0.22μm滤膜，N2吹干，取200微升50%甲醇50%水复溶，进行UPLC-MS分析。41 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究7.数据采集使用WatersAcquityUPLC液相色谱系统、Q-TOFSYNAPTG2HDMS质谱仪和WatersACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)进行液相色谱质谱联用进行数据采集分析。8.数据分析数据分析使用EZinfo2.0软件中的PCA和OPLS-DA进行多元变量分析。使用SPSS软件进行组间独立样本t检验。使用生物学数据库，如HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、Massbank(http://www.massbank.jp/)和KEGG(http://www.kegg.com/)进行生物标志物的鉴定和代谢通路的分析。8.1PCA分析采用主成分分析考察健康组、气虚血瘀、气虚血瘀痰浊组别的血清中代谢物的变化。同尿液部分的数据分析一样，正离子模式下和负离子模式下的得分图能够很好的将三者区分。在PCA得分图中每一个点代表一个样品，每个样品的位置由其自身的代谢决定，处于相同生理病理的样品通常具有相似的代谢物，因此得分图上处于相近的地理位置，若彼此间的差距越大，也就表明其生理病理状态相差越大。如图6正离子模式的的PCA得分以及图7负离子模式下的PCA得分图。图6正离子模式图7负离子模式*健康组(▲)气虚血瘀(▲)气虚血瘀痰浊(▲)PCA得分图8.2OPLS-DA分析对气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的血清进行OPLS-DA分析，建立模型，得42 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究出S-plot图，分散在S型两端的标志物可能具有潜在的特异性。图8气虚血瘀证在正离模式（左）和负离子模式（右）下的S-plot图图9气虚血瘀痰浊证在正离子模式（左）和负离子模式（右）下的S-plot图用交叉验证法进行检验，得到R2Y值和Q2值，R2Y值代表了对模型的验证能力，Q2值代表了对模型的预测能力，它们可以对模型进行有效性评价。理论上R2Y值和Q2值越高，越接近1，说明所建立的OPLS-DA模型质量良好，能够反应原始变量的信息，预测能力也就越强。其中气虚血瘀证在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.98、Q2=0.90，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=1.00、Q2=0.98；气虚血瘀痰浊证在正离子模型下的模型评价指标为R2Y=0.99、Q2=0.97，负离子模式下的模型评价指标为R2Y=1.00、Q2=0.95，R2Y值和Q2值都反映了模型建立良好。43 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究同样，在血清中，两组证型也存在潜在的生物标志物，分散在S型两端的点作为潜在的生物标志物，选择其中VIP值大于1.0的分子量且独立t检验的P<0.05的化合物作为潜在的生物标志物，通过精确分子量在生物数据库进行正谱和负谱检索，得到的生物标志物比尿液中少：Lysophospholipid、Phosphatidylcholine、TG、Sphingomyelin、Diglyceride、Phosphatidylserine、Phosphorylserine、Phosphatidic、Methionyl-Serine、Chenodeoxyglycocholicacid、Homocysteinehiolactone、Cholesterolsulfate、3-O-Sulfogalactosylceramide、Bilirubin、Glyceroltriundecanoate、VitaminK1、CyclicGMP、Alpha-Linolenicacid、Glycocholicacid等。在以上物质中，选取6个可以解释代谢通路且具有代表意义的潜在生物标志物进行整理和翻译，如下表9。表9生物标志物PreciseCommonRTMeasuredErrorNamemolecularName（min）Mass(ppm)weight-8TG甘油三酯10.52815.699815.29920.04×10-8DG甘油二酯9.64731.605731.08130.07×10Methionyl氨酰丝氨-8-Serine10.70237.0836236.2890.33×10酸Glycochol-8甘氨胆酸7.40464.3158465.6227-0.28×10icacidCholester胆固醇硫-6ol8.79465.3054117.1692.96×10酸酯sulfate44 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究Homocyste同型半胱-6ine10.33115.9246117.169-0.01×10氨酸硫内thiolacto酯ne应用SPSS17.0软件，在A、B、C三组之间对6种潜在生物标志物进行方差和标准差检验，见下表10表10生物标志物三组间均值与标准差比较Common均值标准差NameA组B组C组A组B组C组甘油三酯22.4335.8790.512.9826.7831.65甘油二酯31.2034.6565.1128.2925.6841.56氨酰丝氨18.9713.9019.735.666.583.52酸甘氨胆酸5.29002.4100胆固醇硫67.8361.7364.7028.909.87.6酸酯同型半胱三酸硫内64.4032.2830.3063.715.825.49酯对各组别进行组与组的差异性分析，变化趋势a表示气虚血瘀组和健康组之间的比较，若气虚血瘀组高于健康组则箭头显示升高，气虚血瘀组低于健康组则箭头显示下降；同样，变化趋势b则代表气虚血瘀痰浊组和健康组之间的比较；变化趋势c代表气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组之间的比较。整理如下表1145 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究表11三组之间变化趋势Name变化趋势a变化趋势b变换趋势c甘油三酯—↑↓甘油二酯———氨酰丝氨酸———甘氨胆酸↓↓—胆固醇硫酸酯———同型半胱氨酸硫———内酯a：气虚血瘀组vs.健康组，P<0.05；b：气虚血瘀痰浊组vs.健康组，P<0.05；c：气虚血瘀组vs.气虚血瘀痰浊组，P<0.05“－”表示两组间没有差异9.讨论血瘀证作为冠心病心绞痛中主要的病理因素之一，引起了大家的广泛关注，[66]各学者围绕血瘀证也都进行了不同层面的研究。华何与等对气滞血瘀证、心血瘀阻证、气虚血瘀证这三种血瘀证患者的血浆分别进行代谢组学的检测，发现气虚血瘀证组可以和其他两组证型明显区分，而气滞血瘀证和心血瘀阻证之间的差别不明显，气虚血瘀证组血浆中柠檬酸、3-羟基丁酸、丙酮、氧化三甲胺含量较高，葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较低。史[67]琦等采用核磁共振技术对冠心病血瘀证患者的血浆进行研究，筛选出血瘀证特征性代谢产物包括缬氨酸和丙酮。而我们通过对冠心病心绞痛患者的血清研究，作如下讨论：9.1在PCA分析中，PCA得分图中每一个点代表一个样品，相同的地理位置代表相似的代谢物，在负离子模式下我们可以看到，红、绿、黑之间的地理位置存在着明显差异，健康组的9个血清样本的代谢物相似，气虚血瘀组的7个血清样本的代谢物相似，气虚血瘀痰浊组的8个血清样本的代谢物相似，三组之间的代谢46 长春中医药大学2016届硕士学位论文实验研究物存在着明显差异，提示健康组、气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的体内代谢通路存在本质的差异；在正离子模式下，黑色血清样本分布在左侧，而红色样本和绿色样本主要分布在右侧，提示气虚血瘀痰浊组可以明显和健康组和气虚血瘀组区分开来。9.2在OPLS-DA分析中，分别得到了气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组的S-plot图，气虚血瘀组、气虚血瘀痰浊组中，正离子模式和负离子模式下均呈现出具有特异性的物质，同尿液代谢组学的S-plot图一样，分散在S型两端的散点越远，越具有代谢通路的特异性，这种潜在的生物标志物可能就是与其他组别区分开来的主要物质，对这些潜在的生物标志进行分析和检索，以区分三组之间的差异。9.3在三组中，找出6个具有代表意义的潜在生物标志物，通过对比和分析，发现甘油三酯和甘氨胆酸在三组间存在明显差异性。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的甘油三酯都高于健康组，但是气虚血瘀组和健康组没有明显差异，提示甘油三酯在气虚血瘀痰浊组中有很高的含量，可以推测甘油三酯是痰浊这种病理因素的潜在性生物标志物，也说明气虚血瘀痰浊证型的患者体内可能存在着脂质代谢、能量代谢的紊乱；甘氨胆酸是由胆酸和甘氨酸结合生成的，然后随胆汁排入肠道，帮助脂肪的消化和吸收，通过对比，气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的甘氨胆酸都比健康组少，病理体质的两组之间没有差异，提示气虚血瘀组和气虚血瘀痰浊组的人群中存在着脂肪低代谢的状态，可能会导致脂质在体内沉积，继而引发脂质代谢的紊乱，成为冠心病的危险因素。系统生物学的研究方法和中医学体系的整体观念存在着许多的相似性，但将二者结合起来也面临诸多挑战。虽然国内代谢组学已经广泛应用在中医药中，但是对于高分辨率仪器短缺、代谢指纹图谱不完善、模式识别分析软件依赖国外进口等问题，特别是中医证候的复杂多变性，这就需要技术成熟发展，但是代谢组学的无创性、高灵敏性的分析特点，更易于为中医药的现代化所接受，也为目前[68]中医药的研究开辟了新的方法和思路，有望使中医辨证实现客观化。47 长春中医药大学2016届硕士学位论文结论结论本研究通过对冠心病心绞痛患者临床资料进行调查与整理，把握冠心病心绞痛中医证候特征规律,利用代谢组学技术检测中医证候中潜在的生物标志物，通过代谢通路的分析，探讨中医证候与伏邪发病的相关性，本研究初步得出以下结论：1.冠心病心绞痛流行病学调查结果冠心病心绞痛患者的好发年龄是71-79岁，其中女性多于男性；其次是61-70岁年龄段，男性多于女性；冠心病心绞痛的危险因素主要有年龄因素、高血压病、吸烟、饮酒等、糖尿病、急躁易怒、血脂异常、肥胖和冠心病家族史等；伏邪发病时主要以气虚、血瘀、痰浊三类证候为主；对证候要素进行统计后，发现上述气虚、血瘀、痰浊也作为证候要素存在；复合证型中以气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证最多，由此，我们推测气虚、血瘀、痰浊可能为冠心病心绞痛发生发展的潜在的病理因素，可能也就是冠心病发生发展的潜在伏邪，其中气虚为虚性病理因素，而血瘀和痰浊为实性病理因素。2.冠心病中医证候代谢组学比较结果尿液和血清的代谢组学研究中，PCA得分图中可以明显区分出三组样本的差异性；在S-plot图中也可以看到气虚血瘀和气虚血瘀痰浊两组的定性分析，既存在S型两端的黑色点状就是区分彼此的差异性代谢物；对于天冬氨酰蛋氨酸、半胱氨酸亚磺酸这两种物质，可能为气虚血瘀证型的潜在特异性标志物；马尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯可能为痰浊证的潜在特异性标志物，而这些物质的升高反应了糖类代谢的紊乱，故对于冠心病患者尚未发病时，给予体内伏邪一定的干预，可以预防冠心病的发生发展。生物素、赖氨酰酪氨酸、磷脂酰甘油、甘氨胆酸这四种物质是气虚血瘀证和气虚血瘀痰浊证中所缺少的物质，其中生物素和赖氨酰酪氨酸属于营养物质，而磷脂酰甘油和甘氨胆酸可以促进脂肪代谢，帮助脂肪消化和吸收，所以对于这两种证型的患者在临床治疗时要注意营养物质的补充和脂类饮食的控制。本研究尚存在着一定的局限性，代谢组学的证候种类和样本量较少，下一步研究中，会对冠心病其他中医证候进行深入的研究，并且扩充样本量，从而对冠心病中医证候和伏邪的相关性有一个全面的认识。48 长春中医药大学2016届硕士学位论文致谢致谢特别感谢邓悦老师三年来对我辛勤地培养、细心地教导以及生活中的关心。三年前有幸可以成为老师的学生让我倍感荣幸，老师开阔的胸襟、谦和儒雅的性格、事必躬亲的处世态度使我钦佩不己，其因人施教的教导方法、精益求精的工作作风，严谨的治学态度、深厚渊博的学识更是我学习的榜样。感谢三年来老师的言传身教，特别是本课题自选题到完成撰写都是在老师精心教导下完成，在整个研究的设计和完成过程中，恩师都投注了很多心血和精力。老师的教诲，我会长记于心，老师的恩情，我将终生不忘，日后会更加努力，以期不断提高。特别感谢长春中医药大学附属医院石锐、常丽萍等老师在临床实习过程中所给予我的指导和帮助，使我的临床知识和实践技能更加完善。衷心感谢长春中医药大学附属医院心病科的老师和同学们给予我学习和生活上的帮助，使我学习、生活倍感温暖。最后感谢参加评审和与答辩委员会的各位专家的指导。49 长春中医药大学2016届硕士学位论文参考文献参考文献[1]沈薇薇.山海经译注.哈尔滨:黑龙江人民出版社,2002.13.[2]周一谋,萧佐桃.马王堆医书考注.天津:天津科学技术出版社,1988.16.[3]灵枢经.北京:人民卫生出版社,1993.[4]赵估.圣济总录(上册).北京:人民卫生出版社,1982.1030.[5]凌耀星.难经语译.北京:人民卫生出版社,1990.90.[6]巢元方,诸病源候论.见:高文铸.医经病源诊法名著集成.北京:华夏出版社,1994.386.[7]张机.金曦要略方论.北京:人民卫生出版社，1982.26.[8]巢元方,诸病源候论.见:高文铸.医经病源诊法名著集成.北京:华夏出版社,1994.386.[9]韩学杰，沈绍功.冠心病心绞痛痰瘀互结证的本质探讨[J].中国中医基础医学杂志.2002，8(10):53-54.[10]何剑平，李小敏.冠心病中医辨证与血脂脂蛋白关系的探析[J].辽宁中医杂志.1998,25(11):9-10.[11]王东生，袁肇凯，李建玲，等.冠心病痰瘀病理临床研究[J].山东中医药大学学报,2003,27(2):109-111.[12]宋崇顺，廖家桢，吕小燕等.气虚证血液流变学的临床观察和实验研究[J].中医杂志,1981(10):39-41.[13]解民.肝论治冠心病心绞痛的临床观察[J].吉林中医药,2002,22(4):5.[14]1980年全国冠心病辨证论治研究座谈会.冠心病中医辨证试行标准[S].中医杂志,1980,(8):46.[15]陈贵延，薛赛琴.最新国内外疾病诊疗标准[S].北京学苑出版社,1992,209-212:678.[16]中西医结合心血管学会.冠心病的中医辨证标准[S].中西医结合杂志，1991,11(5):257.[17]卫生部中药新药治疗胸痹心痛的临床研究指导原则[S].1993,41.[18]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[S].北京.中国医药科技出版社.2002.[19]田德禄,蔡淦.中医内科学[M].上海：上海科技出版社,2006:128-131.50 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