猪流行性腹泻病毒coe抗原表位的原核表达及间接elisa检测方法的建立

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1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateProkaryoticexpressionofCOEgeneofPorcineEpidemicDiarrheaVirusandestablishmentofindirectELISAtestmethodCandidate:Supervisor:CooperantSupervirsor:AcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureSpeciality:PreventiveVeterinaryMedicineResea

2、rchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:CollegeofAnimalScienceandTechnologyJune,2013中文摘要猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）引起的高度接触性的肠道传染病，在全世界范围流行，各种年龄猪均易感，发病率和死亡率均很高，造成养猪业严重的经济损失。从2010年开始，PED单独或与其他病原（因）混合感染，引起我国各种规模猪场哺乳仔猪严重腹泻，发

3、病率与死亡率均显著升高。疫苗免疫是防治PED的重要手段。然而PEDV因体外培养困难，容易出现疫苗病毒含量不足现象，造成免疫失败。另外，PEDV弱毒疫苗给乳猪早期使用存在残余毒力致病的风险。因此，PEDV基因工程苗的研制对防治PED具有重要意义。另外，国内外使用的PEDV诊断试剂大多是以全病毒为抗原，但PEDV的分离及体外培养较困难，使得大量制备抗原变得困难。综合上述，本试验对近年流行的PEDV毒株的S基因的保护性抗原（COE）的保守性进行了进一步遗传学分析，用COE原核表达蛋白建立了PEDV的间接ELISA诊断技术，并为PEDV新型基因工程疫苗制备提供了理论与物质

4、基础。研究内容如下：（1）本试验根据GenBank收录的PEDVCV777株全基因序列（登录号为AF353511）设计一对COE的特异性引物P1、P2，利用RT-PCR技术扩增出501bp的COE抗原表位片段，并成功将目的基因插入原核表达载体pET-32α中，构建了重组表达质粒pET-32α-COE。将重组表达质粒pET-32α-COE转化入表达宿主菌E.coilRosetta中进行诱导表达，产物经过SDS-PAGE蛋白电泳后，结果显示目的基因片段在E.coilRosetta中得到表达，目的蛋白分子量约为40kD。对包涵体提取纯化后得到纯度较高的重组蛋白，West

5、ern-blotting检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PED诊断试剂及基因工程疫苗研究奠定了物质与技术基础。（2）本试验将纯化后的重组COE蛋白作为包被抗原，通过优化间接ELISA检测的条件，建立了PEDV抗体的间接ELISA检测方法；通过对临床血清的检测以及其结果与市售的猪流行性腹泻抗体快速检测试剂盒的检测结果进行比对，发现该方法符合率较高，且具有较高的特异性、敏感性和重复性。该研究为进一步制备猪流行性腹泻抗体诊断试剂盒奠定了基础，同时为猪流行性腹泻病毒的诊断和检测提供了一种良好的技术手段。关键词：猪流行性腹泻病毒，COE抗原表位，原核表达，间

6、接ELISAIAbstractPorcineepidemicdiarrheaisahighlycontagiousintestinalinfectiousdiseasewhichcausedbyporcineepidemicdiarrheavirus.Allagespigsarethoughttobesusceptibletoinfection.Itoccurfrequentlyaroundtheworldandresultinseriouseconomiclossesforthepigindustry.Since2010,PEDoccurinisolationo

7、rmixedinfectionswithotherpathogens.Itcauseseverediarrheaofpigletsofvariousscalepigfarms.Morbidityandmortalityweresignificantlyhigher.ThevaccineisanimportantmeansofpreventionandtreatmentofPED.WhiletheculturedinvitroofPEDVisdifficult,viruscontentofvaccinetendstobeinsufficient,whichcanca

8、useim