水稻黑条矮缩病毒编码蛋白p7-2与寄住水稻蛋白互作研究

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1、ADissertationfortheDegreeofMasterInteractionofP7-2encodedbyRiceblack-streakeddwarfvirusandhostriceproteinsByShanglinZhangSupervisors:ProfessorJianpingChen&AssociateProfessorLiyingSunCollegeofPlantProtectionAnhuiAgriculturalUniversityHefei230036,P.R.ChinaZhejiangAcademyofAgriculturalScienc

2、esHangzhou310021,P.R.ChinaJune,2013本研究得到国家自然科学基金(31071660)，国家基础研究973项目(2010CB126203,2012CB722504)，公益性行业科研专项(2012DFA30900)，及“现代农业生物技术与作物病害防控”——浙江省高校重中之重学科建设资金资助研究工作在浙江省农业科学院“浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地”完成ThisstudywasfinanciallysupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(310

3、71660),theStateBasicResearchProgramofChina(2010CB126203,2012CB722504),theInternationalScience&TechnologyCooperationProgramofChina(2012DFA30900)，theAgriculturalResearchProgramofChineseMinistryofAgriculture(201003031)andKeySubjectConstructionProgramofZhejiangforModernAgriculturalBiotechnolo

4、gyandCropDiseaseControl.ThisworkwasdoneintheStateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl中文摘要水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus,RBSDV）是斐济病毒属的成员之一，可侵染玉米和水稻，引发玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病，给亚洲水稻和玉米生产带来严重的损失。RBSDV的传播介体为灰飞虱（Laodelphgaxstriatellus），且该病毒在寄主植物和昆虫体内均可复制。寄主植物感病后主要症状

5、为植株矮化、叶脉上出现肿瘤状突起等。RBSDV粒子呈正二十面体结构，具有双层衣壳，衣壳内部包含10条dsRNA基因组（S1~S10），可编码至少10个蛋白，并根据它们各自的基因片段命名。其中6个蛋白是病毒颗粒的结构成分（P1，P2，P3，P4，P8，P10），6个为非结构蛋白（P5，P6，P7-1，P7-2，P9-1，P9-2）。在非结构蛋白中，P7-1被认为可在昆虫介体细胞中参与形成管状结构，从而作为病毒胞间运动的通道。S9第一个ORF也编码一个重要的非结构蛋白P9-1，此蛋白在病毒侵染的植物或昆虫细胞中形成复制场所（毒质），是病毒复制所必需的。另外，S5编码的P5和S

6、6编码的P6蛋白也为非结构蛋白，最近的研究表明这两个非结构蛋白与毒质的生物学活性相关。目前对P7-2的了解较少，其功能尚不明确。本研究采用分子克隆技术，首先从感染RBSDV浙江分离物的水稻叶片中扩增得到该病毒P7-2基因片段。将该基因亚克隆到原核表达载体pMAL-C2x中，将获得的重组原核表达质粒pMAL-P7-2在大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量诱导表达。以纯化的融合蛋白MBP-P7-2为诱饵蛋白，通过Pull-Down实验在非变性条件下钓出感病水稻叶片总蛋白中的捕获蛋白。Pull-Down后的样品以空载体表达的标签蛋白MBP为阴性对照进行SDS-PAGE，检测到4

7、个蛋白与目的蛋白特异结合，并进一步通过串联飞行质谱分析鉴定这些捕获蛋白。根据它们在RiceGenomeAnnotationProject中的序列比对分析，明确其中2个蛋白为转录相关蛋白，1个蛋白为氨基转移酶蛋白，1个蛋白为假定的分子伴侣60的前体。实时荧光定量PCR的数据分析表明，4个目的蛋白在感病水稻中的表达量与健康水稻中的表达量相比，转录相关蛋白和假定的分子伴侣60的前体的表达量增加，氨基转移酶蛋白的表达量降低。据此推测RBSDVP7-2蛋白可能具有转录激活活性，并且抑制寄主中氨基转移酶的表达，从而降低了寄主植物的抗病性。