南方水稻黑条矮缩病毒p9蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究

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分类号：S435.111.1密级：公开论文编号：2012022116贵州大学2015届硕士研究生学位论文南方水稻黑条矮缩病毒P9蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究学科专业：农药学研究方向：农药毒理、作用机制及抗性导师：宋宝安教授研究生：杨霞中国﹒贵州﹒贵阳2015年6月 贵州大学2015届硕士研究生学位论文目录摘要..............................................................................................................................................1Abstract.............................................................................................................................................2前言..............................................................................................................................................6第一章文献综述.............................................................................................................................81.1南方水稻黑条矮缩病的发生及危害................................................................................81.2南方水稻黑条矮缩病的传播及主要症状........................................................................81.3南方水稻黑条矮缩病的分类地位....................................................................................81.4南方水稻黑条矮缩病毒粒体特性....................................................................................91.5南方水稻黑条矮缩病基因的相关研究............................................................................91.6南方水稻黑条矮缩病相关蛋白的功能研究....................................................................91.7南方水稻黑条矮缩病的防控..........................................................................................111.8蛋白与药物相互作用方法的研究..................................................................................111.8.1紫外光谱法研究蛋白与药物的相互作用...........................................................111.8.2荧光光谱法研究蛋白与药物的相互作用...........................................................121.8.3ITC研究蛋白与药物的相互作用.......................................................................131.8.4MST研究蛋白与药物的相互作用.......................................................................141.9本章小结..........................................................................................................................15第二章研究路线设计...................................................................................................................162.1研究目的和意义..............................................................................................................162.2拟解决的主要问题..........................................................................................................162.3研究内容..........................................................................................................................162.4技术路线..........................................................................................................................17第三章材料与方法.......................................................................................................................183.1实验材料..........................................................................................................................183.1.1质粒与表达菌株...................................................................................................183.1.2供试蛋白和抗植物病毒小分子...........................................................................183.1.3实验试剂...............................................................................................................183.1.4主要仪器设备.......................................................................................................193.1.5主要缓冲溶液的配制方法...................................................................................203.2实验方法与步骤..............................................................................................................203.2.1含P9-1重组质粒pET28a的转化.....................................................................203.2.2SRBSDVP9-1的表达...........................................................................................223.2.3SRBSDVP9-1的纯化...........................................................................................223.2.4SRBSDVP9-1的验证...........................................................................................233.2.5通过高分辨质谱仪鉴定SRBSDVP9-1目的蛋白.............................................243.2.6SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究......................................253.2.7活体实验...............................................................................................................27第四章结果与讨论.......................................................................................................................284.1SRBSDVP9-1蛋白的表达与纯化.................................................................................284.1.1SRBSDVP9-1重组质粒的转化..........................................................................284.1.2SRBSDVP9-1的转化验证..................................................................................28 贵州大学2015届硕士研究生学位论文4.1.3SRBSDVP9-1的诱导表达及纯化......................................................................294.1.4SRBSDVP9-1的高分辨质谱鉴定......................................................................304.2SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究.................................................314.2.1SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的荧光光谱研究......................................314.2.2SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的紫外光谱研究......................................404.2.3SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的ITC研究.............................................444.2.4SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的MST研究...........................................464.3活体实验...........................................................................................................................504.3.1对4种药剂处理后的水稻样本中S9-1的RT-PCR结果..................................504.4SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的相互作用研究.........................................................514.4.1SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的荧光光谱研究..............................................514.4.2SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的ITC研究....................................................53第五章结论...................................................................................................................................555.1主要结论..........................................................................................................................555.2本文创新之处..................................................................................................................565.3本文的不足之处与展望..................................................................................................56致谢............................................................................................................................................57参考文献.........................................................................................................................................58附录..............................................................................................................................................63原创性声明.............................................................................................................................64 贵州大学2015届硕士研究生学位论文摘要近年来，南方水稻黑条矮缩病(Southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV)严重危害着我们国家长江以南稻区的粮食安全。目前对该病害的基础研究还较为薄弱，主要采用“控虫防病”的措施来保证水稻的正常生产。如何有效地筛选抗SRBSDV药物是防治SRBSDV的关键问题，因此建立一个基于SRBSDV关键蛋白为潜在靶标的药物筛选模型，寻找到高活性的抗SEBSDV药物，对防治SRBSDV具有重要意义。本论文以原核表达纯化的P9-1蛋白为靶标，利用紫外光谱法、荧光光谱法、等温量热滴定法和微量热泳动法研究P9-1与抗病毒小分子之间的相互作用。以药物与P9-1蛋白的作用力为指标，进行离体水平的抗SRBSDV药物筛选，建立了基于P9-1为潜在靶标的药物筛选模型。研究结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖及氨基寡糖与P9-1均有一定54的相互作用，其结合常数大小依次为毒氟磷(1.51×10)＞宁南霉素(5.60×10)43＞香菇多糖(4.78×10)＞氨基寡糖(5.60×10)，而盐酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1没有相互作用；继而研究了毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1的相互作用，结果显示GUJHZX-013和GUJHZX-025与SRBSDVP9-1均45有较强的相互作用，其结合常数分别为：9.12×10和1.41×10，而GUJHZX-005、GUJHZX-031、GUJHZX-035及GUJHZX-041与SRBSDVP9-1没有相互作用。关键词：南方水稻黑条矮缩病毒P9-1；抗病毒小分子；紫外光谱法；荧光光谱法；等温量热滴定法；微量热泳动法中图分类号：S435.111.11 贵州大学2015届硕士研究生学位论文AbstractInrecentyears,Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV)causeshugedamageonriceproductioninSouthChina,andbringsaboutmucheconomiclosses.Applyinginsecticideandtraditionalantiviraldrugsweremainmeansinricefieldtoguaranteericenormalgrowth.Atpresent,thereisnoaneffectivemethodforscreeninganti-SRBSDVdrugs,thekeytoinhibitSRBSDVishowtoscreenanti-SRBSDVdrugs,sodevelopingananti-SRBSDVcompoundsscreeningmodelbaseonproteintargetsissignificantincontrollingSRBSDV.ProkaryoticexpressionmethodwasusedtoacquiretheP9-1andregardedP9-1asthetargetprotein,researchedtheinteractionofP9-1proteinwithantiviralsbyusingultravioletspectroscopy,fluorescencespectroscopy,isothermaltitrationcalorimetry(ITC)andmicroscalethermophoresis(MST).Thus,theaffinitybetweenantiviraldrugsandSRBSDVP9-1wasselectedtoevaluatetheantiviralactivity.Fromtheseriesofexperimentsandanalysis,dufulin,ningnanmycin,lentinan,aminooligosaccharincanbindwithP9-1bynoncoleveninteraction,theirassociation5443constantwere1.51×10,5.60×10,4.78×10and5.60×10,respectively.TheaffinitybetweendufulinandSRBSDVP9-1isthehighest.DufulinderivativesGUJHZX-013andGUJHZX-025alsohavestrongeraffinitywithSRBSDVP9-1,theirassociation45constantwere9.12×10and1.41×10,respectively.ButGUJHZX-005,GUJHZX-031,GUJHZX-035,GUJHZX-041can’tbindwithSRBSDVP9-1.Keywords:SRBSDVP9-1,antiviraldrugs,ultravioletspectroscopy,fluorescencespectroscopy,ITC,MSTClassificationNumber:S435.111.12 贵州大学2015届硕士研究生学位论文缩写词列表英文缩写英文名称中文名称SRBSDVSouthernriceblack-streakeddwarfvirus南方水稻黑条矮缩病毒DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜ODOpticalDensity吸光度EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸PBSPhosphateBufferSolution磷酸缓冲溶液BSAAlbuminfrombovineserum牛血清白蛋白PEGpolyethyleneglycol聚乙二醇GlyGlycine甘氨酸sSecond秒minMinute分钟hHour小时MMolar(molesperliter)体积摩尔浓度Tris-GlycineBufferTGB电泳缓冲液SDS-PAGEDodecylsulfate,sodiumsalt-Polyacrylamidegel不连续变性电泳electrophoresis3 贵州大学2015届硕士研究生学位论文抗病毒小分子的结构式药物化学结构毒氟磷宁南霉素香菇多糖氨基寡糖盐酸吗啉胍病毒唑4 贵州大学2015届硕士研究生学位论文毒氟磷衍生物结构式编号结构式编号结构式GUJHZX-005GUJHZX-013GUJHZX-025GUJHZX-031GUJHZX-035GUJHZX-0415 贵州大学2015届硕士研究生学位论文前言近年来，SRBSDV严重威胁着我们国家长江以南稻区的粮食安全。目前田间主要采取“控虫防病”和“虫病共治”等措施进行防治，即通过杀虫剂和抗病毒剂的结合使用提高对SRBSDV的防治效果。因此，寻找高活性的抗SRBSDV药物，并运用于实际生产是目前的关键问题。在医学的抗病毒药剂筛选实验中，常用基于药物潜在靶标蛋白进行高通量筛选的方法，但是此方法在抗植物病毒药物的筛选中并未使用过，因此，建立基于SRBSDV关键蛋白为潜在靶标的药剂筛选模型，筛选出高活性的抗病毒小分子，对SRBSDV的防控有实际意义。SRBSDVP9-1为SRBSDV病毒的基质蛋白，在病毒RNA的复制和病毒组装过程中起着重要作用，如果药剂与该蛋白产生相互作用，就可能会影响它在病毒体内行使其功能，阻碍病毒RNA的复制和组装，从而减小病毒对水稻植株的危害。本研究以SRBSDVP9-1为潜在靶标蛋白，采用荧光光谱法、紫外光谱法、等温量热滴定法、微量热泳动法研究了毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、病毒唑、盐酸吗啉胍及嘧肽霉素与SRBSDVP9-1蛋白的相互作用关系，以药剂与P9-1的亲和力为指标，进行抗SRBSDV药剂的筛选。实验结果表明，采用荧光光谱法测得的抗病毒剂与SRBSDVP9-1的结合常数分别为：宁南霉素45435.60×10、毒氟磷1.51×10、香菇多糖4.78×10和氨基寡糖5.60×10；而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素对SRBSDVP9-1蛋白没有产生荧光猝灭，因此不能计算其结合常数。采用紫外光谱法研究的结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖和氨基寡糖与SRBSDVP9-1作用后吸收光谱发生了变化，说明它们产生了相互作用，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素与SRBSDVP9-1作用后吸收光谱没有发生改变；采用ITC法研究的结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖和氨基寡5444糖与SRBSDVP9-1的结合常数分别为：1.25×10、9.05×10、8.43×10及3.72×10，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素无法拟合；采用MST研究的结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、嘧肽霉素、盐酸吗啉胍和病毒唑与SRBSDVP9-1的解离常数分别为：6.20μM、35.40μM、59.50μM、65.30μM、84.20μM、61.40μM、152.00μM。6 贵州大学2015届硕士研究生学位论文四种方法的研究结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖与SRBSDVP9-1均有一定的相互作用，其亲和力大小依次为：毒氟磷＞宁南霉素＞香菇多糖＞氨基寡糖，而盐酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1蛋白没有结合。四种方法所得的结果一致，说明离体筛选模型具有一定的可靠性。由于以上研究得到毒氟磷与SRBSDVP9-1的结合力较强，所以我们采用了荧光光谱法和ITC来研究毒氟磷的衍生物与SRBSDVP9-1的结合力是否也有相同规律。研究结果表明，GUJHZX-013和GUJHZX-025与SRBSDVP9-1有45较强的相互作用，其结合常数分别为9.12×10和1.41×10，而GUJHZX-005、GUJHZX-031、GUJHZX-035及GUJHZX-041与SRBSDVP9-1没有结合。7 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第一章文献综述SRBSDV是在这些年来已经严重影响了我国的水稻生产和粮食安全，田间主要采取“控虫防病”和“虫病共治”等措施进行防治。目前，针对SRBSDV的基础研究总体还相对薄弱，因此，寻找高活性的抗SRBSDV药物，并运用于实际生产是目前急需解决的问题。本章重点围绕SRBSDV的发生与危害、SRBSDV的基因与蛋白的研究现状、SRBSDV的田间防控和药物与蛋白相互作用方法等方面进行介绍。1.1南方水稻黑条矮缩病的发生及危害SRBSDV是2001年在中国广东阳西县被发现一种水稻病毒病，2008年，周国辉等将其命名为南方水稻黑条矮缩病毒。2009年，该病害已经蔓延了越南北方的19个省及中国南方的9个省区，分别导致了越南和中国约42,000公顷及300,000公顷面积的粮食减产，2011年，大约1,300,000公顷的中国稻田受[1-2]到SRBSDV的感染，导致许多地方的粮食歉收。截止2012年，中国长江以[3]南稻区中有15个省市均发现了SRBSDV，其中湖南、江西、福建属于重灾区，同年，SRBSDV在中国和越南稻田的总危害面积超过了500,000公顷。除此之[4]外，2013年在日本稻区也发现了SRBSDV。由此可见，SRBSDV的爆发给水稻的种植带来了巨大危害，找到该病毒的防控方法及高效的防治药剂显得尤为紧迫。1.2南方水稻黑条矮缩病的传播及主要症状SRBSDV的传播介体是白背飞虱(SogatellafurciferaHorváth)，白背飞虱一旦带毒后可终生带毒，病毒经过其口器传播，不经卵传播。同科的灰飞虱[5-7](LaodelphaxstriatellusFallén)可以带毒，但是不能传毒。1.3南方水稻黑条矮缩病的分类地位根据SRBSDV病毒的特征，SRBSDV被划分为呼肠孤病毒科(Reoviridae)8 贵州大学2015届硕士研究生学位论文斐济病毒属(Fijivirus)的一个新种，与水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus,RBSDV)、玉米粗缩病毒(Maizeroughdwarfvirus,MRDV)和马德里约柯托病毒(MaldeRioCuartovirus,MRCV)属于同一个亚组，其中RBSDV与[8-9]SRBSDV的同源性最高，其同源性大约为70%。1.4南方水稻黑条矮缩病毒粒体特性南方水稻黑条矮缩病毒粒体呈正二十面体球状，直径介于70~75nm之间，有双层外壳，呈晶格状整齐形成透明及致密的病毒基质。1.5南方水稻黑条矮缩病基因的相关研究南方水稻黑条矮缩病的基因组由10条dsRNA片段组成(S1~S10)，目[10]前，很多地方的SRBSDV基因组全序列已经测序完毕。2008年，周国辉等通过基因测序获得了南方水稻黑条矮缩病毒海南分离物的S9和S10全序列。[11]同年，张恒木等测定了南方水稻黑条矮缩病毒广东省分离物S7、S10片段的核酸序列，并分析了它的生物学信息，根据序列比对，SRBSDV广东分离物与周国辉等报道的南方水稻黑条矮缩病毒海南分离物的序列同一率高达98~[1]99%。2010年，Wang等对SRBSDV广东分离物的基因组S1~S6的序列和SRBSDV海南分离物的基因组S1~S8的序列进行了报道。SRBSDV全基因组序列包括29124个碱基，S1~S6序列分别由4500，3815，3618，3578，3167和[9]2653个碱基组成。2012年，胡秀第通过基因克隆的方法测出了南方水稻黑条矮缩病毒的S1~S10的基因序列，再通过NCBI进行分析对比，预测结果如下：S1、S2、S3编码蛋白为主要的核心结构蛋；S5编码的蛋白可能是病毒核心衣壳蛋白的成分；S6是病毒编码的RNA沉默抑制子；S7-1编码管状结构蛋白；S8编码核心蛋白；S9-1编码病毒基质蛋白；S9-2可能是编码膜蛋白；P10为病毒的外壳蛋白。1.6南方水稻黑条矮缩病相关蛋白的功能研究[12]2005年，曹雪松等发现与SRBSDV同属且同源性相近的RBSDVP10蛋9 贵州大学2015届硕士研究生学位论文白为结构蛋白，是RBSDV外层壳蛋白的主要部分。此外，表达的RBSDVP10蛋白可以应用到抗血清制备上，可以更好地为田间检测试验提供原材料，大大地降低了经济成本。[13]2011年，Liu等研究表明SRBSDVP7-1为管状结构部分，是核定位蛋白，[14]也是一种重要的靶标蛋白。郑爱玲通过免疫荧光标记的方法标记培养细胞中病毒的P7-1蛋白，观察到P7-1表达形成的小管结构分布在细胞内部或表面，且有的小管结构横跨两个相邻的细胞，根据荧光标记和电镜切片观察的结果表明，P7-1为昆虫体内包裹病毒粒子的管状结构蛋白。[15]2011年，Wang等发现与SRBSDV同源性相近的RBSDV的非结构蛋白P6在植物细胞内可进行自身的相互作用。[16]2012年，贾东升等运用免疫共聚焦显微镜观察了RNA干扰技术干扰的SRBSDVP9-1在昆虫细胞内的表达。结果表明，SRBSDVP9-1是病毒基质的重要组分，病毒侵入宿主细胞后，在核内或质内形成的一种粗糙网状结构，是病毒基因组核酸的合成、复制部位，而当SRBSDVP9-1沉默时，病毒的组装受阻，继而影响了病毒的复制和浸染。[17]2013年，Mao等采用酵母双杂交及昆虫细胞克隆技术对SRBSDV的P5、P6及P9-1之间的相互作用进行研究，通过扫描电镜和共聚焦显微镜的观察表明，P5与P6、P6与P9-1之间有相互作用，而P5与P9-1之间没有相互作用。研究结果表明，SRBSDV的复制和组装是由P5、P6及P9-1来共同完成的，而且P6起着链接P5和P9-1的作用。[18]2013年，Li等人采用双分子荧光技术，借助共聚焦显微镜和免疫电镜观察了SRBSDVP5与P6蛋白在烟草叶片上的相互作用，然后又采用酵母双杂交技术，研究两个蛋白的互作，根据结果推断出SRBSDVP5与P6蛋白在病毒粒子形成过程中起着至关重要的作用。[19]2014年，陈卓等采用shotgun技术与Label-free技术对共感染了SRBSDV和水稻粗条病毒(RRSV)的植株进行了检测，发现除了SRBSDV的P5-2、P7-2和P9-2及RRSV的P4b、P5、P6、P8a和P8b以外，其他蛋白均能检测到，其中SRBSDV的P9-1和RRSV的P3的丰度较高，可以用来作为检测带毒的指标。[20]2014年，Mar等采用酵母双杂交技术及Co-IP免疫共沉淀的方法筛选出10 贵州大学2015届硕士研究生学位论文了能与SRBSDVP7-1相互作用的18个白背飞虱蛋白，其中有6个为重要的潜在靶标蛋白。[21]2014年，陈剑平等采用酵母双杂交技术及双分子荧光技术证明了P6蛋和P9-1的互作，并观察到在植物细胞内P9-1能独立聚集形成病毒基质结构。1.7南方水稻黑条矮缩病的防控SRBSDV属于水稻病毒病，在传统思想中，对于水稻病毒病的防治主要是“控虫防病”，就是通过杀虫剂的使用来消灭病毒传播的介体，减少病毒的危害。但是近几年经过田间试验的经验，提出了“虫病共治”、“治虱防矮”等防治方针[22-23][22-30]，在田间这些措施的实行取得了一定效果。目前对SRBSDV采取的防控措施主要以杀虫剂和抗病毒剂结合的方式，采用的抗病毒剂有：毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素等，这些抗病毒剂对SRBSDV都有一定的防效，但是由于田间试验具有一定的差异性，所以得到的防效数据都不太相同，因此，采取离体筛选的方法验证这些抗病毒剂的活性，建立离体抗病毒药剂筛选模型具有重要意义。1.8蛋白与药物相互作用方法的研究1.8.1紫外光谱法研究蛋白与药物的相互作用蛋白分子中生色基团在210nm左右为肽键的吸收峰，260~290nm是酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的吸收峰。当药物小分子与蛋白质分子发生作用后，会使蛋白质分子在结构发生一定的变化，紫外分光光度计测定时可以表现为谱峰的宽[31]度变化和峰位置位移，根据光谱信息能推测蛋白与药物小分子的结合。[32]2005年，Xie等采用紫外光谱法、荧光光谱法及红外光谱法研究了Neobiletin与人血清蛋白的相互作用。[33]2006年，Kandagal等采用紫外吸收光谱研究了药物GemcitabineHydrochloride与HAS和BSA之间的结合作用，结果表明，随着GemcitabineHydrochloride的不断加入，使得HAS和BSA蛋白的吸收峰不断增强并产生了蓝移。11 贵州大学2015届硕士研究生学位论文[34]2008年，Xu等研究了烟酰胺与BSA的相互作用，实验显示，在烟酰胺中逐渐加入不同浓度的BSA，吸光度逐渐增强，说明烟酰胺与BSA发生了一定的结合。[35]2010年，Wang等采用四种光谱法研究了双酚A与溶菌酶和胰蛋白酶的相互作用，研究表明，双酚A能使溶菌酶和胰蛋白酶的紫外吸收峰发生变化。综上所述，紫外光谱是研究蛋白与药物相互作用的一种方法，但用紫外吸收[36]光谱研究进行时，蛋白的吸收光谱有时会受到药物吸收光谱的干扰，所以通常紫外光谱与荧光光谱结合使用来研究蛋白与药物间的相互作用。1.8.2荧光光谱法研究蛋白与药物的相互作用物质吸收入射光的能量后，分子由基态变为激发态，电子从较低能级向较高能级的跃迁，而处于激发态的分子不太稳定，可以通过跃迁返回基态，在返回[37-41]基态过程中释放能量产生荧光。[42]2002年，Wendy等利用蛋白酪氨酸和苯丙氨酸的内源荧光的特性研究了钙离子与钙调蛋白的结合区域。[43]2006年，席真等通过荧光滴定的方法研究TMVCP和TMVRNA与娃儿藤碱B的相互作用，发现娃儿藤碱B对TMVCP没有作用，以TMVRNA滴定时，RNA对娃儿藤碱B产生猝灭作用，并求出了它们结合常数大小，说明了娃儿藤碱B主要作用在TMVRNA上。[44]2006年，赵宏伟等用紫外和荧光光谱法研究了Riboflavin与HAS及BSA之间的相互作用，结果发现在Riboflavin与HAS和BSA相互作用过程中，动态猝灭与静态猝灭同时存在。[45]2009年，孙艳涛等采用荧光光谱法研究了BSA与Butazone和Brufen的相互作用，研究结果显示，Butazone和Brufen均对BSA产生静态猝灭。[46]2010年，Lu等采用紫外光谱法、荧光光谱法、同步荧光光谱法和分子模拟等方法研究了诺氟沙星与胰蛋白酶的结合，分子对接和荧光结果说明了诺氟沙星-胰蛋白酶体系是通过疏水作用和氢键作用结合的，同步荧光光谱与紫外光谱的研究表明蛋白在药物的作用下发生了构象的改变。[47]2011年，吕茜茜通过荧光光谱法研究了嘌呤类药物与HAS的作用，结12 贵州大学2015届硕士研究生学位论文果表明嘌呤类药物对HAS产生静态猝灭作用。[48]2012年，陈瑛等研究了Emodin与BSA的荧光光谱变化，结果显示，Emodin对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭过程，它们的相互作用主要是静电作用。[49]2013年，徐洪亮通过荧光光谱法研究了Eupatilin与BSA的相互作用，研究结果表明，Eupatilin对BSA产生静态猝灭。[50]2014年，SibelTunc等采用四种光谱法研究了除草剂2,4-滴丙酸及敌草快与HSA的相互作用，研究结果表明，2,4-滴丙酸与HAS的亲合力大于敌草快与HAS的亲合力。[51]2014年，SamiraGholami等采用荧光光谱法结合分子对接法研究了柚皮素与β-乳球蛋白的结合特点，荧光滴定数据表明柚皮素与β-乳球蛋白形成1:1配合物，是用过氢键和vanderWaals力配合；分子对接的结果表明在β-乳球蛋白的表面形成了三个氢键与柚皮素结合。1.8.3ITC研究蛋白与药物的相互作用在所有生物体内一系列的化学反应都会伴随着热效应，对热效应的精确测定及分析，已成为热化学的主要研究内容。等温滴定量热法(IsothermalTitration[52]Calorimetry,ITC)是近年来研究分子间作用力的新方法。[53]2003年，项瑾等通过ITC和荧光滴定的方法研究了SDS与Cellulase的相互作用，经过其焓变、熵变、自由能和结合力的分析，得出SDS与Cellulase主要是通过疏水作用进行结合。[54]2006年，Meher等采用ITC方法研究了结核杆菌的分泌抗原靶标-6与7-1分泌蛋白-10之间的亲和关系，研究表明它们之间的亲和力达到2×10L·mol，由此可以采用ITC的方法来筛选与抗原靶标有高亲和力的分泌蛋白。[55]2011年，Wang等采用ITC研究了黄连素与DNA分子的相互作用，研究结果表明，体外实验黄连素分子与DNA结合的碱基数比在核染色质里结合的碱基数多100倍。[56]2012年，Wu等采用了ITC和荧光光谱等方法测定了EGCG与脂肪酶的相互作用关系，研究表明EGCG对脂肪酶有一定的抑制作用，它们之间的亲和4-1力约为2.7×10L·mol。13 贵州大学2015届硕士研究生学位论文[57]2014年，Wan等使用ITC、荧光光谱法研究了生物表明活性剂与大豆球蛋白的相互作用，说明了它们之间的表面性能及形成泡沫的规律。[58]2014年，Patil等使用ITC法研究了三种有机分子：酮咯酸、1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)及11-丹磺酰氯烷酸(DAUDA)与人肠道脂肪酸结合蛋白(hIFABP)的相互作用，研究结果表明，酮咯酸与hIFABP的解离常数为56.7μM、ANS与hIFABP的解离常数为13.3μM和DAUDA与hIFABP的解离常数为0.36μM。1.8.4MST研究蛋白与药物的相互作用微量热泳动仪(microscalethermophoresis，MST)是由德国NanoTemper技术有限公司发明的设备，它具有操作简单快捷、使用的荧光染料具有良好的选择性、样品消耗量低、可以实时获得数据且实验稳定性较好等特点。[59]2010年，Dr.Stefan和Dr.Philipp最先使用MST测定了生物溶液中蛋白-蛋白之间的相互作用。[60]2012年，Patnaik等用高通量筛选法对葡糖脑苷脂酶的分子伴侣抑制剂进行了筛选，共筛选了326,770个化合物小分子，其中发现四个小分子的抑制活性较好。然后，采用MST和荧光免疫共聚焦研究了这四个小分子与葡糖脑苷脂酶及其突变体的相互作用，研究表明，40号化合物与野生型的葡糖脑苷脂酶的作用最强，达到8.91μM，而与其突变体N370S的作用明显比与野生型葡糖脑苷脂酶的作用弱，说明N370S有可能是40号化合物与葡糖脑苷脂酶的重要靶点。[61]2012年，Shang等采用了MST研究了一系列化合物对G蛋白偶联鸟嘌呤交换因子(GEF)A蛋白的抑制作用，研究表明，化合物Y16能与LARG的DH-PH区域进行结合，其解离常数达到80nM，从而抑制了LARG与A蛋白的结合，影响A蛋白的活性和功能。[62]2013年，Immeku等采用MST研究了自己合成的一系列化合物与鸟嘌呤转糖苷酶的作用强弱，研究表明，化合物1m与鸟嘌呤转糖苷酶的结合能力最强，它的解离常数达到1.2nM。[63]2014年，Kotyrb等采用MST研究了自主合成的丙霉素A衍生物与DNA分子的相互作用。14 贵州大学2015届硕士研究生学位论文[64]2014年，Lang等采用MST研究了DNA的转录激活效应因子(TALE)Bat蛋白与DNA的结合，研究结果表明，TALEAvrBs4蛋白与Bs4C抵抗基因的Kd值为18.1nM，而与其同系序列非激活bs4C等位基因的Kd值为181.5nM。1.9本章小结SRBSDV具有传播范围广、较难防控等特点，严重威胁着我国的粮食安全。目前，关于SRBSDV关键蛋白的研究还比较少，研究者们发现P9-1为病毒的基质蛋白，能与P5、P6蛋白进行相互作用来完成病毒的复制和组装。但是，目前对P9-1的研究仅限于它在昆虫细胞和植物体内功能方面的研究，而关于抗病毒小分子与P9-1蛋白的相互作用研究并未见报道。文献报道的研究蛋白与药物相互作用的方法主要有：紫外光谱法、荧光光谱法、ITC和MST等，在报道中，紫外光谱法和荧光光谱法是研究血清蛋白与有机小分子相互作用过程中最常用的光谱学方法，它们经常结合使用，可以求出蛋白与小分子间的结合常数、结合位点数和结合方式等。而ITC和MST是通过热力学手段来研究分子间相互作用的方法，在医学上ITC多用于研究蛋白及DNA等生物大分子与药物或表面活性剂小分子的亲和关系，通过熵变和焓变的关系来求出分子间作用力的形式；MST是近年来用于研究生物大分子与小分子间相互作用的新方法，研究者们曾采用MST来进行靶标蛋白抑制剂的高通量筛选，寻找出与靶标蛋白作用最强的小分子抑制剂，其解离常数可以达到nM级别。上述的四种相互作用研究方法在医学领域屡见不鲜，但是在抗病毒小分子与SRBSDV蛋白的相互作用方面并未见报道。因此，以SRBSDV关键蛋白P9-1为靶标蛋白，采用紫外光谱法、荧光光谱法、ITC及MST来研究P9-1与抗病毒小分子的相互作用关系，寻找与P9-1蛋白具有高亲和力的抗病毒化合物，建立以P9-1为靶标蛋白的药物筛选模型，可以作为离体基础上进行抗SRBSDV药物筛选的发展方向。15 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第二章研究路线设计2.1研究目的和意义SRBSDVP9-1为病毒的基质蛋白，在病毒RNA的复制及组装过程中起着重要作用。本论文以SRBSDVP9-1蛋白作为潜在的靶标蛋白，以抗病毒化合物为配体小分子，进行蛋白和小分子的相互作用研究。采用紫外光谱法、荧光光谱法、ITC、MST等方法来研究抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的相互作用关系，目的是通过几种方法的相互结合及佐证，建立一个抗SRBSDV的药物离体筛选模型，为寻找高效的抗SRBSDV的化合物奠定一定基础。2.2拟解决的主要问题以SRBSDVP9-1为潜在的靶标蛋白，采用紫外光谱法、荧光光谱法、ITC及MST4种方法来研究抗病毒小分子与P9-1的相互作用关系，关键是要通过4种方法得到抗病毒小分子与P9-1的亲和力大小，并且要用4种方法进行相互佐证，最终寻找到与P9-1蛋白具有高亲和力的抗病毒小分子，建立以P9-1为潜在靶标蛋白的抗SRBSDV药物筛选平台。2.3研究内容1.对含有SRBSDVP9-1基因的质粒进行转化和表达，通过蛋白亲和层析系统对SRBSDVP9-1蛋白进行纯化。2.通过紫外光谱法研究抗病毒小分子毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、盐酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1的相互作用关系。3.通过荧光光谱法研究抗病毒小分子毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、盐酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1的相互作用关系。4.通过ITC研究抗病毒小分子毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、盐酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1的相互作用关系。5.通过MST研究抗病毒小分子毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、盐16 贵州大学2015届硕士研究生学位论文酸吗啉胍、嘧肽霉素、病毒唑与SRBSDVP9-1的相互作用关系。6.通过荧光定量PCR检测活体里面的S9-1的基因表达量，验证毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖的药效大小。7.通过荧光光谱法和ITC研究毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1的相互作用关系。2.4技术路线17 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第三章材料与方法3.1实验材料3.1.1质粒与表达菌株含有SRBSDVP9-1基因片段的pET28a-DH5α质粒由本课题组李向阳老师提供；BL21(DE3)RIL株系购于Takara公司。3.1.2供试蛋白和抗植物病毒小分子SRBSDVP9-1由本实验室表达和纯化；毒氟磷由广西田园提供；宁南霉素由四川成都生物所馈赠；其余商品化抗病毒药物购自于各自的公司；毒氟磷衍生物由本实验室自主合成。3.1.3实验试剂表3-1实验所用试剂Tab.3-1Theagentsforexperiment试剂名称生产厂家EDTA宝生物(大连)工程有限公司BL21(DE3)RIL宝生物(大连)工程有限公司Tris宝生物(大连)工程有限公司牛血清白蛋白北京鼎国生物科技有限公司胰蛋白胨宝生物(大连)工程有限公司酵母粉宝生物(大连)工程有限公司IPTG生工生物工程股份有限公司硫酸卡那霉素生工生物工程股份有限公司咪唑生工生物工程股份有限公司溴酚蓝北京索莱宝科技有限公司Tris北京索莱宝科技有限公司18 贵州大学2015届硕士研究生学位论文Tween-20北京索莱宝科技有限公司二甲基亚砜成都金山化学试剂有限公司考马斯亮兰G-250美国Biora公司考马斯亮兰G-250科密欧有限公司NaCl天津市优谱化学试剂有限公司NaH2PO4天津市优谱化学试剂有限公司Na2HPO4天津市优谱化学试剂有限公司3.1.4主要仪器设备移液器，德国Eppendorf，(0.1-2.5μL)；移液器，德国Eppendorf，(0.5-10μL)；移液器，德国Eppendorf，(2-20μL)；移液器，德国Eppendorf，(20-200μL)；移液器，德国Eppendorf，(100-1000μL)；AKTApurifier蛋白纯化系统，美国GEhealth，purifier10；碎冰机，日本三洋SANYO，SZM-F140；超纯水制备，美国Millipore，Mill-Q；酶联检测仪，美国Bio-Rad，Bio-Rad680；电泳凝胶成像系统，美国Bio-Rad，GelDoc2000；真空泵，上海亚荣生化仪器厂，SHZIII；高速冷冻离心机，日本Hitachi，HITACHICR10MX；等温滴定量热仪，美国GEhealth，ITC200；pH计，上海大普，PHSJ-4A；分析天平，德国Sartorius，BS123S；高温烘箱，上海博讯实业有限公司，GZX-9146MBE；冷藏柜，青岛海尔集团，SC-316；荧光光谱仪，美国HORIBA，FluoroMax-4微量热泳动仪，德国Thermo，NanoTemperMonolithNT.11519 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3.1.5主要缓冲溶液的配制方法LB固体培养基(1L)：10g胰蛋白胨，5g细菌用酵母提取物，10gNaCl，10g琼脂粉，二次水1000mL，PH7.4，121℃灭菌20min；LB液体培养基(1L)：10g胰蛋白胨，5g细菌用酵母提取物，10gNaCl，PH7.4，二次水1000mL，121℃灭菌20min；0.2M磷酸缓冲液PH7.4配制(1L)：称取NaH2PO4·2H2O10.06g，Na2HPO4·12H2O48.54g，加入800mL二次水，调PH＝7.4，定容至1000mL；2×SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液(10mL)：称取SDS0.4g，溴酚蓝0.1mg，0.5MTris-HCl(PH6.8)2.5mL，甘油2.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，二次水5.2mL；5×TGB电泳缓冲液：称取Tris15.1g，Gly94g，SDS5.0g，加入约800mL的二次水，搅拌溶解，定容至1L，室温保存。结合缓冲溶液(bufferA)：50mMPBS，150mMNaCl，20mMImidazole，PH7.4；洗脱缓冲溶液(bufferB)：50mMPBS，150mMNaCl，300mMImidazole，PH7.4；分子筛缓冲溶液：10mMPBS，150mMNaCl，PH7.4；裂解缓冲溶液：50mMPBS，150mMNaCl，1%β-巯基乙醇，PH7.4。3.2实验方法与步骤3.2.1含P9-1重组质粒pET28a的转化3.2.1.1BL21(DE3)RIL感受态细胞的制备1)从新活化平板中挑取单克隆菌落并接种到100mLLB中，37℃，200rpm摇床培养至OD600=0.35左右；2)冰浴10min；3)4℃，4200rpm，20min收集菌体细胞；4)用30mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细胞；20 贵州大学2015届硕士研究生学位论文5)4℃，4200rpm，10min收集菌体细胞；6)用已制备好的2mL，4℃预冷的0.02MCaCl2-0.08MMgCl2溶液重悬细胞；对重悬的细胞进行分装，置于-80℃保存。3.2.1.2重组质粒的转化1)在超净工作台无菌条件下吸取2µL的pET28a质粒加入100µL感受态细胞BL21(DE3)RIL中；2)冰浴30min；3)42℃热激70~90s；4)冰浴2min；5)向BL21(DE3)RIL感受态细胞中加入900µL含有卡那抗生素的LB培养基中；6)150rpm，37℃摇床培养45min；7)4000rpm离心5min，弃900µL上清，重悬菌体，取100µL菌液涂于平板上，并在培养皿上标记为pET28a-SRBSDV9-1-BL21(DE3)RIL；8)将其放入37℃培养；3.2.1.3转化菌株的验证1.用细菌DNA试剂盒进行提取对转化菌株的DNA进行提取。2.对提取的DNA进行PCR扩增反应:1)根据文献报道，采用SRBSDV9-1引物对提取的DNA进行PCR扩增，引物序列如下：Primerup:5ˊ—GGAATTCCATATGGCAGACCTAGAGCGTAGAA—3ˊPrimerdown:5ˊ—CCGCTCGAGTCAAACGTCCAATTTAAGTGAAGAA—3ˊ(以上引物由上海生工生物有限公司合成)2)扩增条件本课题组摸索的扩增条件进行：表3-2PCR的反应体系名称体积(μL)Primer11Primer2121 贵州大学2015届硕士研究生学位论文DNA模板1Taq酶0.35×PCRbuffer5dNTP(10mM)2ddH2O14.7总计25Tab.3-2PCRreactionsystemPCR反应条件为：94℃预变性5min后，进行35个循环，分别是94℃变性30s，58℃退火2min，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min。3.2.2SRBSDVP9-1的表达1)在单克隆的平板上挑取单克隆体pET28a-SRBSDV9-1-BL21(DE3)RIL，加入到10mLLB液体培养基(含30ng/mL卡那)中，37℃，200rpm摇床培养过夜；2)当测OD600=0.65时，加入1MIPT，放入16℃，200rpm摇菌16h；3)离心收集菌液；4)冲溶液，冰上重悬30min，使用超声仪进行超声破碎，超声条件：35%power，超声10s停10s，连续超声35min；5)将超声好的液体装入离心管中，4℃，12,000rpm离心30min，取上清，保留10µL上清液进行12%SDS-PAGE蛋白胶电泳检测；3.2.3SRBSDVP9-1的纯化1)首先将配制的溶液包括分子筛缓冲溶液、结合缓冲溶液及洗脱缓冲溶液等用0.22µm膜进行过滤，并超声除气泡；2)用20%的乙醇清洗蠕动泵，再用ddH2O清洗泵，清洗完后用BufferA平衡Ni柱，取离心得到的蛋白上清液过Ni柱。3)用蛋白亲和层析系统对蛋白进行纯化，系统的操作步骤如下：4)20%的乙醇洗纯化系统：开机，点开Unicon，选Default，Ok，Clearall；首先将吸头放入20%乙醇中，点击Mannul，pump，pumpwashbasic，pumpAon，pumpBon，洗完后点击Pump，flow，3mL/min，Insert，Excute，洗到紫外检测线平直，UV变化0.5以内)22 贵州大学2015届硕士研究生学位论文5)洗完后用ddH2O洗纯化系统，操作同上。6)用bufferA进行平衡，当紫外检测线平直时改流速为1mL/min，上Ni柱，点击Run，走纯化程序(注意要设置压力范围，柱压不大于0.35MPa)，接出峰位置的蛋白。7)用Millipore-10KD超滤管浓缩蛋白，浓缩的蛋白体积小于2mL时。8)脱盐柱对蛋白进行脱盐：9)脱盐前先用SECbuffer洗系统，操作同乙醇洗的步骤，然后点击Flowpath，Insert，Excute，用注射器打入SECbuffer2mL，设流速为3mL/min，Insert，Excute。洗完以后用SECbuffer平衡脱盐柱直至基线平直，将浓缩好的蛋白液注入系统内，走脱盐程序，接出峰位置的蛋白，用超滤管对蛋白进行浓缩至体积小于2mL。10)分子筛凝胶柱对蛋白进行分离：11)首先用SECbuffer平衡SEC柱子一个柱体积(120mL)，设流速为0.5mL/min，平衡好后将浓缩的蛋白注入系统内，走SEC程序，接出峰位置蛋白。3.2.4SRBSDVP9-1的验证采用SDS-PAGE对纯化的蛋白样品进行跑胶验证，电泳胶的配方见表3-1。电泳步骤如下：向1mL2×SDS上样缓冲液中加入2µLDTT，将蛋白液与2×SDS上样缓冲液以1:1的体积混合后，100℃水浴10min，上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶条件为80V，20min；分离胶条件为120V，约80min，电泳完成后用考马斯亮蓝染色液进行蛋白胶的染色，并用考马斯亮蓝脱色液进行脱色，观察条带分子量大小。表3-312%SDS-PAGE电泳胶的配制Tab.3-3Theformulaof12%SDS-PAGEelectrophoresisgel溶液组分分离胶(10mL)浓缩胶(5mL)水/mL3.3230%丙烯酰胺溶液/mL42.51.5MTris(pH8.8)/1.02.50.523 贵州大学2015届硕士研究生学位论文Tris(pH6.8)/mL10%过硫酸铵/mL0.10.0310%SDS/mL0.10.03TEMED/mL0.0040.0033.2.5通过高分辨质谱仪鉴定SRBSDVP9-1目的蛋白1)将蛋白胶块切成1立方毫米左右的小块，装入Eppendorf离心管中；2)用50%ACN(乙腈)/100mMNH4HCO3(pH8.0)将小胶块浸洗10min，反复3次，最后吸去洗液；3)用SpeedVac将胶块抽干；4)将蛋白胶块浸入10mMDTT/50mMNH4HCO3(PH8.0)中，温育1h(温度逐渐有梯度地升高到56℃)，之后再吸去浸液；5)将蛋白胶块浸入55mMIodoacetamide/50mMNH4HCO3(PH8.0)中，于室温下在暗室中温育30min，之后吸去浸液；6)将胶块用100mL10mMNH4HCO3浸洗10min，吸去NH4HCO3溶液后，再用100mLACN浸洗10min；7)将胶块用100mL10mMNH4HCO3浸洗10min，吸去NH4HCO3溶液后，再用100mLACN浸洗10min，吸去上清液，用SpeedVac将胶块抽干5min；8)向装有胶块的Eppendorf管中加入5mL稀释后的Promegatrypsin酶液，让酶液浸没胶块(酶的量按蛋白量的1/50来加入)；9)加入足量的10mMNH4HCO3溶液以淹没吸胀的胶块；10)37℃温育过夜；11)加入等体积的60%乙腈/5%甲酸水，超声波振荡10min，达到抽提的效果。20,000g离心40min，收集并保存上清液，向剩下的胶块再加入约等体积的60%乙腈/5%甲酸水（操作同上）；12)把收集保存的上清液抽干；13)溶于30μL0.1%的甲酸水，上质谱。24 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3.2.6SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究3.2.6.1荧光光谱研究SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用荧光光谱方法：采用HORIBAFluoroMax-4荧光光谱仪进行测定，对SRBSDVP9-1蛋白的最佳荧光激发波长进行筛选，已知蛋白的特征紫外吸收范围为260~290nm左右，因此分别采用260、265、270、275及280nm的激发波长对蛋白的最佳激发参数进行筛选。配制10µMSRBSDVP9-1蛋白液(蛋白液的溶剂为10mMPBS,150mMNaCl，PH7.4)，依次加入不同体积的母液浓度为2mM抗病毒小分子溶液(用乙醇溶解)，设置仪器参数为：激发波长275nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，测量在不同抗病毒小分子作用下蛋白荧光峰的变化。荧光光谱仪的操作步骤如下：1)打开显示器电脑主机，开仪器；2)打开软件，点击―M‖，选择―spectrum‖,―emissionspectrum‖；3)点击―Monor‖，设置波长范围为295~400nm，激发和发射狭缝为5nm；4)点击―Detector‖选择―S1‖，点击―Correction‖，―Darkoffset‖，选择―S1c‖，点击―Run‖。3.2.6.2紫外光谱法研究SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用紫外吸收光谱方法：运用TU-1900型紫外-可见分光光度计对蛋白体系、药物体系及蛋白-药物体系进行检测。选用SRBSDVP9-1蛋白的浓度为20µM，药物浓度与蛋白浓度相同，以PBS空白溶液作为参比，在298K下测定SRBSDVP9-1蛋白、抗病毒小分子及SRBSDVP9-1蛋白-抗病毒小分子体系的紫外吸收光谱，扫描范围为200~400nm。紫外光谱法的操作步骤如下：1)配制蛋白样品、药物样品和药物-蛋白样品；2)打开显示器，开电脑主机，稳压器及仪器电源；3)打开软件，进行仪器初始化，点击光谱扫描；4)在样品槽里放入缓冲液，点击―P‖进行波长设置；5)设置好波长范围后点击―基线‖进行基线扣除；25 贵州大学2015届硕士研究生学位论文6)扫描完基线后即可开始检测。3.2.6.3ITC研究SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用样品制备：水溶性抗病毒小分子直接用PBS缓冲液(10mMPBS，150mMNaCl，PH7.4)溶解，不水溶的抗病毒小分子先用DMSO溶解为母液，再用PBS稀释，保证DMSO最终的体积含量不超过药液总体系的5%；蛋白的缓冲液与溶解小分子的缓冲液保持一致。蛋白浓度选择10~20µM，抗病毒小分子浓度先以蛋白浓度的10~20倍进行滴定，逐步摸索最佳滴定条件。ITC条件：反应温度25℃，总注射次数20次，参照功率5μcal/s，搅拌器转速750rpm/min。ITC的操作方法：1)清洗Pipette及Cell，点击―cellandsyringewash‖；2)拿玻璃注射器吸取350μL样品，赶出气泡；3)将注射器对准样品孔，慢慢插入，轻触底部后抬起1mm；4)用手稳住针筒，缓慢推入样品直至溢出样品池孔，慢慢吸取少量样品并快速推出，重复几次以赶出样品池内气泡；5)以同样的方法在参照池内加入水或Buffer；6)将装有60~100μL的药品试管放入试管槽内，在软件中选择―SyringeFill‖，按照提示将Pipette置于RestPosition位置，将连接与Pipette相连，点击―OK‖；7)当注射器加满药品后，将连接头旋出，把Pipette插入样品池内，点击―OK‖；8)编辑参数，点击―Start‖开始检测。3.2.6.4MST研究SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用采用MonolithNT.115微量热泳动仪对毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖等抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的相互作用进行研究，分别将药物配成12个不同浓度的药液(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49及0.24μM)，配制好的药物与荧光染料标记的20μMP9-1蛋白进行孵育，设定仪器参数为：LEDpower50%，Laserpower40%，Red光激发。26 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3.2.7活体实验1.水稻样本获得：将饲养的白背飞虱成虫接在从云南施甸采集回来的感染SRBSDV的水稻上饲毒，待其产生若虫(二龄)后，将白背飞虱转移至两叶一心的健康水稻苗上，进行群体接毒48h，吸出白背飞虱，将传毒后的苗放置于人工气候室内，7d左右，喷施毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖和氨基寡糖，喷施药剂的浓度为500µg/mL，隔1,3,5,7d采集水稻样本，将采集的样本冻存于-80℃冰箱里备用。2.水稻样本RNA的提取：参照Takara的RNA提取试剂盒的方法进行RNA的提取。3.反转录:反转录条件如下：取RNA1µL,DEPC水5.125µL,OligodT(18)1µL,70℃水浴10min，冰上至少冷却2min；然后再加入以下组分：5×M-MVBuffer2µL，d-NTPMixture0.5µL，RNaseInhabitor0.125µL，RNaseM-MLV(RNaseH-)0.25µL，42℃保温1h，70℃保温15min。冰上冷却，得到cDNA。4.RT-qPCR测定SRBSDV基因相对表达量：®II利用SYBRPremixExTaq荧光试剂盒进行RT-qPCR(Real-timefluorescencequantitativePolymeraseChainReaction)，内参基因使用水稻rRNA18S基因，目的基因为SRBSDVS9-1基因(AACGACCAACCAACAAGA-F，®IIGTTCCATCAATGAGGTAGTTC-R)；反应条件为：SYBRPremixExTaq10µL，S9-1/S18-R1µL，S9-1/S18-F1µL，Template(cDNA)1µL，H2O7µL；qPCR反应程序：95℃30s,95℃30s,60℃30s,40个循环。27 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第四章结果与讨论4.1SRBSDVP9-1蛋白的表达与纯化4.1.1SRBSDVP9-1重组质粒的转化用BL21(DE3)RIL感受态细胞对含有SRBSDVS9-1片段的质粒进行转化，在含有卡那抗生素的平板上长出了单克隆菌株，说明转化实验成功，如图4-1。图4-1SRBSDVP9-1重组质粒的转化Fig.4-1ThetransformationofSRBSDVP9-1recombinantplasmid由图4-1可以看出，在含卡那抗生素的LB固体平板上长出了单克隆菌落，说明转化实验成功。4.1.2SRBSDVP9-1的转化验证对转化的菌株进行DNA的提取，并对SRBSDVS9-1片段进行PCR扩增，通过PCR对转化的菌株进行验证，PCR的电泳结果见图4-2，对PCR结果进行切胶回收测序，测序比对结果见图4-3。28 贵州大学2015届硕士研究生学位论文1000bp图4-2SRBSDV9-1片段的验证图4-3SRBSDV9-1的比对结果Fig.4-2TheverificationofSRBSDV9-1geneFig.4-3TheblastresultofSRBSDV9-1gene由图4-2可以看出，通过PCR进行扩增的片段在1000bp左右，与目的片段相符；由图4-3可以看出，经过PCR扩增的序列与SRBSDV9-1的同源性达到86%，说明含SRBSDV9-1的重组质粒转化成功。4.1.3SRBSDVP9-1的诱导表达及纯化对转化的菌株进行诱导表达，诱导条件为16℃，0.5mMIPTG，180rpm诱导16小时，然后将大量诱导表达的蛋白进行纯化，纯化结果如图4-4所示，纯化时收集出峰位置的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图4-5。20140714liujingchunhua175Gly001:10_UV20140714liujingchunhua175Gly001:10_Cond20140714liujingchunhua175Gly001:10_Flow20040723dySRBSDVp91DESALTINGNoble002:10_UV20040723dySRBSDVp91DESALTINGNoble002:10_Cond20040723dySRBSDVp91DESALTINGNoble002:10_Flow20140714liujingchunhua175Gly001:10_Logbook20040723dySRBSDVp91DESALTINGNoble002:10_LogbookmAUmAU300A1000B2508002006001504001002005000-50-200020406080100120140ml0.05.010.015.020.025.0ml图4-4SRBSDV9-1的纯化及脱盐Fig.4-4ThepurificationofSRBSDV9-1protein29 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-5SRBSDV9-1的SDS-PAGE电泳Fig.4-5theSDS-PAGEofSRBSDV9-1protein由图4-4(A)可知，蛋白在40mL左右出峰，且只有一个单峰，说明蛋白纯化成功，由图4-4(B)可知，蛋白峰和盐峰完全分开，说明蛋白成功脱盐；由图4-5可知，图中的条带在35kDa~45kDa，符合目标蛋白的分子量(40kDa)，而且其条带单一，说明获得了比较纯的SRBSDVP9-1蛋白。4.1.4SRBSDVP9-1的高分辨质谱鉴定通过高分辨质谱对纯化的SRBSDVP9-1进行鉴定，结果如表4-1所示。表4-1SRBSDVP9-1的高分辨质谱鉴定Tab.4-1TR-SRBSDVP9-1wascharacterizedbyHRMS编总计肽段%序列号名称物种肽段(95%)号数Cov1231.8889.6gi|404434740P9-1[SouthernriceSouthernrice195black-streakeddwarfblack-streakeddwarfvirus]virus215.4977gi|336454483S9-2[SouthernriceSouthernrice13black-streakeddwarfblack-streakeddwarfvirus]virus3198.6395.4gi|379995844p9-1[SouthernriceSouthernrice196black-streakeddwarfblack-streakeddwarfvirus]virus由表4-1可知，经过质谱鉴定得到的肽段序列与NCBI网上提交的SRBSDVP9-1的肽段序列(gi|404434740)的同源性可达89.6%，说明纯化得到的蛋白就是SRBSDVP9-1蛋白。30 贵州大学2015届硕士研究生学位论文4.2SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的相互作用研究4.2.1SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的荧光光谱研究4.2.1.1SRBSDVP9-1蛋白荧光光谱条件的筛选采用不同的激发波长260、265、270、275、280nm对P9-1的荧光条件进行筛选，SRBSDVP9-1的浓度为10μM，结果见图4-6。图4-6SRBSDVP9-1蛋白荧光条件的筛选Fig.4-6ChoiceforSRBSDVP9-1fluorescencespectrumcondition由图4-6可知，当激发波长为275nm，激发和发射狭缝均为5nm时，峰强度和峰型都较其他激发波长的峰型完整，因此蛋白的最佳激发波长为275nm，激发和发射狭缝为5nm。4.2.1.2SRBSDVP9-1蛋白与毒氟磷的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与毒氟磷的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，毒氟磷的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的毒氟磷的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-7所示。31 贵州大学2015届硕士研究生学位论文4000000a3500000300000025000002000000i15000001000000Fluorescenceintensity5000000280300320340360380400Wavelength(nm)图4-7SRBSDVP9-1与毒氟磷的荧光光谱Fig.4-7FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withdufulin-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/Ldufulin,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-7可以看出，随着毒氟磷的浓度增加，SRBSDVP9-1的荧光强度逐渐减弱，说明毒氟磷对SRBSDVP9-1产生了荧光猝灭。不管哪种猝灭，其相互作用都遵循Stern-Volmer方程:F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q](4-1)式中，F0表示SRBSDVP9-1未加入药物时的荧光强度；F表示SRBSDVP9-1与药物(毒氟磷)作用后的荧光强度；[Q]为药物(毒氟磷)浓度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；Ksv为Stern-Volmer猝灭常数；一般荧光猝灭剂对10-1-1蛋白质最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0×10L·mol·s；τ0为未存在药物-8(毒氟磷)时荧光分子的平均荧光寿命，一般情况荧光寿命τ0约为10s。药物与蛋白之间相互作用的猝灭常数可通过式(4-1)，以猝灭数据F0/F对药物(毒氟磷)浓度[Q]作图得到，图中直线的斜率即为Ksv。区分药物(毒氟磷)对SRBSDVP9-1分子的荧光猝灭是静态猝灭还是动态猝灭，可以通过猝灭速率常数Kq来1010判断，当Kq≥2.0×10时，药物对蛋白分子产生的猝灭为静态猝灭；当Kq≥2.0×10时，药物对蛋白分子产生的猝灭为动态猝灭。由图4-8可以得出Ksv，根据Ksv=12Kqτ0计算出毒氟磷对SRBSDVP9-1的Kq=4.43×10，所以毒氟磷对SRBSDVP9-1产生的猝灭为静态猝灭。32 贵州大学2015届硕士研究生学位论文1.51.41.31.2F0/F1.11.0-202468101214161820[Q]图4-8毒氟磷与SRBSDVP9-1作用的Stern-Volmer曲线Fig.4-8TheStern-VolmerplotofdufulineffectonSRBSDVP9-1[75]对于静态淬灭，可应用对数方程获得结合常数以及结合位点数：lg(F0−F)/F=lgKa+nlg[Q](4-2)式4-2中，F0、F及[Q]的表示与式4-1相同，Ka为药物与SRBSDVP9-1蛋白的结合常数，n为药物与SRBSDVP9-1的结合位点数。以猝灭数据lg(F0−F)/F对lg[Q]作图(图4-9)，得到的斜率即为n，截距为lgKa。由图4-9可以得5出毒氟磷与SRBSDVP9-1的结合常数Ka=1.51×10及结合位点数n=1.09。-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0Log[(F0-F)/F]-1.2-1.4-5.8-5.6-5.4-5.2-5.0-4.8-4.6Log[Q]图4-9毒氟磷与SRBSDVP9-1作用的对数方程曲线Fig.4-9Plotsoflg(F0−F)/Fversuslog[Q]fordufulinquenchingeffectonSRBSDVP9-1fluorescence4.2.1.3SRBSDVP9-1蛋白与宁南霉素的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与宁南霉素的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，宁南霉素的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的宁南霉素的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-10所示。33 贵州大学2015届硕士研究生学位论文3500000a300000025000002000000i1500000intensity10000005000000280300320340360380400wavelength(nm)图4-10SRBSDVP9-1与宁南霉素的荧光光谱Fig.4-10FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withningnanmycin-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/Lningnanmycin,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-10可以看出，随着宁南霉素浓度的增加，SRBSDVP9-1的荧光强度逐渐减弱，说明宁南霉素对SRBSDVP9-1产生了荧光猝灭，采用Stern-Volmer方程F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]，以F0/F对宁南霉素浓度[Q]作图(见图4-11)，得到直线的斜率即为Ksv。根据图4-11得出宁南霉素与SRBSDVP9-1作用的Ksv，采用Stern-Volmer方程式Ksv=Kqτ0计算出宁南霉素对SRBSDVP9-1的1110猝灭速率常数Kq=8.52×10﹥2.0×10，所以宁南霉素对SRBSDVP9-1产生的猝灭为静态猝灭。1.401.351.301.251.20F0/F1.151.101.051.000.95010203040[Q]图4-11宁南霉素与SRBSDVP9-1作用的Stern-Volmer曲线Fig.4-11TheStern-VolmerplotofningnanmycineffectonSRBSDVP9-1对于静态淬灭，采用用对数方程lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q](式4-2)，以猝灭数据lg(F0−F)/F对lg[Q]作图(图4-12)，得到的斜率即为n，截距为lgKa。由34 贵州大学2015届硕士研究生学位论文4图4-12可以得出宁南霉素与SRBSDVP9-1的结合常数Ka=5.60×10及结合位点数n=1.19。-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2Log[(F0-F)/F]-1.4-1.6-1.8-5.4-5.2-5.0-4.8-4.6-4.4-4.2Log[Q]图4-12毒氟磷与SRBSDVP9-1作用的对数方程曲线Fig.4-12Plotsoflg(F0−F)/Fversuslog[Q]forningnanmycinquenchingeffectonSRBSDVP9-1fluorescence4.2.1.4SRBSDVP9-1蛋白与香菇多糖的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与香菇多糖的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，香菇多糖的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的香菇多糖的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-13所示。4000000a3500000300000025000002000000i15000001000000FlourescenceIntensity5000000280300320340360380400Wavelength(nm)图4-13SRBSDVP9-1与香菇多糖的荧光光谱Fig.4-13FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withlentinan-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/Llentinan,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-13可以看出，随着香菇多糖浓度的增加，SRBSDVP9-1的荧光强度逐渐减弱，说明香菇多糖对SRBSDVP9-1产生了荧光猝灭，采用Stern-Volmer方程F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqt0[Q](式4-1)，以F0/F对香菇多糖浓度[Q]作图(见图4-14)，得到直线的斜率即为Ksv，根据Stern-Volmer方程式Ksv=Kqτ0计算35 贵州大学2015届硕士研究生学位论文1210出香菇多糖对SRBSDVP9-1的猝灭速率常数Kq=2.49×10﹥2.0×10，所以香菇多糖对SRBSDVP9-1产生的猝灭为静态猝灭。1.51.41.31.2F0/F1.11.0-202468101214161820[Q]图4-14香菇多糖与SRBSDVP9-1作用的Stern-Volmer曲线Fig.4-14TheStern-VolmerplotoflentinaneffectonSRBSDVP9-1对于静态淬灭，采用用对数方程lg(F0−F)/F=lgKa+nlg[Q](式4-2)，以猝灭数据lg(F0−F)/F对lg[Q]作图(图4-15)，得到的斜率即为n，截距为lgKa。由4图4-15可以得出香菇多糖与SRBSDVP9-1的结合常数Ka=4.78×10及结合位点数n=1.07。-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0lg[(Fo-F)/F]-1.2-1.4-1.6-5.8-5.6-5.4-5.2-5.0-4.8-4.6lg[Q]图4-15香菇多糖与SRBSDVP9-1作用的对数方程曲线Fig.4-15Plotsoflg(F0−F)/Fversuslog[Q]forlentinanquenchingeffectonSRBSDVP9-1fluorescence4.2.1.5SRBSDVP9-1蛋白与氨基寡糖的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与氨基寡糖的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，氨基寡糖的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的氨基寡糖的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-16所示。36 贵州大学2015届硕士研究生学位论文a40000003000000i2000000intensity10000000280300320340360380400wavelength(nm)图4-16SRBSDVP9-1与氨基寡糖的荧光光谱Fig.4-16FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withaminooligosaccharin-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/Laminooligosaccharin,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-16可以看出，随着氨基寡糖浓度的增加，SRBSDVP9-1的荧光强度逐渐减弱，说明氨基寡糖对SRBSDVP9-1产生了荧光猝灭，采用Stern-Volmer方程F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q](式4-1)，以F0/F对氨基寡糖浓度[Q]作图(见图4-17)，得到直线的斜率即为Ksv，根据Stern-Volmer方程式Ksv=Kqτ0计算1310出氨基寡糖对SRBSDVP9-1的猝灭速率常数Kq=3.20×10﹥2.0×10，所以氨基寡糖对SRBSDVP9-1产生的猝灭为静态猝灭。1.71.61.51.41.3F0/F1.21.11.0-202468101214161820[Q]图4-17氨基寡糖与SRBSDVP9-1作用的Stern-Volmer曲线Fig.4-17TheStern-VolmerplotofaminooligosaccharineffectonSRBSDVP9-1-0.2-0.4-0.6lg[(F0-F)/F]-0.8-1.0-5.8-5.6-5.4-5.2-5.0-4.8-4.6lg[Q]37 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-18氨基寡糖与SRBSDVP9-1作用的对数方程曲线Fig.4-18Plotsoflg(F0−F)/Fversuslg[Q]foraminooligosaccharinquenchingeffectonSRBSDVP9-1fluorescence4.2.1.5SRBSDVP9-1蛋白与病毒唑的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与病毒唑的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，病毒唑的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的病毒唑的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-19所示。40000003500000a3000000250000020000001500000i1000000Fluroescenceintensity5000000-500000280300320340360380400wavelength(nm)图4-19SRBSDVP9-1与病毒唑的荧光光谱Fig.4-19FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withribavirin-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/Lribavirin,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-19可以看出，随着病毒唑的浓度增加，SRBSDVP9-1的荧光光谱基本无变化，说明病毒唑对SRBSDVP9-1的荧光分子没有猝灭作用。4.2.1.6SRBSDVP9-1蛋白与盐酸吗啉胍的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与盐酸吗啉胍的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，盐酸吗啉胍的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的盐酸吗啉胍的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-20所示。38 贵州大学2015届硕士研究生学位论文18000001600000a140000012000001000000800000i600000400000Fluroescenceintensity2000000-200000280300320340360380400wavelength(nm)图4-20SRBSDVP9-1与盐酸吗啉胍的荧光光谱Fig.4-20FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withMoroxydinehydrochloride-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/LMoroxydinehydrochloride,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-20可以看出，随着盐酸吗啉胍的浓度增加，SRBSDVP9-1的荧光光谱基本无变化，说明盐酸吗啉胍对SRBSDVP9-1的荧光分子没有猝灭作用。4.2.1.7SRBSDVP9-1蛋白与嘧肽霉素的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与嘧肽霉素的相互作用进行研究。选取蛋白的浓度为10μM，嘧肽霉素的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的嘧肽霉素的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-21所示。5000000a400000030000002000000i1000000Fluroescenceintensity0280300320340360380400wavelength(nm)图4-21SRBSDVP9-1与嘧肽霉素的荧光光谱Fig.4-21FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withCytosinpeptidemycin-6-6(a)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof-62.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18×10mol/LCytosinpeptidemycin,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-21可以看出，随着嘧肽霉素的浓度增加，SRBSDVP9-1的荧光光谱基本无变化，说明嘧肽霉素对SRBSDVP9-1的荧光分子没有猝灭作用。39 贵州大学2015届硕士研究生学位论文表4-2抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的荧光实验结果Tab.4-2FlourescencedataofantiviralmoleculewithSRBSDVP9-1-1-1-12药物名称Kq/mol·s·LKa/molnR114宁南霉素8.52×105.60×101.190.98124香菇多糖2.49×104.78×101.070.98125毒氟磷4.43×101.51×101.090.98133氨基寡糖3.20×105.60×100.840.98病毒唑无结合盐酸吗啉胍无结合嘧肽霉素无结合7种抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的荧光光谱实验结果见表4-2。由表4-2可以看出宁南霉素、毒氟磷、香菇多糖及氨基寡糖与SRBSDVP9-1的结合常数4543-1分别为：5.60×10、1.51×10、4.78×10和5.60×10mol，它们对SRBSDVP9-1的荧光光谱表现出规律性的猝灭，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素对SRBSDVP9-1蛋白没有产生荧光猝灭，因此不能计算其结合常数。通过荧光光谱法研究结果表明，在这7种抗病毒剂中对SRBSDVP9-1荧光产生猝灭的有4个，其中毒氟磷与P9-1的结合力最强，宁南霉素和香菇多糖次之，氨基寡糖的结合力最弱。4.2.2SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的紫外光谱研究为了进一步确认抗病毒小分子(毒氟磷、宁南霉素等)对SRBSDVP9-1的荧光猝灭机制，采用紫外光谱法研究了抗病毒小分子-SRBSDVP9-1体系的变化，实验结果如图4-22~4-28所示。40 贵州大学2015届硕士研究生学位论文SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+DufulinDufulin2.52.01.51.0intensity0.50.0-0.5200250300350400Wavelength/nm图4-22SRBSDVP9-1、毒氟磷-SRBSDVP9-1及毒氟磷的紫外吸收光谱-5-1Fig.4-22UVspectrumofSRBSDVP9-1,Dufulin-SRBSDVP9-1system,Dufulin；(CDufulin=2.0×10mol·L,-5-1CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+NingnanmycinNingnanmycin2.52.01.51.0intensity0.50.0-0.5200250300350400Wavelength/nm图4-23SRBSDVP9-1、宁南霉素-SRBSDVP9-1及宁南霉素的紫外吸收光谱Fig.4-23UVspectrumofSRBSDVP9-1,Ningnanmycin-SRBSDVP9-1system,Ningnanmycin；(CNingnanmycin=-5-1-5-12.0×10mol·L,CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-1SRBSDVP9-1+lentinan3.0lentinan2.52.01.51.0intensity0.50.0200250300350400Wavelength/nm图4-24SRBSDVP9-1、香菇多糖-SRBSDVP9-1及香菇多糖的紫外吸收光谱-5-1Fig.4-24UVspectrumofSRBSDVP9-1,lentinan-SRBSDVP9-1system,lentinan；(Clentinan=2.0×10mol·L,41 贵州大学2015届硕士研究生学位论文-5-1CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+aminooligosaccharinaminooligosaccharin2.52.01.5intensity1.00.50.0200250300350400Wavelength/nm图4-25SRBSDVP9-1、氨基寡糖-SRBSDVP9-1及氨基寡糖的紫外吸收光谱Fig.4-25UVspectrumofSRBSDVP9-1,aminooligosaccharin-SRBSDVP9-1system,aminooligosaccharin；-5-1-5-1(Caminooligosaccharin=2.0×10mol·L,CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+RibavirinRibavirin2.52.01.51.0intensity0.50.0-0.5200250300350400Wavelength/nm图4-26SRBSDVP9-1、病毒唑-SRBSDVP9-1及病毒唑的紫外吸收光谱-5Fig.4-26UVspectrumofSRBSDVP9-1,Ribavirin-SRBSDVP9-1system,Ribavirin；(CRibavirin=2.0×10-1-5-1mol·L,CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+moroxydinehydrochloridemoroxydinehydrochloride2.52.01.51.0intensity0.50.0200250300350400Wavelength/nm图4-27SRBSDVP9-1、盐酸吗啉胍-SRBSDVP9-1及盐酸吗啉胍的紫外吸收光谱Fig.4-27UVspectrumofSRBSDVP9-1,moroxydinehydrochloride-SRBSDVP9-1system,moroxydine42 贵州大学2015届硕士研究生学位论文-5-1-5-1hydrochloride；(Cmoroxydinehydrochloride=2.0×10mol·L,CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)SRBSDVP9-13.0SRBSDVP9-1+cytosinpeptidemycincytosinpeptidemycin2.52.01.51.0intensity0.50.0-0.5200250300350400Wavelength/nm图4-28SRBSDVP9-1、嘧肽霉素-SRBSDVP9-1及嘧肽霉素的紫外吸收光谱Fig.4-28UVspectrumofSRBSDVP9-1,cytosinpeptidemycin-SRBSDVP9-1system,cytosinpeptidemycin；-5-1-5-1(Ccytosinpeptidemycin=2.0×10mol·L,CSRBSDVP9-1=2.0×10mol·L)按照3.2.6.1中实验方法测得的7种抗病毒小分子与SRBSDVP9-1体系紫外吸收光谱，可得知SRBSDVP9-1的最大吸收波长在260nm左右，此峰主要由SRBSDVP9-1中酪氨酸和苯丙氨酸的π→π*跃迁引起，加入抗病毒小分子(毒氟磷、宁南霉素等)作用后，其吸收峰以及吸光度均都发生了改变。其中毒氟磷-SRBSDVP9-1体系，由图4-22可知，毒氟磷与SRBSDVP9-1作用后，毒氟磷-SRBSDVP9-1混合体系的吸光度增大为0.74，可以得出毒氟磷-SRBSDVP9-1混合体系的吸光度较SRBSDVP9-1体系的吸光度有所增强；由图4-23可知，宁南霉素与SRBSDVP9-1作用后，宁南霉素-SRBSDVP9-1混合体系的吸光度也较SRBSDVP9-1体系的吸光度有所增加；由图4-24可知，香菇多糖与SRBSDVP9-1作用后，香菇多糖-SRBSDVP9-1混合体系的吸光度也较SRBSDVP9-1体系的吸光度增加，另外，香菇多糖的加入使最高吸收峰红移，说明香菇多糖与SRBSDVP9-1产生了相互作用；由图4-25可知，氨基寡糖与SRBSDVP9-1作用后，氨基寡糖-SRBSDVP9-1混合体系的吸光度也较SRBSDVP9-1体系的吸光度增加，而且，氨基寡糖-SRBSDVP9-1混合体系的吸收峰产生了红移，说明氨基寡糖与SRBSDVP9-1产生了相互作用；由图4-26、4-27和4-28可知，病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素没有改变SRBSDVP9-1的紫外吸收光谱。由于紫外吸收光谱法具有一定的局限性，有的药物与蛋白在同一波长处均有吸收，因此不好判断是由于吸收峰飞改变是因为吸收叠加产生还是生成了复合物而导致的，所以，一般紫外吸收光谱法只作为荧光光谱实验的辅助性43 贵州大学2015届硕士研究生学位论文实验。4.2.3SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的ITC研究采用等温量热滴定仪(ITC)测定了毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素与SRBSDVP9-1的相互作用时的热量变化情况，并用ORIGINv7.0对实验结果进行拟合，结果见图4-29~4-35。图4-29毒氟磷与SRBSDVP9-1的ITC结果图4-30宁南霉素与SRBSDVP9-1的ITC结果Fig.4-29ITCdataofdufulintitrationswithFig.4-30ITCdataofningnanmycintitrationsSRBSDVP9-1withSRBSDVP9-1图4-31香菇多糖与SRBSDVP9-1的ITC结果图4-32氨基寡糖与SRBSDVP9-1的ITC结果Fig.4-31ITCdataoflentinantitrationswithFig.4-32ITCdataofaminooligosaccharintitrationsSRBSDVP9-1withSRBSDVP9-144 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-33病毒唑与SRBSDVP9-1的ITC结果图4-34盐酸吗啉胍与SRBSDVP9-1的ITC结果Fig.4-33ITCdataofribavirintitrationswithFig.4-34ITCdataofmoroxydinehydrochlorideSRBSDVP9-1titrationswithSRBSDVP9-1图4-35嘧肽霉素与SRBSDVP9-1的ITC结果Fig.4-35ITCdataofcytosinpeptidemycintitrationswithSRBSDVP9-1由图4-29~4-32可以看出，宁南霉素、毒氟磷和氨基寡糖与P9-1的结合为放热反应，香菇多糖与SRBSDVP9-1的结合为吸热反应，而病毒唑、嘧肽霉素和盐酸吗啉胍与P9-1的作用无规律，抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的ITC实验数据见表4-3。表4-3抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的ITC实验结果Tab.4-3ITCdataofantiviralwithSRBSDVP9-1-1-1-1-1-1药物Ka/mol△H/cal·mol△S/cal·mol·deg△G/J·molKd/μM453宁南霉素9.05×10-1.11×10-351.00-6.40×1011.04433香菇多糖8.43×103.51×1033.60-6.51×1011.86543毒氟磷1.25×10-2.08×10-46.40-6.97×108.0045 贵州大学2015届硕士研究生学位论文433氨基寡糖3.72×10-5.13×103.70-6.23×1026.88病毒唑无结合盐酸吗啉胍无结合嘧肽霉素无结合由表4-3可知，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖和氨基寡糖与P9-1的结合常5444数分别为：1.25×10、9.05×10、8.43×10及3.72×10，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素无法拟合出结合常数；结果表明，毒氟磷与SRBSDVP9-1的结合常数略高于宁南霉素和香菇多糖与SRBSDVP9-1的结合常数，而氨基寡糖与SRBSDVP9-1的结合很弱。根据熵值和焓值的变化，可以判断药物与蛋白的作用方式：当焓值小于0、熵值大于0时，主要为氢键作用；当焓值大于0、熵值大于0时，主要为疏水作用；当焓值小于0、熵值小于0时，主要为氢键和疏水作用；因此，从作用方式来看，宁南霉素和毒氟磷与SRBSDVP9-1主要是由氢键作用和疏水作用结合，香菇多糖与SRBSDVP9-1主要是疏水作用结合，而氨基寡糖与SRBSDVP9-1的作用主要是氢键作用。4.2.4SRBSDVP9-1蛋白与抗病毒小分子的MST研究采用MonolithNT.115微量热泳动仪对抗病毒小分子毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、嘧肽霉素、盐酸吗啉胍及病毒唑与SRBSDVP9-1的相互作用进行研究，实验结果如图4-36~4-42。46 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-36毒氟磷与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-36MSTdataofDufulintitrationswithSRBSDVP9-1图4-37宁南霉素与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-37MSTdataofNingnanmycintitrationswithSRBSDVP9-147 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-38香菇多糖与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-38MSTdataoflentinantitrationswithSRBSDVP9-1图4-39氨基寡糖与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-39MSTdataofaminooligosaccharintitrationswithSRBSDVP9-1图4-40病毒唑与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-40MSTdataofRibavirintitrationswithSRBSDVP9-148 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-41盐酸吗啉胍与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-41MSTdataofmoroxydinehydrochloridetitrationswithSRBSDVP9-1图4-42嘧肽霉素与SRBSDVP9-1的MST结果Fig.4-42MSTdataofcytosinpeptidemycintitrationswithSRBSDVP9-149 贵州大学2015届硕士研究生学位论文表4-4抗病毒小分子与SRBSDVP9-1相互作用的MST拟合结果Tab.4-4MSTdataofantiviralmoleculewithSRBSDVP9-1药物名宁南霉香菇多糖氨基寡糖毒氟磷嘧肽霉素盐酸吗啉胍病毒唑称素Kd/μM35.4059.5065.306.2084.2061.40152.00-14445444Ka/mol2.82×101.68×101.53×101.61×101.18×101.63×100.65×10根据MST的实验结果，分别对抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的结合常数及解离常数进行拟合，拟合结果见表4-4。由表4-4可知，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、嘧肽霉素、盐酸吗啉胍和病毒唑与SRBSDVP9-1的解离常数分别为：6.20μM、35.40μM、59.50μM、65.30μM、84.20μM、61.40μM、54152.00μM；换算成结合常数分别为：毒氟磷(1.61×10)＞宁南霉素(2.82×10)444＞香菇多糖(1.68×10)＞盐酸吗啉胍(1.63×10)＞氨基寡糖(1.53×10)＞44嘧肽霉素(1.18×10)＞病毒唑(0.65×10)；研究结果表明，毒氟磷在7个抗病毒剂中的解离常数最小，说明毒氟磷与SRBSDVP9-1的作用最强。4.3活体实验4.3.1对4种药剂处理后的水稻样本中S9-1的RT-PCR结果以毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖为测试药剂，供试浓度为500µg/mL，探索接毒后培养0、1、3、5、7d药剂对SRBSDVS9-1基因表达的抑制作用，均做3个重复，RT-PCR结果如图4-43。50 贵州大学2015届硕士研究生学位论文图4-43不同药剂对SRBSDVS9-1基因的抑制Fig.4-43InhibitionofdifferentagentsonSRBSDVS9-1gene由图4-43可以看出，感病水稻在毒氟磷和宁南霉素处理第1天时，S9-1基因表达量增加，说明病毒含量有所增加，但是在药剂处理第3、5和7天后，S9-1基因表达量下降，说明第1天时药物的效果还没有发挥出来，而3、5和7天后毒氟磷和宁南霉素有效抑制了病毒的增长；在喷施香菇多糖后，水稻样本的S9-1基因表达量随着时间延长不断减少，说明香菇多糖在喷药后第1天就发挥出了药效，有效抑制了病毒的增殖，但对病毒的抑制效果小于毒氟磷对病毒的抑制效果；喷施氨基寡糖1天和3天后S9-1基因表达量有所降低，但在第5天和7天时表达又增加，说明药效对病毒的抑制时间较短、防效也较差。综上所述，喷施毒氟磷3后药剂对病毒的抑制效果强于宁南霉素、香菇多糖和氨基寡糖。4.4SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的相互作用研究4.4.1SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的荧光光谱研究采用荧光滴定的方法，对SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的相互作用关系进行研究。蛋白的浓度为10μM，毒氟磷衍生物的浓度分别为0、2、4、6、8、10、12、14、16和18μM，在不同浓度的毒氟磷衍生物的作用下SRBSDVP9-1的荧光光谱如图4-44所示。51 贵州大学2015届硕士研究生学位论文A.GUJHZX-005;B.GUJHZX-013;C.GUJHZX-025;D.GUJHZX-031;E.GUJHZX-035;F.GUJHZX-041.图4-44SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的荧光光谱Fig.4-44FluorescencespectrumofSRBSDVP9-1withdufulinderivatives-6-61.0×10mol/LSRBSDVP9-1;(b-i)1.0×10mol/LSRBSDVP9-1inthepresenceof2.0,4.0,6.0,-68.0,10,12,14,16,18×10mol/Ldufulinderivatives,respectively;λex=275nm,T=298K,PH=7.4由图4-44可以看出，随着毒氟磷衍生物的增加，SRBSDVP9-1的荧光强度都有一定程度的猝灭，通过Stern-Volmer方程F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]，计算10出毒氟磷衍生物对SRBSDVP9-1的猝灭速率常数Kq﹥2.0×10，所以它们对SRBSDVP9-1产生的猝灭均为静态猝灭，对于静态淬灭，采用用对数方程lg(F0−F)/F=lgKa+nlg[Q]可以求出毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1的结合常数及结合位点数，计算结果见表4-5。表4-5毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1相互作用的荧光实验结果Tab.4-5FlourescencedataofdufulinderivativeswithSRBSDVP9-1-1-12-12毒氟磷衍生物Ksv/mol·s·LRsvKa/molnR32GUJHZX-0057.51×100.981.31×101.010.9444GUJHZX-0132.19×100.989.12×100.980.9845GUJHZX-0254.88×100.981.41×101.100.9942GUJHZX-0311.93×100.962.96×100.610.9933GUJHZX-0357.56×100.994.57×100.950.9843GUJHZX-0414.25×100.981.51×101.070.98由表4-5可以看出，毒氟磷衍生物GUJHZX-013、GUJHZX-025与SRBSDV454P9-1的结合常数分别为9.12×10和1.41×10，均高于10，而GUJHZX-005、52 贵州大学2015届硕士研究生学位论文GUJHZX-031、GUJHZX-035、GUJHZX-041与SRBSDVP9-1的结合较弱，基本可以看做没有结合。4.4.2SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的ITC研究采用等温量热滴定仪(ITC)测定了毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1的相互作用时的热量变化情况，并用ORIGINv7.0对实验结果进行拟合，拟合结果见图4-45。A.GUJHZX-005;B.GUJHZX-013;C.GUJHZX-025;D.GUJHZX-031;E.GUJHZX-035;F.GUJHZX-041.图4-45SRBSDVP9-1与毒氟磷衍生物的ITC结果Fig.4-45ITCdataofdufulinderivativestitrationswithSRBSDVP9-1由图4-45可以看出，GUJHZX-013、GUJHZX-025与SRBSDVP9-1的结合为吸热反应，而GUJHZX-005、GUJHZX-031、GUJHZX-035、GUJHZX-041与SRBSDVP9-1的作用无规律，无法进行拟合。毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1的ITC实验数据见表4-6。53 贵州大学2015届硕士研究生学位论文表4-6毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1相互作用的ITC实验结果Tab.4-6ITCdataofdufulinderivativestitrationswithSRBSDVP9-1-1-1△H/cal·mol△G/J·mol毒氟磷衍生物-1-1-1-1(kcal·mol-1)△S/cal·mol·deg(kcal·mol)Ka/molKd(μM)GUJHZX-005Nobinding234GUJHZX-0131.51×1023.20-6.76×109.17×1010.90445GUJHZX-0258.76×10397.00-3.07×102.43×104.11233GUJHZX-031-1.33×1022.20-6.75×108.91×1011.22GUJHZX-035NobindingGUJHZX-041Nobinding由表4-6可以得出，GUJHZX-013、GUJHZX-025与SRBSDVP9-1的结合454常数分别为9.17×10和2.43×10，均大于10，而GUJHZX-005、GUJHZX-031、GUJHZX-035、GUJHZX-041与SRBSDVP9-1的结合很弱。54 贵州大学2015届硕士研究生学位论文第五章结论本论文以SRBSDVP9-1为潜在靶标蛋白，采用荧光光谱法、紫外光谱法、等温量热滴定法和微量热泳动法研究了P9-1与抗病毒小分子的相互作用，得到论文的主要结论、创新之处和不足之处如下：5.1主要结论(1)采用荧光光谱法研究了毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、病毒唑、盐酸吗啉胍及嘧肽霉素与SRBSDVP9-1的相互作用。结果表明，宁南霉素、毒4氟磷、香菇多糖及氨基寡糖与SRBSDVP9-1的结合常数分别为：5.60×10、5431.51×10、4.78×10和5.60×10，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素对SRBSDVP9-1蛋白的荧光没有产生猝灭。为了验证荧光光谱的结果，采用了紫外光谱法对这7个抗病毒小分子与SRBSDVP9-1的相互作用进行研究，结果表明，宁南霉素、毒氟磷、香菇多糖及氨基寡糖都能使SRBSDVP9-1的吸收光谱产生变化，说明它们与SRBSDVP9-1产生了相互作用，而病毒唑、盐酸吗啉胍及嘧肽霉素对SRBSDVP9-1的吸收光谱没有影响。荧光光谱法和紫外光谱法的研究结果皆表明毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖及氨基寡糖与SRBSDVP9-1能产生相互作用。(2)采用ITC法研究了毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、病毒唑、盐酸吗啉胍及嘧肽霉素与SRBSDVP9-1的相互作用。结果表明，毒氟磷、宁南霉素、54香菇多糖和氨基寡糖与SRBSDVP9-1的结合常数分别为：1.25×10、9.05×10、448.43×10及3.72×10，而病毒唑、盐酸吗啉胍和嘧肽霉素无法拟合出结合常数；继而又采用MST对ITC的实验结果进行佐证，结果表明，毒氟磷、宁南霉素、香菇多糖、氨基寡糖、嘧肽霉素、盐酸吗啉胍和病毒唑与SRBSDVP9-1的解离常数分别为：6.20μM、35.40μM、59.50μM、65.30μM、84.20μM、61.40μM和152.00μM。ITC与MST的实验结果均表明，在这7种化合物中毒氟磷的解离常数最小。(3)由荧光光谱法、紫外光谱法、ITC和MST的研究结果表明，以上7种抗病55 贵州大学2015届硕士研究生学位论文毒小分子与SRBSDVP9-1的结合力大小为：毒氟磷＞宁南霉素＞香菇多糖＞氨基寡糖，而盐酸吗啉胍、嘧肽霉素及病毒唑与SRBSDVP9-1蛋白没有结合。4种方法研究的结果一致，说明离体筛选模型具有一定的可靠性。(4)由于毒氟磷与SRBSDVP9-1有较强的结合，所以我们采用了荧光光谱法和ITC研究了毒氟磷衍生物与SRBSDVP9-1是否也具有相同的结合规律。研究结果表明，GUJHZX-013、GUJHZX-025与SRBSDVP9-1有较强的相互作用，结45合常数分别为9.12×10和1.41×10，而GUJHZX-005、GUJHZX-031、GUJHZX-035、GUJHZX-041与SRBSDVP9-1没有结合。5.2本文创新之处首次采用了荧光光谱法、紫外光谱法、等温量热滴定法和微量热泳动法研究了抗病毒小分子与SRBSDVP9-1蛋白的相互作用，筛选出毒氟磷与SRBSDVP9-1具有微摩尔级别的亲和力。采用活体实验验证了离体筛选的药物活性，得到的药物活性和离体筛选的结果相一致，说明基于SRBSDVP9-1靶标蛋白的药物筛选模型具有一定的可靠性。5.3本文的不足之处与展望5.3.1只研究了抗病毒小分子与SRBSDVP9-1蛋白的相互作用大小，并未研究这些药物对该蛋白的活性的影响。下一步实验中，可以通过测定药物对SRBSDVP9-1蛋白活性的抑制来筛选抗病毒化合物，这样能更加直观的反应抗病毒小分子对SRBSDVP9-1的作用。5.3.2本实验只针对了SRBSDV的基质蛋白P9-1进行了研究，下步实验中，可以在已建立的相互作用方法筛选模型的基础上探索药剂对SRBSDVP1、P2、P7-1、P10等关键蛋白的作用，以全面考察药剂对SRBSDV所有关键蛋白的作用，对药物筛选模型进行进一步的验证和优化。56 贵州大学2015届硕士研究生学位论文致谢感谢我的导师宋宝安老师，我的论文是在他的精心指导下完成的。导师认真务实的工作作风、―不为失败找借口，只为成功找方法‖的拼搏精神以及雷厉风行的做事风格使我受益匪浅，在此论文完成之际，谨向尊敬的导师致以崇高的敬意并表示衷心的感谢！贵州大学精细化工研究开发中心是一个积极奋进，对科研工作有着极高的热情和执着的追求的团队，在这样的团队中学习生活，使我的思想及行为习惯都有了很大的进步！在我论文实验过程中李向阳老师、贺鸣老师、陈卓老师、金林红老师、王贞超师姐给予了极大的支持和帮助，以及张国平师姐提供的毒氟磷衍生物，在此我表示由衷的谢意！在我三年的研究生学习期间，还要感谢胡德禹老师、杨松老师、薛伟老师、吴剑老师、徐维明老师、杨凌老师对我在科研以及生活上的关怀和帮助！在论文过程中，感谢同窗好友刘靖、施利、李连华、秦志洋和实验室的丁燕、张伟莹、高曼妮等师弟师妹在实验过程中对我的热情帮助，借此机会向他们表示衷心的感谢！感谢家人和朋友的支持！感谢各位专家提出宝贵的意见！57 贵州大学2015届硕士研究生学位论文参考文献[1]Wang,Q.;Yang,J.;Zhou,G.H.;Zhang,H.M.;Chen,J.P.;MichaelJ.A.ThecompletegenomesequenceoftwoisolatesofSouthernriceblack-streakeddwarfvirus,anewmemberofthegenusFijivirus[J].J.Phytopatho.2010,158:733–737.[2]Hoang,A.T.;Zhang,H.;Yang,J.;Chen,J.P.Identification,characterization,anddistributionofSouthernriceblack-streakeddwarfvirusinVietnam[J].Plant.Dis.2011,95(9):1063–1069.[3]葛帅,余守武,杜龙岗,陈珊宇,洪晓富,阮关海.中国南方水稻黑条矮缩病的研究概况[J].农学学报,2014,4(5):8–11.[4]Matsukura,K.;Towata,T.;Sakai,J.;Onuki,M.;Okuda,M.;Matsumura,M.DynamicsofSouthernriceblack-streakeddwarfvirusinriceandimplicationforvirusacquisition[J].Phytopathology,2013,103(5):509–512.[5]郭荣,周国辉,张曙光.水稻南方黑条矮缩病发生规律及防控对策初探[J].中国植保导刊,2010,30(8):17–20.[6]Jia,D.;Chen,H.;Zheng,A.L.;Chen,Q.;Liu,Q.F.;Xie,L.H.;Wu,Z.J.;Wei,T.Y.DevelopmentofaninsectvectorcellcultureandRNAinterferencesystemtoinvestigatethefunctionalroleofFijivirusreplicationprotein[J].J.Virol.2012,86(10):5800–5807.[7]Pu,L.;Xie,G.;Ji,C.TransmissioncharacteristicsofSouthernriceblack-streakeddwarfvirusbyriceplanthoppers[J].Crop.Prot.2012,41:71–76.[8]Zhou,G.H.;Wen,J.J.;Cai,D.J.;Li,P.;Xu,D.L.;Zhang,S.G.Southernriceblack-streakeddwarfvirus:anewproposedFijivirusspeciesinthefamilyReoviridae[J].Chin.sci.bull.2008,53(23):3677–3685.[9]胡秀弟.南方水稻黑条矮缩病毒云南分离物基因组特征及其编码蛋白的功能预测[D].云南农业大学硕士学位论文,2012.[10]周国辉,温锦君,蔡德江,李鹏,许东林,张曙光.呼肠孤病毒科斐济病毒属一新种:南方水稻黑条矮缩病毒[J].科学通报,2008,53:2500–2508.[11]Zhang,H.;Yang,J.;Chen,J.;Adams,M.J.Ablack-streakeddwarfdiseaseonriceinChinaiscausedbyanovelFijivirus[J].Arch.Virol.2008,153:1893–1898.58 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贵州大学2015届硕士研究生学位论文ofbindinginteractionsbetweendufulinandSouthernriceblack-streakeddwarfvirusP9-1[J].Bioorg.Med.Chem.2015,23(13):3629–3637.[2]Li,P.;Shi,L.;Yang,X.;Yang,L.;Chen,X.W.;Wu,F.;Shi,Q.C.;Xu,W.M.;He,M.;Hu,D.Y.;Song,B.A.Design,synthesis,andantibacterialactivityagainstricebacterialleafblightandleafstreakof2,5-substituted-1,3,4-oxadiazole/thiadiazolesulfonederivative[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.2014,24:1677–1680.[3]尹娟,胡德禹,贺鸣,施利,杨霞.6种杀菌剂对马铃薯晚疫和辣椒枯萎病菌的室内毒力测定[J].贵州大学学报,2013,30(5):16–18.[4]宋宝安,李培,杨松,胡德禹,薛伟,金林红,徐维明,贺鸣,施利,杨霞,史庆才,吴芳.含噻二唑或噁二唑衍生物及其在防治农业植物病害中的应用[P].CN103788015A.[5]宋宝安,李培,杨松,胡德禹,薛伟,金林红,徐维明,贺鸣,施利,杨霞,史庆才,吴芳.噻二唑类金属络合物及其在防治农业植物病害中的应用[P].CN103788119A.[6]宋宝安,李培,杨松,胡德禹,薛伟,金林红,徐维明,贺鸣,施利,杨霞,史庆才,吴芳.噁二唑类金属络合物及其在防治农业植物病害中的应用[P].CN103755660A.64 贵州大学2015届硕士研究生学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：日期：2015年6月65