猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)抑制rna诱导的基因沉默

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分类号河南农业大学硕士学位论文密级论文题目：猹鏊殖生旺噬绽金征痘壹(￡堕曼y)蜘剑必△透导的基因沉默英文题目：．SuppressionofRNA-mediatedgenesilencingbyporcinereproductiveandrespiratorysyndrome．．v．．．．．．．i．．．．r．．．．．．u．．．．—s—学位申请人：陈静导专师：张改平院士业：预防兽医学研究方向：畜禽疫病病原与分子免疫学论文提交日期：学位授予日期： 致谢0IIIIIIIIIIIIIIllIIIIIIIIIlY2432495本课题研究是在导师张改平院士的严格要求和悉心指导下完成的，张老师在选题、实验方案设计到实验过程中遇到问题的分析和解决等方面都给予了启发性的指导和帮助。在三年的学习过程中，导师渊博的学识、科学的思维方式、广阔的思想、精益求精的治学态度、开拓创新的进取精神，不仅培养了我对科学研究的热情和兴趣，更让我学会了做人要有宽广的胸怀和广阔的气度。尤其是他崇高的敬业精神、忘我的工作作风和不懈的执着追求，给我树立了学习的榜样，将使我终生受益；在此表示深深的敬意和由衷的感谢!本研究工作在河南省动物免疫学重点实验室开展，感谢实验室提供优良的实验条件、学习机会和工作环境。研究过程中得到了史西保老师的指导，史老师严谨的科研态度和科研作风对我产生了深远的影响，在此衷心感谢史老师在实验研究和论文撰写及生活中给予的悉心指导和特别帮助。非常感谢邓瑞广研究员、周玲女士在实验研究和生活中的关心和帮助。感谢郭军庆研究员、李学伍研究员、杨艳艳研究员、乔松林副研究员、罗俊副研究员、郝慧芳副研究员、郅玉宝副研究员、职爱民副研究员和李青梅副研究员在实验过程中的交流与探讨。感谢卢清侠、邢广旭、藤蔓、王丽、杨苏珍、赵东、柴书军、杨继飞、王方雨、樊剑鸣、王德国、王建中、刘庆堂和张丽等各位老师在生活中各个方面给予的帮助和大力支持。感谢河南农业大学牧医工程学院崔保安教授、宁长申教授、王川庆教授、张龙现教授、夏平安教授、赵军教授、许兰菊教授、王亚宾老师、菅复春老师、张光辉老师、杨霞老师、王新卫老师、陈丽颖老师、陈红英老师、李新生老师、张红英老师、魏战勇老师、陈陆老师、王彦斌老师和杨明儿老师等在学习期间给予的支持和帮助。感谢农业部动物免疫学重点开放实验室师兄李鹏博士后、金前跃博士、刘运超博士、万博博士、赵朴博士、鲍登克博士、杨兴东博士、王寅彪博士、王耀博士、蒋志政硕士、赵启法硕士、刘永晖硕士、张小辉硕士、；师姐姬向波博士、迟佳琦博士、余祖华博士、宋春美博士、刘珍博士、王瑞宁博士、陈玉梅博士、王蕊硕士、王志红硕士、孙亚宁硕士、龚芳硕士、裴亚峰硕士、李靓硕士、王倩倩硕士、李培培硕士；感谢实验室同学陈稳、张静、禹乐乐、王坤、刘明阳、王世红、范璐璐、李文君、王玲玲、贾俊杰、薛白、王树芬及师弟师妹刘畅、胡博、贾国超、姬建生、潘霄、蔡齐超、张小帆、刘儒彪、何文博、阮涛、宿靖伟等在生活中给予的帮助及在实验期间给我带来的欢乐和美好回忆。特别感谢同一课题组的王超博士、常咏哲硕士在工作中给予的协作和无私帮助，感谢他们对本研究做出的重要贡献。 感谢我的同学河南农业大学牧医工程学院刘媛媛、岳敏杰、郭玲玲、张莉娟、杨青原、彭永帅、吴宇阳、李坤、苌生科、张菲菲、卫九健、王建领、师润、王帅涛、霍金耀、姬郭彪、郑逢梅、高金良、李晓博、王俊亚、张晓娟、陈雅君、卢权威、张元元、王朝阳、吕靖玉、冯建坤、董卫超、刘亚东、张军杰、张亮、蒋大伟、慕春龙、谷素美等所有同学在文献查阅过中提供的帮助，在学习和生活中对我的关心和照顾并及时帮我传递学校最新信息。感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导。深深感谢我的父母含辛茹苦的养育之恩及亲戚、朋友多年来对我学业和生活上无私的支持、鼓励和关怀。再次感谢所有关心、支持、帮助我的领导、老师、同事和亲友。陈静 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31病原学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32PRRSV分子生物学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32．1PRRSV基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一32．2PRRSV编码的非结构蛋白及其功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．3PRRSV编码的结构蛋白及其功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53PRRSV免疫学研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63．1PRRSV免疫调节和免疫逃逸⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．1．1PRRSV抑制I型干扰素的产生⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．1．2PRRSV诱导细胞因子IL．10⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63．1．3PRRSV干扰正常的抗原呈递⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63．1．4体液免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73．2PRRSV免疫抑制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．73．3PRRSV疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一74RNAi研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯84．1RNAi机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．84．2RNAi是一种抗病毒免疫反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯104．3RNAi一基因调控的工具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．115RNA沉默抑制子(RNAsilencingsuppressorRSS)的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一125．1HIV的Tat蛋白介导RNA沉默抑制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．2人类A型流感病毒的NSl蛋白作为RSS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯135．3丙型肝炎病毒的核蛋白和外膜蛋白(E2)作为RSS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．4埃博拉病毒的VP35作为RSS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯145．5痘病毒的EL3蛋白作为RSS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．145．6腺病毒非编码RNA作为RSS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯146本研究的意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17第二部分在MARC．145上构建RNA干扰的模型及其干扰效果鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19l材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．191．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l91．1．1细胞、质粒及载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 1．1．3主要试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一191．1．4主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一201．1．5核苷酸序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．201．2．1shRNA干扰表达载体的干扰效果鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．211．2．1．1利用PSGHI载体转录shRNA对EGFP基因进行干扰⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．221．2．1．1．1293T细胞的复苏及培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一221．2．1．1．2倒置荧光显微镜检测转染后293T细胞的荧光量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．221．2．1．2利用PSGHl载体转录shRNA对Luc进行干扰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．221．2．1．2．1MARC．145细胞复苏及培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．221．2．1．2．2PGL．4．17、PhRL．TK、PSGHI、PSGHI．shLuc转染MARC．145细胞231．2．2mi．RNA干扰表达载体的干扰效果鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．2．2．1pcDNA6．2、pcDNA6．2一MDv-miR4、psiCHECK-MDV-UL28UTR瞬时转染MARC．145细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．241．2．3人工合成的dsRNA干扰效果的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．2．3．1人工合成的dsRNA转染MARC一145细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．2．4双荧光报告基因系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1检测shRNA干扰表达载体的有效性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2检测mi．RNA干扰表达载体的有效性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262．3检测人工合成的双链dsRNA的干扰效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一27第三章PRRSV及其Nspl、NsplI对RNAi诱导的基因沉默的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一291材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．1．1病毒、质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一291．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯j⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．2．1PRRSV对由shRNA、dsRNA、mi．RNA诱导的基因沉默的影响⋯⋯⋯⋯．．291．2．1．1shRNA、dsRNA、mi．RNA分别瞬时转染MARC．145细胞⋯⋯⋯⋯⋯291．2．1．2PRRSV作用于转染了shRNA、dsRNA、mi．RNA的MARC．145细胞．．301．2．2nspl、nspll、nsplet、nspll3对RNAi诱导基因沉默的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．2．2．1nspl、nspll、nsplu、nspll3表达质粒分别与shRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～30 1．2．2．2nspl、nspll、nsplct、nspl[3表达质粒分别与dsRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一311．2．2．3nspl、nspll、nsplct、nsplp表达质粒分别与mi-RNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．311．2．3双荧光报告基冈系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．1PRRSV抑制shRNA、dsRNA、mi．RNA诱导的RNA沉默⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。322．2PRRSV的nspltt和nspll是RNA沉默的抑制子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35第四章nsplct木瓜蛋白酶和nspll核酸内切酶失活后对RNAi诱导的基因沉默的影响⋯。371材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯271．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。371．1．1细胞、质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371．2．1nsplct及其突变体质粒对RNAi诱导基因沉默的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．371．2．1．1nspla及其突变体质粒分别与shRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯371．2．2．2nspla及其突变体质粒分别与dsRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯371．2．2．3nsplct及其突变体质粒分别与miRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯371．2．2nspll及其突变体质粒对RNAi诱导基因沉默的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．371．2．2．1nspll及其突变体质粒分别与shRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯371．2．2．2nspll及其突变体质粒分别与dsRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯371．2．2．3nspll及其突变体质粒分别与miRNA共转染MARC．145细胞⋯⋯⋯381．2．3双荧光报告基因系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一382．1nsplct的木瓜蛋白酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382．2nspl1的核酸内切酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一393讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39第五部分全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43 河南农业大学2013届硕士毕业论文中文摘要RNA干扰(IⅢAinterference，RNAi)现象是一种由双链RNA(double-strandRNA，dsRNA)启动的序列特异性基因沉默机制。RNAi从线虫到人类细胞都广泛存在，是一种先天性抗病毒的自我防御方式，能够抵抗外源基因或病毒的入侵。然而，病毒在受到RNAi抵抗过程中会通过病毒蛋白或非编码的病毒RNA来抑制RNA沉默，即RNA沉默抑制子(RNAsilencingsuppressor，RSS)，从而使病毒在宿主细胞内复制、增殖，促进病毒感染。目前，已从植物、动物和人类病毒中鉴定了20多种RSSs，并且这些RSSs中大部分都是干扰素的拮抗蛋白。猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS)是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为主要特征的病毒性疾病，给养猪业造成重大的经济损失。PRRS是由PRRSV引起的，PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属(Arterivirus)，动脉炎病毒科，套式病毒目州idoviruses)。基因组全长约15kb，含有9个开放性阅读框(ORFs)，其中，ORF．1编码14中非结构蛋白(nsps)，nsps除了具有复制、蛋白酶、聚合酶的功能外，同时还能抑制干扰素的产生；ORF2．7编码病毒的结构蛋白。RNAi作为宿主细胞抑制病毒复制、清除病毒的一种先天性免疫机制，是宿主重要的免疫防御系统，许多持续性感染的病毒都存在一定的机制拮抗RNA诱导的基因沉默。PRRSV存在免疫抑制和持续性感染的免疫学特性，并且PRRSV的感染能抑制干扰素的产生，表明PRRSV可能会存在抑制RNA诱导的基因沉默的作用，从而逃避宿主先天性的抗病毒免疫。本研究利用RNAi技术，将人工合成的dsRNA和shRNA、mi—RNA干扰表达质粒分别转染MARC．145细胞，dsRNA、shRNA和mi．RNA靶向的目标基因是萤火虫荧光素酶报告基因(Luciferasc，Luc)，经双荧光素酶报告检测系统检测，发现dsRNA、shRNA和mi-RNA均抑制了转染的细胞Luc的表达量，表明在MARC．145细胞上成功构建了dsRNA、shRNA和mi—RNA诱导的基因沉默的模型iPRRSV与RNAi模型共作用于MARC．145细胞，发现PRRSV能够恢复被抑制的Luc的表达量，证实PRRSV能够抑制RNA诱导的基因沉默；PRRSV的nspl和nspl1分别与RNAi模型共转染MARC．145细胞，nspI和nspl1同样也能恢复被抑制的Luc的表达晕，其中，nspl可以自水解为nsplct和nsplfl，nspl能够恢复被抑制基因表达量主要是通过nspla实现的，nspla和nspll可能是RNA沉默抑制子：分别构建nspla并flnspll的突变体使nspla的木瓜蛋白酶活性和nspll的核酸内切酶活性都失活，nspla和nspll的突变体分别与RNAi模型共转染MARC．145细胞，然而，这些突变体不能抑制RNAi诱导的基冈沉默，这揭示nspla的木瓜蛋白酶活性和nspll的核酸内切酶活性对nspla和nspll发挥RSS活性起关键性作用。在MARC．145细胞上，PRRSV抑制了shRNA、dsRNA和miRNA诱导的RNA沉默，并且PRRSV的非结构蛋白nspl和nspll具有抑制RNA诱导的基因沉默的作用，nspla和nspll是RNA沉默的抑制子，nspla的木瓜样蛋白酶的活性和nspll的核酸内切酶活性分别 河南农业大学2013届硕士毕业论文是nspl旺和nspll发挥抑制RNA诱导的基因沉默活性所必需的。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA沉默RNA沉默抑制子免疫逃逸2 河南农业大学2013届硕士毕业论文第一部分文献综述1病原学猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)俗称“蓝耳病”，是世界范围内最重要的猪病之一，给养猪业造成了极大的经济损失。该病以怀孕母猪妊娠后期繁殖障碍及仔猪呼吸困难为主要特征【1J。不同年龄、品种和性别的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，该病以母猪的流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特型}引。1992年，世界动物卫生组织(OfficeIntemationalDesEpizooties，OIE)将PRRS列为B类动物疾病。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的，1987年该病首次在美国发现，1991年荷兰学者Wensvoort博士及其同事首次用原代的猪肺巨噬细胞(PorcineAlveolarMacrophages，PAM)分离到一株欧洲型PRRSV，并命名为Lelystadvirus(LV)，1992年美国学者Collins等分离到PRRSV美洲型毒株ATCCVR-2332。因此，国际上将PRRSV分为以ATCCVR．2332为代表的美洲型和以Lv为代表的欧洲型【4巧J。我国于1996年郭宝清等首次在感染PRRSV的母猪的流产胎儿中分离到一株PRRSVl61。随着病毒的遗传和变异，2006年，我国十几个省，。泛流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，被证实是一种由新型毒力更强的PRRSV毒株引起的I卜引，目前，该病毒已造成我国很多省市猪群发生地方性流行，成为我国重要猪病病原之一。到目前为止，我国所分离的毒株多为美洲型PRRSV，但也有少量欧洲型PRRSV191o在第10次国际病毒大会上将猪繁殖与呼吸综合征病毒与马动脉炎病毒(EquineArteritisvirus，EAV)、小鼠乳酸脱氢酶病毒(Lactatedehydrogenaseelevatingvirus，LDV)以及猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)同属于新设立的套式目(NidDvirale)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV病毒粒子呈球形，直径约为48nm～83nm；其核衣壳直径约为25nm～30nm，外绕脂质双层膜，核衣壳呈立体对称的二十面体。由于病毒表面有囊膜，对温度、pH和去污剂较敏感。病毒在．70"C～_20。C这一范围内可存活至少4周，在56℃时病毒存活20min、37"C时病毒存活24h、21℃病毒存活6d；PRRSV在pH6．5．pH7．5间相对稳定，但当pH小于6或大于7．6时其感染性将失活，氯仿和乙醚等去污剂和脂溶剂可有效破坏病毒的囊膜，使病毒失去复制能力【IuJ。2PRRSV分子生物学2．1PRRSV基因组结构PRRSV基因组全长约15kb，含有9个开放性阅读框(ORFs)，其基本线性排列顺序为5’一帽子结构一非编码区一ORFIa-ORFlb．ORF2a．ORF2b．ORF(3．7)-非编码区·polyA-3’，相邻的 河南农业大学2013届硕士毕业论文读码框之间均有部分重叠I¨。41。ORFl占PRRSV基因组长度的80％，长约12kb，包括ORFla和ORFIb，ORFl编码产生复制酶和聚合蛋白，被病毒蛋白酶加工成14个非结构蛋白(nonstructuralproteins，nsps)，其中，包括四种蛋白酶(nspla，nsplp，nsp2和nsp4)、RNA依赖的RNA聚合酶(nsp9)、螺旋酶(nspl0)和核酸内切酶(nspll)：ORF2-7编码产生病毒结构蛋白，其中ORF2～ORF5编码产生的为病毒糖基化蛋白，依次为GP2a、(E)、GP3、GP4、GP5。ORF6编码产生膜基质蛋I兰I(M蛋白)，ORF7编码产生核衣壳蛋白(N蛋白)【¨。1引。2．2PRRSV编码的非结构蛋白及其功能ORFl编码病毒复制过程中所必需的聚合酶，ORFla和ORFIb编码ppla和pplab，ppla最终裂解10个非结构蛋白，分别为nspl、nsp2到nsp8，而pplab最终裂解为nsp9、nsplO、nspll和nspl2[191。nsp2在北美株和欧洲株间有很大差异，其氨基酸同源性只有32％。自2006年下半年高致病性蓝耳病在我国南方爆发以来，期间分离的PRRSV变异株和传统毒株相比，其nsp2蛋白均有30个氨基酸缺失，因此一些学者推测nsp2蛋白可能与病毒的毒力和致病性有很大关系【2们。ORFla多聚蛋白具有多肽蛋白切割功能，其中nspl具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性；nsp2和nsp4分别含有半胱氨酸蛋白酶区和丝氨酸蛋白酶区，从而发挥剪切功能12¨。目前，对nsp3研究较少，据生物信息学方法预测，nsp3有4个TM螺旋结构，其中的4个半胱氨酸残基在动脉炎病毒科各病毒中都是保守的122-23I。nsp3的功能可能与其它的非结构蛋白组成复制复合体。nsp5～8的结构和功能有待进一步的研究，有关PRRSV的nsp5～8的信息大多是参考其它动脉炎病毒属进行相关研究的推测或者借助生物信息学方法进行预测获得的121J。ORFIb编码产生寡聚蛋白，长约1463个氨基酸，由于ORFlb编码的蛋白酶不具有水解功能，它的裂解由ORFla编码的水解蛋白酶来执行。nsp9和nsplO～11是套式病毒目最保守的蛋白，其中，nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RNA．dependentRNApolymeraseactivity，RdRp)，nsp9．RdRp功能和机制对于研究RNA合成机制以及研发抗病毒药物或疫苗都将起到积极的推动作用；nspl0蛋白具有解旋酶活性，包含有锌指结构(Zinc．finger，ZF)，同nsp9一起组成动脉炎病毒RNA合成的关键酶。zF包含13个十分保守的半胱氨酸和组氨酸残基，对于维持ATPase和解旋酶活性是必需的；nspll具有核酸内切酶活性；nspl2变异性较大，其编码的蛋白只是在冠状病毒、动脉炎病毒中存在122-23】。nspl包括2个多功能蛋白：nspla和nsplp，它们都具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(Papainlikecysteineproteinse，PCP)活性区域，PCPct和PCP[3介导nspIct和nsplp自身从多聚蛋白中切割出来。晶体结表明，nspla由锌指结构域(Metl．Glu65)、PCPct(Pr066．Glnl66)和CTE(Ar9167-Metll80)3部分组成。锌指(Zincfinger，ZF)结构域的功能是否与转录有关，有待进一步实验验证【24．251。PCPa切割位点为180M”18l(PRRSV催化为点位为180HJ,S181)，识别序列：Cys．Ala-MetlSo．Ala．Val。CTE(Carboxyl．terminalextension，CTE)4 河南农业大学2013届硕士毕业论文作为底物，协助PCPa完成切割、释放nspla。研究表明，nspla能够干扰、抑制干扰素的产生，对PRRSV逃逸宿主细胞的免疫防御，成功感染细胞起重要作用【261。nspla通过抑制CBP(CREB-binding-protein)和NF(Nuclearfactor)．r．B下调PRRSV感染的宿主细胞产生的I干扰素(IFN—n／13)水平阶3们。nspla羧基末端14个氨基酸(RPKPEDFCPFE．CAM)对下调IFN．B和NF．心表达水平至关重要13¨1nspll3有两个主要结构域：NTD(N．terminaldomain，Alal．Set48)和PCPl3(ValgS-Pr0181)。此外，nspll3还存在2个辅助功能域：LKD(LinkerbetweentheN．andC．terminaldomains，Phe49-Thr84)和CTE(Asnl82一Gly203)[301。NTD具有核酸酶活性，可以被锰离子激活。PCPl3具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性，能切割产生nsplp。它识别位点序列为Trp-Tyr．Gly203．Ala-Gly-Lys。据报道，nspll3不但能够抑制干扰素的合成，而且其信号通路JAK-STAT[261o最近，nspl还发现与PRRSV感染细胞的多聚胞苷酸结合蛋I声t(Poly(C)．bindingproteinsPCBP)1和2结合调节病毒基因组的的复制和转录【321。nspll具有核酸内切酶活性(Endoribonuelease，NendoU)和抑制干扰素产生的功能。目前，NendoU除了套式病毒外，尚未在其他的RNA病毒中发现，因此，NendoU被认为是套式病毒的基因标志p引，将PRRSV或者EAV的NendoU活性位点碱基突变后其子代病毒的活性会大幅度下降。以上研究表明，NendoU可能与套式病毒的多个过程有关。2．3PRRSV编码的结构蛋白及其功能PRRSV的ORF2．7编码7中结构蛋白，分别为GP2a、E、GP3、GP4、GP5、M和Np“，GP2a是糖基化蛋白，包含2个保守的与感染性无关糖基化位点，是病毒复制的必需蛋白，能与细胞受体CDl63相互作用，具有抗压性。E蛋白是非糖基化蛋白，是寡聚蛋白离子通道，该蛋白可能涉及细胞融合和细胞内吞作用，从而促进病毒在宿主细胞内增殖。GP3具有高度的变异性，细胞外含有6个糖基化位点，以多聚体复合物形式整合到病毒粒子，对病毒的感染具有重要的作用，能诱导体液免疫和细胞免疫反应，糖基化位点131对于中和抗体产生具有重要影响，是病毒免疫逃逸的相关蛋白。GP4具有4个潜在的N．糖基化位点的次要结构蛋白，是病毒复制的必需基因，能介导GP2a、GP3和GP5形成多聚蛋白复合物，同时能作为辅助蛋白，介导病毒与CDl63受体反应，进而感染敏感细胞，可能诱导中和抗体，是欧洲免疫逃逸的相关蛋白。GP5和N蛋白作为PRRSV的主要结构蛋白，在病毒的复制与增值、致病与免疫机理、遗传变异等方面有重要作用，是目前的研究热点。N蛋白是刺激机体最早产生抗体的蛋白，但这些抗体不具有中和作用，但在诊断和血清学调查上的价值很大【35】：GP5是产生主要中和抗体的抗原，但其抗原表位不是病毒的免疫优势表位，此外，GP5还是PRRSV最易发生变异的结构蛋白‘36-37]。M蛋白由ORF-6编码产生，是动脉炎病毒属虽保守的非糖基化主要结构蛋白，在病毒的组装和释放过程中起重要作用，通过对二硫键形成GP5／M异源二聚体，对PRRSV的感染起关键作用，M蛋白能诱导细胞免疫，增强GP5 河南农业大学2013届硕士毕业论文蛋白诱导的体液免疫。3PRRSV免疫学研究进展3．1PRRSV免疫调节和免疫逃逸3．1．1PRRSV抑制I型干扰素的产生PRRSV获得性免疫的显著特征是它能调节机体的免疫反应。Miller(2004)等研究表明，即以dsRNA为诱导剂，PRRSV能抑制MARC．145细胞中I型IFN的表达，暗示TLR3信号通路受到干扰1381。目前，PRRSV抑制I型IFN的机理还不是十分了解，最新的研究表明NF．r,B在I型干扰素、炎性细胞因子和其他免疫应答相关分子的信号转导中处于中心位置，PRRSV通过诱导IkB降解导致NF．r．B活化【391。Luo等研究表明，PRRSV通过诱导IFN·p启动子刺激因子1(IFN．Bpromotorstamulatorl，／PSI)的失活而抑制IFN—p在MARC-145中的表达‘401。此外，PRRSV的非结构蛋白如nsplct、nspll3、nsp2及nspll具有强烈的抑制IFN的活性，nspI．0t抑制IFN调节因子3(IFNregulatoryfactor，IRF一3)介导的IFN启动子的活化，nspl．p抑制dsRNA介导的磷酸化和核移位，还可抑制STATI的核移位及JAK—STAT信号转导从而抑制IFN的合成及其信号转导，nspll也能抑制IFN的IRF·3介导的IFN启动子的活化，还可以抑制NF．rd3的活化。Lee等用polyl：C处理特定的PRRSV分离株感染的PAM时，IFN-毡合成增多，polyI：C是TLR3的偶联物，不同分离株的PRRSV对TLR3信号转导的影响不同[4qonspllB抑制IRF．3，而后者的活化是诱导IFN信号通路上的重要分子，PRRSV不同毒株nspll3的变异可能影响IRF．3的调节，PRRSV可以抵消由酵母tRNA所诱导的IFN的产生，IRF-3明显下调。这些研究表明，PRRSV可以通过合成拮抗蛋白而抑制干扰素的合成，阻断干扰素的信号作用，这些拮抗蛋白或者是在转录水平抑制，或者是在信号转导过程中干预来发挥作用。3．1．2PRRSV诱导细胞因子IL一10IL．10是一种多效性细胞因子，在PRRSV感染过程中，IL．10具有重要的调节PRRSV免疫反应的作用。早期研究发现，无论感染欧洲株，还是美洲株，猪外周血单核细胞的IL．10的mRNA的表达都增；ij口142I，并且在支气管肺泡巨噬细胞灌洗液中的IL．10浓度也增Hi431。感染PRRSV的单核细胞可能是产生IL．10的主要细胞m】，然而，Thanawongnuwech等发现PRRSV体外感染并未诱导明显的1L．10应答，甚至在单核细胞分化的细胞中无1L．10应答145I，目前，这方面的研究尚存在争议，这些不同的结果可能与实验中所使用的病毒株不同有关。相关研究表明，用不同的病毒株感染PRRSV阴性猪，发现可诱导PBMC产生不同的lL．10应答水平，Silva-Carnpa等(2009)研究表明不同的I型分离株感染单核细胞，IL．10的应答不刚4们。3．1．3PRRSV干扰正常的抗原呈递PRRSV可能干扰正常的抗原呈递和T淋巴细胞的活化。感染PRRSV的树突状细胞下6 河南农业大学2013届硕士毕业论文调细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)．I的表达147】。当PRRSV感染激活的单核细胞来源的树突状细胞时，均下调MHC．I、MHC．II及CDl4的表达，用灭活的PRRSV时则没有下调。同时，当用感染的树突状细胞与同源或异源的淋巴细胞作用时，细胞增殖反应下降，暗示在感染PRRSV的过程中树突状细胞递呈抗原的能力受到限制【48I。目前研究表明，PRRSV可能是通过改变巨噬细胞和树突状细胞的细胞因子，调节参与抗原递呈过程中的分子表达来下调机体的先天性免疫。3．1．4体液免疫PRRSV感染的显著特点是诱发迟发性的中和抗体，PRRSV主要的中和表位，即B表位，位于GP5蛋白N．末端胞外区上(37．44位氨基酸)149-51]，这个中和表位的两侧存在糖基化位点。但在GP5的N端(27～31位)有一个类似于人免疫缺陷病毒I型的诱导表位，即A表位，可以干扰主要表位B的免疫反应，延迟中和抗体的产生【521。小鼠试验中，在B表位和A表位之间插入一个辅助性T细胞表位可增加表位B的免疫原性【531。这暗示了诱导表位的存在是导致中和抗体推迟的主要原因。但是，诱导表位并不是PRRSV逃避体液免疫反应的唯一途径。GP5蛋白上有四个糖基化位点，位于其中和性表位内或临近其中和性表位。虽然所有PRRSV株对中和抗体具有同等敏感性，但是缺失上游高变区糖基化位点的PRRSV美国野毒株比缺失下游糖基化位点(N端44位)的PRRSV株在诱导中和性抗体方面更快速、更强烈1”I。3．2PRRSV免疫抑制PRRSV的免疫学特性和免疫抑制机理的研究受到国内外学者的关注，PRRSV主要侵害猪的巨噬细胞系统，特别是肺泡巨噬细胞，感染后其在数量上大大减少；PRRSV可抑制肺泡巨噬细胞的非特异性杀菌能力，巨噬细胞的功能也发生相应的变化，清除血源性颗粒能力减低，已有研究表明，PRRSV感染早期可引起猪肺泡巨噬细胞和外周血单核细胞的凋亡，外周血中的CD3+、CD4+和CD8+细胞比例下降，淋巴细胞的增殖活性受到影响，IL．2和TNF—位的分泌量提高【55。，感染PRRSV的肺泡巨噬细胞或外周血单核细胞表面MHCI(SLA．I)和MHCII(SLA．DR)类分子表达下调，使细胞免疫监视系统不易将病毒从感染猪中清除而导致机体持续感染【561。国内外的资料表明PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞功能、细胞免疫和体液免疫均具有明显的影响，PRRSV感染具有明显的免疫抑制作用。临床上，猪群感染PRRSV后易于其它病原体混合感染，Galina等证实，PRRSV可加剧猪链球菌(Streptococcussuis，ss)感染。ReethV发现PRRSV会加重呼吸道冠状病毒(Porcinerespiratorycoronavirus，PRCV)和猪流感病毒(Swineinfluengavirus，SIV)弓I发的病情，Rovira等通过感染试验发现，PRRSV可促进猪圆环病毒2型(Por2cinecircovirustype2，PCV2)在猪体内的增殖，使猪病理变化明显加重。在PRRSV感染猪中，经常分离出猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)、化脓性放线菌(CA)、副猪嗜血杆菌(Haemophiluparasuis，HPS)等【551。7 河南农业大学2013届硕士毕业论文3．3PRRSV疫苗PRRSV容易变异，具有抗体依赖性增强作用，引起病毒逃逸，另外，PRRSV还存在免疫抑制和持续性感染的免疫学性，这些特性就决定了PRRS难防难控。目前，针对该病还没有很好的治疗方法，主要是以疫苗防控为主。临床上，应用的PRRSV疫苗有灭活苗和减毒活疫苗。灭活苗产生的免疫主要以体液免疫为主，对清除PRRSV感染的巨噬细胞无效，因此免疫效果不理想【561；减毒活疫苗存在毒力返强的问题，相关报道已证实猪场在应用PRRSV减毒活疫苗后爆发PRRS或从猪场分离到的疫苗来源的PRRSV能引起肺炎的发生【571，因此开发安全、高效的新型疫苗是当前预防PRRS的迫切需要。PRRSV疫苗应具备至少四要素：效力、通用性、安全性及区分疫苗接种与自然感染的能力【581。首先，要明白的是参与诱发产生保护性免疫力的B细胞表位与T细胞表位。已报道过T细胞对PRRSV多聚肽有应答反应，但对T细胞表位目前尚无深入了解哆圳。详细的鉴定美洲株PRRSV与欧洲株PRRSV共有的主要表位是研发PRRSV通用疫苗首要任务。其次，研发减毒疫苗另一关键点就是要研究确定究竟病毒粒子或病毒基因组中那一成分参与、调节宿主免疫反应及其发生机制。因为一种疫苗的效力不仅与其自身免疫特性相关，还与其它毒株有关，所以研究基因多样性及不同PRRSV株间免疫病理特性是必需的。第三，疫苗的安全性。在疫苗研究过程中尽可能的消除任何存在毒力返强的可能性，在猪群中传播疫苗株的可能性应当最小甚至不存在。使用非复制型疫苗是目前确保安全性最明确的方法，而这方面的研究现在还不是很了解，如：尚不清楚非复制型疫苗是否能够诱导产生中和性抗体及足够的细胞免疫应答，因此，要深入开展关于PRRSV亚单位和载体依赖性疫苗及佐剂的研究。第四，研发的新型疫苗能够区分野毒株与疫苗株的疫苗。因为PRRSV的基因组较小，很难找到进行缺失的靶标序列，到目前为止，对病毒基因组必需成分及非必需成分的精细研究尚未知道，Nsp2少许基因缺失导致的PRRSV自然变种表明非结构蛋白是构建分型疫苗的靶标I俐。一种有效的PRRSV疫苗不仅要对同一株中相同及不同基因型别PRRSV提供保护防止感染，而且要对同一基因型中不同株提供保护防止感染。4RNAi研究进展RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象是一种由双链RNA(double，strandRNA，dsRNA)启动的序列特异性基因沉默机制，由Andrewz．Fire于1998年首次发现并命名161I。RNAi从线虫到人类细胞中都广泛存在，是自然界中生物抵抗外源基因或病毒的一种防御途径162。。近年来，随着分子生物技术的快速发展，RNAi技术已被广泛地应用于信号转导、基因功能研究、病毒防治、肿瘤基因治疗等多个领域，充分显示了其巨大的应用潜能。4．1RNAi机制在大多数真核生物细胞中，RNAi机制主要是由dsRNA所诱导的，一般发生在转录后8 河南农业大学2013届硕士毕业论文水平。RNAi过程包括起始阶段和效应阶段，在起始阶段，内源或外源的RNA在生物体内形成dsRNA，然后，被Dicer切割成19．2Int干扰性小RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)，在效应阶段，siRNA与诱导的沉默复合体(RNA．inducedsilencingcomplex，RISG)结合，结合了siRNA的RISG可以被ATP活化，活化形式的RISG利用其所包含的没有解链的siRNA作为向导，通过碱基互补配对，进行底物选择性降解，从而也决定了RNA干扰的序列特异性，底物被识别后，RISG即能切割靶基因mRNA，使基因的翻译水平下降，起到沉默基因的作用163l。在近些年的研究中发现了几种与RNA干扰作用相关的蛋白家族，其中包括解旋酶家族、RNaselII相关核酶、Argonaute蛋白质家族及依赖于RNA的RNA多聚酶(RNA—dependentRNApolymerases，RdRp)。。瑚。。。。晌．。。。。，篇。R‘。。砒dsRNAdsRNAdsRNA，byRdR。P0I／三巧三i三正Fsec。ndarysiRNAsbyDICERdegradedRN舢Y“”叫”3”图2：RNA沉默的分子步骤的模型Fi92：AmodelforthemolecularstepsinPdqAsilencingmiRNA是一类存在于动植物体内，长度为21．25nt非编码的小RNA分子片段，能调控基因表达和生长发育，其生成与siRNA相似，也需要RNaselll(Drosha、Dicer)酶、Argonaute蛋白质家族的参与。在细胞核内，RNaselIl(Drosha)酶将前体miRNA(Pri·miRNA)剪切成具有发卡结构、大小为70nt左右的母体miRNA(Pre-miRNA)，后者在转运受体Exportin一5(Exp-5)的作用下被转运至胞质，然后再被另一RNaselII(Dicer)酶剪切，最终加工成成熟的miILNA。在动物细胞中大多数miRNA与其靶mRNA并不是完全互补，miRNA则通过与对应mRNA的3，端非翻译区(3’UTR)结合阻止转录后的翻译，从而起到调节基因表达的作用。Dicer是RNaselII家族中能够特异性识别dsRNA的一个依赖ATP的内切酶，在ATP存在下，将外源性的dsRNA切割为19．2Int的siRNA。Dicer包含四个开放阅读框一两个催9 河南农业大学2013届硕士毕业论文化结构域、一个解旋酶结构域和一个PAZ结构域，以二聚体的形式催化靶基因，它的催化结构域在双链RNA上是反向平行的，共有四个活性位点形成，但是仅两侧的活性位点具有内切酶活性，这两个活性位点在距离22bp的位置切割双链RNA。siRNA进入蛋白复合体要求其5’端被磷酸化且3’末端要有两个不配对的核苷酸。siRNA长度的不同可能是因为各个物种间Diecr同源蛋白的空间结构具有一定的差异。在麦芽提取物研究中发现生物体内可能含有两种Dicer，一种是剪切内源dsRNA的，而另一种则是剪切外源的dsRNAl64J。A902蛋白Argonaute蛋白质家族的成员之一，A902是RNA诱导的沉默复合体的核心成分，编码4个结构域，分别是N末端、PAZ、MID和P1WI结构域[64l，PAZ区域能非特异性识别结合双链小RNA3’末端悬垂的2个核苷酸，MID与PIWI界面处的“保守口袋”识别结合小RNA的5’端第1位核苷酸，PIWI区具有切割mRNA的催化活性中心。Argonaute蛋白质家族成员根据在各个物种中分布的数量和种类的差异性可分为3类：AGO-like、PIWI．1ike、GROUP3。A902通过结合miRNA和包括外源转入的siRNA和病毒siRNA来切割于小RNA对应的靶mRNA。RdRp是以RNA为模板合成互补RNA分子的一种酶。在RNA干扰的过程中，RdRp可能是以初始siRNA的反义链为引物，以mRNA为模板合成dsRNA。在线虫体内，尽管一个细胞仅仅含有几个双链RNA分子，但却能够产生整体的RNA干扰效应，并且这种效应能够遗传给后代。表明RNA干扰可能存在放大效应。Diecr将长的双链RNA(dsRNA)切割成很多siRNA，而每个siRNA分子又具同源性，能够结合同源的mRNA，从而将干扰作用放大。研究表明在RNA干扰过程中可以合成新的双链RNA，Lipdariera掣65J提出了随机降解PCR(randomdegradativePCR)模型，也就是siRNA的反义链结合靶mRNA后，以siRNA反义链为引物、靶mRNA为模板，在RdRp的催化下可以合成新的双链RNA，随后Dicer又将新的双链RNA切割成次级的siRNA，新siRNA再去特异性的识别mRNA，经过以上过程再形成新的siRNA，通过不断的循环过程，干扰效应被不断的放大。4．2RNAi是一种抗病毒免疫反应RNA病毒，除了逆转录病毒，在病毒复制的过程中都会产生长的双链RNA(dsRNA)，与含有茎环结构，碱基不完全匹配的内源性小miRNA不同，病毒的dsRNA比较长而且是完全匹配，在植物和无脊椎动物中，病毒的dsRNA可以被Dicer剪切成小的siRNA，与RISG结合，形成RISG复合体，siRNA指引R1SG复合体靶向与其互补的mRNA，在这个过程中相关的靶基因是病毒的mRNA和基因组中的micro．RNA，这些mRNA与病毒的siRNA完全互补，RISG复合体结合到靶基因的mRNA后导致其降解，从而抑制病毒的复制，并且，在体内RdRp酶的作用下，这种抑制病毒复制的RNAi效应可以被放大‘65侧。表明RNAi是机体一种保守的先天性抗病毒的免疫反应。然后，在哺乳动物中是否也存在RNAi这种抗病毒的机制一直存在着争议，但是，越来越多的实验结果表明RNAi同样也是哺乳动物细胞先天性抗病毒的免疫反应【63】。10 河南农业大学2013届硕士毕业论文4．3RNAj一基因调控的工具人们最早是在植物和脉胞菌中发现dsRNA能够抑制特定基因表达的现象。后来，AndrewFire和CraigMello在线虫体内进行反义RNA实验时，发现正义RNA也有非常高的基因沉默活性。如果把正义RNA和反义RNA同时注入到秀丽隐形杆线虫体内，其诱导靶基因沉默的效率将比单独注射反义RNA时提高10俐67J。由该实验结果推断，双链的RNA可以触发高效的基因沉默机制，同时也在很大程度上降低了靶基因mRNA的表达水平[61-62】。后来这一现象被人们称之为RNAi。Elbashir将siRNA转染入小鼠和人的细胞中诱导产生RNAi现象【631，说明外源导入siRNA能够有效地引发RNA干扰。RNAi技术的发展显示，RNAi现象就是当外源性的裸露dsRNA被内源性的蛋白酶识别并降解为siRNA，siRNA与目标基因的mRNA同源时，会诱导该mRNA发生基因沉默。在RNAi技术中，siRNA能介导对同源基因转录后水平的抑制或是诱发胞质内同源mRNA降解的转录后基因沉默。目前，获得siRNA的方法有三种。(1)体外直接的化学合成siRNA法，siRNA化学合成的方法比较方便且不受碱基限制，特异性强，敏感性好。但是siRNA不易保存，在体外易被RNA酶被降解，且作用的半衰期较短，需要多次导入。(2)体外转录合成方法：以DNAoligo为模版，RNA酶在体外转录，分别产生正义链和反义链的RNA单链，两条链退火后形成长的dsRNA，被基因工程酶切割成siRNA小片段，产物经纯化后就可产生针对靶基因不同位点的siRNA混合物，能够有效地沉默靶基因的表达。但此方法的特异性不强，有可能会诱发非特异性的抑制。(3)质粒载体体内表达法：目前，在国内外实验室中广泛采用miRNA表达载体和使用短发夹RNA(shRNA)表达框制备siRNA，shRNA产生的RNA类似于pre．miRNA，可以被细胞内Dicer酶加工处理成具有功能的siRNA，从而发挥RNAi作用畔l。这些方法表达的siR．HA能够与靶mRNA精确匹配从而诱导靶基因沉默。RNAi技术与功能性基因组的研究。RNAi作为一种新型研究基冈组学的技术，与传统基因组学研究方法相比，更迅速、更高效、更直接、特异性、低毒性、周期短且更易操作等诸多优点。因此，目前国内外很多实验室将RNAi作为一种强有力的研究功能性基因组的工具。比如针对目的基因设计多靶点、特异性的sflLlqA，将其转染到哺乳动物的细胞中能够诱导该基因的沉默，而且在体外培养的细胞中也可以实现这种基因沉默的效果。RNAi技术与信号通路的研究。利用RNAi技术对特定的功能基因进行敲除，找出在某一个信号途径被阻止的表型中降解的mRNA，从而发现参与该信号传递通路的一些信号分子168l。研究中还发现了许多miRNA可能以调节基因的表达、参与发育的过程。如：拟南芥中miRNA．172能够调节花的发育：线虫中的lin-4和let一7基因能够调控幼虫的发育№9。701。 河南农业大学2013届硕士毕业论文RNAi技术与抗病毒的研究。针对病毒基因组设计特异性、多靶点的siRNA能有效抑制病毒复制。大量研究表明RNAi技术在抗病毒治疗上非常有效，目前，大都是利用体外人工合成的特异性siRNA以降解病毒RNA或mRNA，达到抗病毒的作用。目前，RNAi技术抗病毒作用的研究大多集中在人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、SARS．冠状病毒(SARS．CoY)等方面。RNAi针对特异性的序列，可以利用这个特性对恶性肿瘤基因和一些传染性疾病基因进行特异性基因表达沉默，从而达到更好的治疗目的。设计能靶向干扰宿主细胞病毒受体基因表达的siRNA序列可以抵抗病毒的感染。另外，RNAi还可以通过寻找一个基因家族的保守序列，设计这个保守序列的双链RNA，注入体内后能够得到抵抗多种病毒的感染。比如肿瘤就是多基因互作造成的，如果用传统的技术抑制一个癌基因表达则不能完全阻止肿瘤的扩大，而RNAi利用该技术可以使同一基因家族的多个基因同时都得到表达抑制。5RNA沉默抑制子(RNASiIenoingsuppressorRSS)的研究进展RNAi是一种古老的，保守的先天性抗病毒的防御机制，而针对寄主的这种防御机制，许多病毒已进化通过编码RNA沉默抑制子来抵抗这种防御机制。目前，已从植物、动物和人类病毒中鉴定了20多种RSSs，RSSs的鉴定和作用机理研究已成为病毒学研究热点。在哺乳动物病毒中，病毒蛋白和非编码的病毒RNAs通过不同机制来抑制RNA(miRNA／siRNA)干扰途径。在相关的研究中我们发现，某些病毒的蛋白或非编码的RNAs就是RNA沉默的抑制子，同时也具有拮抗干扰素的作用。图1：不同病毒蛋白的RSS抑制宿主RNAi通路Figl：SchematicillustrationofRSSactivityofdifferentviralproteinsthatinhibitthehostRNAipathway5．1⋯V的Tat蛋白介导RNA沉默抑制 河南农业大学2013届硕士毕业论文Tat蛋白是HIV的结构蛋白，目前研究表明，HIV在复制过程中，Tat蛋白帮助病毒逃逸宿主细胞RNAi抗病毒的防御机制，而且在外周血单核细胞中Tat蛋白抑制了miRNA介导的基因调节作用【『71】。Bennasser等研究表明Tat蛋白主要是通过作用RNAi通路中关键酶，Dicer，从而抑制RNA沉默【72。。Tat蛋白是核蛋白，定位在细胞核，但是Dicer是在胞质中将为前体dsRNA／miRNA剪切成有小RNA，那么Tat蛋白是如何作用于胞质中的Dicer并抑制其功能的，有一种可能就是Tat被输送到细胞核前，在胞质合成时就发挥这种抑制作用。除了直接抑制Dicer的功能，HIV-I的RNA可以产生si／miRNA作为诱饵，比如TAR的RNA，结合了TRBP，从而使Dicer不能发挥剪切si／miRNA的作用I乃J，以上研究表明，HIV-1通过直接或问接方式抑制RNAi通路中关键蛋白Dicer，从而实现病毒在宿主细胞内成功的增殖。Tat蛋白也是干扰素拮抗蛋白，体外实验表明，Tat蛋白抑制干扰素介导的氮氧化合物的合成，而巨噬细胞是通过这种氮氧化合物来杀死病原微生物【74】，目前研究表明，Tat蛋白诱导表达了细胞因子信号2(SOCS．2)的抑制子，直接抑制STATl，而STATI是干扰素下游重要的转录冈子，冈此，1甜蛋白抑制了干扰素诱导的基因表达【”】，从而逃逸了宿主抗病毒的防御机制。5．2人类A型流感病毒的NSl蛋白作为RsSNSl是人类A型流感病毒的非结构蛋白，具有RNA结合域，也是一个重要的毒力因子，在增强病毒复制和抵抗胞内抗病毒防御中起着重要作用，在人的HEK．293细胞上NSl能够恢复由shRNA诱导的抑制萤火虫荧光素酶表达的表达量176。，证实了NSl具有潜在的RSS活性。流感病毒不同毒株的NSl蛋白具有不同程度的RNA沉默抑制的活性，其中强致病性毒株A／WSN／33被发现其NSI蛋白的RSS活性是最强的。虽然NSI是核蛋白，存在胞核内，但也存在胞质中。NSI的RNA结合域具有高度的dsRNA亲和力，NSI可与Dicer竞争结合dsRNA致使I斟A沉默效果明显F降m】。除了RSS的活性，NSl还抑制了胞质中dsRNA感受器RIGll731，与蛋白激酶P(PKR)竞争dsRNA，从而阻断了dsRNA诱导的干扰素途径1791。5．3丙型肝炎病毒的核蛋白和外膜蛋白(E2)作为RssHCV的核蛋白是结构蛋白，是病毒核衣壳的重要组成部分。在病毒复制过程中，除了包装病毒的RNA，HCV的核蛋白在Hela细胞上还能够减少RNAi诱导报告基因的抑制量。HCV的核蛋白通过作用于RNAi中关键酶Dicer，恢复了被抑制基因的表达量【801。HCV的RNA中间体和内在核糖体进入位点(internalribosomalentrysites，IRES)的RNA是Dicer的竞争性底物，HCV的核蛋白定位于胞质中，这更加有利于它与Dicer竞争成熟的sWmiRNA，这也暗示了HCV的核蛋白是以小RNA为桥梁，通过作用于Dicer，从而阻碍了RNA干扰的效果。HCV的外膜蛋白E2同样也有RSS的活性。E2蛋白作用于RNAi通路中另一关键蛋白Argonaute2(A902)，使其功能失活。在胞质中，A902、Dicer、TRBP和成熟的sUmiRNA 河南农业大学2013届硕士毕业论文组成了RNA沉默复合体RISG，RISG降解靶基因mRNA，抑制其蛋白表达。E2蛋白对A902抑制是一种剂量依赖型的【8l】，然而，E2蛋白发挥RSS作用的作用机理目前尚不是很了解。HCV的核蛋白和E2蛋白抑制了宿主细胞的RNAi抗病毒防御作用，使病毒在宿主细胞内成功复制、增殖。另外，HCV的核蛋白和E2蛋白抑制了核转录因子，如STATl，阻断了干扰素介导的抗病毒反应【82．831。因此，HCV的核蛋白和E2蛋白能够帮助病毒成功的逃逸宿主防御系统。为发展更好的抗病毒治疗方法，我们要深入研究这些蛋白间相互作用。5．4埃博拉病毒的VP35作为RSS埃博拉病毒是单股、负链RNA病毒，VP35是其非结构蛋白，在病毒复制中，VP35包装病毒的RNA，从而形成新的病毒颗粒L84J。相关研究表明，在哺乳动物细胞中，VP35抑制RNAi，促进病毒复制。VP35和HIV-1的Tat蛋白一样都能够恢复在RNAi中被抑制基因的表达量捧引。VP35的RNA结合域不仅对病毒RNA的包装很重要，而且也是VP35具有RSS活性所必须的。RNA结合域对大部分dsRNA都有亲和力，这也暗示了，VP35是通过减少了RNAi效应中的小RNA，从而阻碍了RNAi效果。VP35和流感病毒的RNA结合域的氨基酸序列具有相似性，相关研究结果发现，这种RNA结合域是I型干扰素的抑制子，VP35能够抑制RNA解旋酶和RIG．1介导激活干扰素调节因子3(IRF3)作用，而后两者能上调干扰素的表达【黼】。以上研究表明埃博拉病毒的VP35蛋白是RNA沉默抑制子同时也是干扰素拮抗蛋白，并且他们作用关键点点都是在RNA结合域，这也暗示了RNA沉默抑制子和干扰素拮抗蛋白间存在某些联系。5．5痘病毒的EL3蛋白作为RSS痘病毒的EL3蛋白是一个毒力因子，抵抗宿主细胞先天性抗病毒反应，促进病毒复制，EL3蛋白有一段高保守性RNA结合域[87-88】，EL3蛋白作为RSS存在争议，前期研究表明，EL3蛋白通过RNA结合域结合了胞质中小RNA，减少了RNAi过程中小RNA，从而阻断RNA沉默效果，但是，目前没有研究表明，EL3蛋白在哺乳动物细胞可以抑制由siRNA或shRNA介导RNAi作用【89】，所以EL3蛋白是否是RSS有待后续深入的研究。另外EL3蛋白抑制IFN．B的激活【901。5．6腺病毒非编码RNA作为Rss腺病毒是通过小RNA介导方式抑制RNA沉默过程，腺病毒非编码RNA分子其自身可形成类似于miRNA二级结构(茎环结构)，这些非编码RNA增强了病毒mRNA转录，促进病毒增殖【9l】。此外，研究报道，腺病毒非编码RNA抑制eIF2a激酶和PKR的活性，从而阻碍了蛋白合成的。在病毒感染大量复制后，vAI和VAII充分表达，可作为竞争性底物与Dicer酶相结合从而降低和阻断RNA沉默途径‘921。Cullen等报道VAI抑制shRNA诱导沉默，但不影响由合成的siRNA诱导RNA沉默，VAI通过抑制shRNA运输出核、竞争结合Exportin一5或直接与Dicer相结合等抑制RNA沉默过程【93】。研究表明，病毒编码产生的具有miRNA类似特征的小RNA，是动植物病毒感染宿主时抑制RNA14 河南农业大学2013届硕士毕业论文沉默的一种普遍机制，从而逃逸宿主抗病毒的防御机制。VAI同样也是干扰素的拮抗蛋白，VAl是通过抑制PKR的活性来阻断干扰素抗病毒的作用，从而促进病毒的复制。缺少VAl的腺病毒对干扰素介导的抗病毒反应很敏感，因此，腺病毒的VARNA在抗病毒治疗方面可能是一个潜在的优势。6本研究的意义我国自1996年首次分离到PRRSV以来，PRRSV感染呈现广泛流行的趋势，PRRS，尤其2006年春季流行的高致病性PRRS，严重危害着养猪业发展，给养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV特殊的免疫调节和免疫逃逸机制是PRRS防治的关键问题。RNAi作为宿主细胞抑制病毒复制、清除病毒的一种先天性免疫机制，是宿主重要的免疫防御系统，许多持续性感染的病毒都存在一定的机制拮抗RNA诱导的基因沉默。持续性感染是PRRSV感染的显著特征之一，表明PRRSV可能会抑制RNA诱导的基因沉默。能够抑制RNA沉默的病毒一般都能抑制干扰素的产生，PRRSV感染过程中能够抑制干扰素的产生，逃避宿主先天性免疫反应。RNAi和干扰素系统是机体先天性免疫的第一道防线，PRRSV既能抑制RNAi诱导的基因沉默又能抑制干扰素的产生，揭示PRRSV可能存在抑制宿主先天性免疫的机制。本研究发现PRRSV在MARC一145细胞上能够抑制RNA诱导的基因沉默。病毒一般是通过病毒蛋白和非编码的病毒RNAs来抑制RNA沉默。PRRSV的nspla和nspll具有抑制RNA诱导基因沉默的作用，表明nspla和nspll可能是抑制RNA沉默的抑制子，并且nspla和nspll的木瓜蛋白酶活性和核酸内切酶活性是其发挥RNA沉默抑制子活性所必需的，为研究新型疫苗及对PRRS流行的防治提供理论依据。大多数RNA沉默抑制子同时也是干扰素的拮抗蛋白，相关研究证实nspla和nspll能够抑制IFN．B的产生，是干扰素的拮抗蛋白。这揭示PRRSV的nspla和nspll既是RNA沉默的抑制子也是干扰素的拮抗蛋白，nspla和nspl1可作为研究IⅢA沉默抑制子和干扰素拮抗蛋白之间桥梁，为研究PRRSV免疫逃逸提供新的立脚点。 河南农业大学2013届硕士毕业论文16 河南农业大学2013届硕士毕业论文引言猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属(Arterivirus)，动脉炎病毒科，套式病毒目叫idoviruses)。1987年该病首次在美国出现，随后，1991年荷兰学者Wensvoort博士及其同事首次用原代的猪肺巨噬细胞(PorcineAlveolarMacrophages．PAM)分离到一株欧洲型PRRSV，并命名为Lelystadvirus(Lv)，1992年美国学者Collins等分离到PRRSV美洲型毒株ATCCVR．2332。因此，国际上将PRRSV分为以ATCCVR-2332为代表的美洲型和以Lv为代表的欧洲型14-51。’我国于1996年郭宝清等首次在感染PRRSV的母猪的流产胎儿中分离到一株PRRSVl6J。目前，PRRS在全世界广泛流行，该病以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为主要特征，给养猪业造成巨大的经济损失。国内外的资料表明PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞功能、细胞免疫和体液免疫均具有明显的影响，PRRSV感染具有明显的免疫抑制作用。RNA干扰是由小干扰RNA(smallinterferingRNAs，siRNAs)和micmRNA(miRNA)所诱导的互补mRNA的沉默，是真核生物一种保守的转录后基因调控机制。胞质中的长的双链RNA(dsRNA)经Dicer酶剪切加工成19．2Int的siRNA，siRNA与诱导的沉默复合体(RNA．inducedsilencingcomplex，RISG)结合，结合了siRNA的RISG可以被ATP活化，在Argonaute(Ago)蛋白的帮助下，活化形式的RISG利用其所包含的没有解链的siRNA作为向导，通过碱基互补配对，进行底物选择性降解，从而也决定了RNA干扰的序列特异性，底物被识别后，RISG即能切割靶基因mRNA，使基因的翻译水平下降，起到沉默基因的作用。然而，细胞内源性的miRNA是由细胞miRNA基因编码的，大多数RNA聚合酶转录产生的初级的miRNA(Pri—miRNA)，在细胞核内，,RNaselll(Drosha)酶将初级Pri．miRNA剪切成具有发卡结构、大小为70nt左右的前体miRNA(ere．miRNA)，后者在转运受体Exportin．5(Exp．5)蛋白的作用下被转运至胞质，然后再被另一RNasellI(Dicer)酶剪切，最终加工成成熟的miRNA。在动物细胞中大多数miRNA与其靶mRNA并不是完全互补，miRNA则通过与对应mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)结合阻止转录后的翻译，从而起到调节基因表达的作用。短发夹RNA(shRNA)，与前体miRNA的结构类似，已被用作细胞中的siRNA的前体分子。RNAi广泛存在于植物和无脊椎动物中，是一种保守的、先天性抗病毒的免疫反应。在病毒感染的过程中，病毒特异性的dsRNA和micmRNA可以激活RNAi抗病毒的活性。dsRNA或miRNA经Dicer酶剪切处理，最终导致病毒RNA的降解，病毒在受到RNAi抵抗过程中会通过病毒蛋白或非编码的病毒RNA来抑制RNA沉默，即RNA沉默抑制子(RNAsilencingsuppressor，RSS)，从而使病毒在宿主细胞内复制、增殖，促进病毒感染。然而，RNA沉默是否可以作为哺乳动物先天生抗病毒免疫反应仍存在争议。免疫抑制和持续感染是PRRSV感染的重要免疫学特征，许多持续性感染的病毒都存在一定的机制拮抗RNA诱17 河南农业大学2013届硕士毕业论文导的基因沉默，并且PRRSV的感染能抑制干扰素的产生，那么PRRSV可能会存在抑制RNA诱导的基因沉默的作用，从而逃避宿主先天性的抗病毒免疫。18 河南农业大学2013届硕士毕业论文第二部分在MARC一145上构建RNA干扰的模型及其干扰效果鉴定1材料和方法1．1材料1．1．1细胞、质粒及载体IVIARC一145细胞、PSGHl、PSGHl-shGFP、PSGHi—shLuc、pcDNA6．2、pcDNA6．2-MDV-miR4、psiCHECK—MDv-uL28uTR质粒均由河南省动物免疫学重点实验室保存；PGL-4．17、PhRL-TK购自Promega；人上合成的dsRNA购自上海柏业有限公司(Sangon)。1．1．2主要试剂主要试剂来源DMEM基础培养基胎牛血清(Hyclone)质粒提取试剂盒脂质体Lipofectamine2000双荧光素梅报告基因检测试剂盒美国GIBCO公司德国Sigma公司大连TaKaRa公司Invitrogen公司Promega公司1．1．3主要试剂的配制1．1．3．1无血清DMEM培养基的配制取一包DMEM粉末，用高压灭菌去离子水溶解并定容至1000mL，用约3．79的NaHC03调节pH值为7．0，混匀后，用0．229m滤膜过滤除菌，无菌分装每瓶大约450mL，置于4。c冰箱保持备用，使用时按照要求按比例加入胎牛血清。1．1．3．2PBS(磷酸盐缓冲液)的配制称取KH2P040．249，KCl0．29，NaCI89，Na2HP04(Na2HP04·12H20)1．449，用800mL去离子水溶解，定容至1000mL，调节pH值为7．4，1．034x105Pa高压灭菌，置于4。C保存备用。1．1．3．35％胰酶溶液的配制称取59胰蛋白酶，溶解于100mL去离子水，并于0．22p．m滤器过滤，一20。C保存备用。1．1．3．40．4％EDTA储存液称取乙二胺四乙酸纳(EDTA)0．4g，溶入100mL去离子水中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，高压灭菌，常温保存备用。1．1．3．510ji胎牛血清DMEM培养基配置19 河南农业大学2013届硕士毕业论文从一200C冰箱中取出灭活过的胎牛血清，向500mL无血清DMEM培养基中加入50mL的胎牛血清，混匀，此过程在无菌超净台中操作，置一20。C保存备用。1．1．3．64％病毒维持液的配置从一200C冰箱中取出灭活过的胎牛血清，向100mL无血清DMEM培养基中加入4mL的胎牛血清，混匀，此过程在无菌超净台中操作，置一20。C保存备用。1．1．4主要仪器CO2恒温培养箱日本SANYO公司倒置荧光显微镜LEICA倒置显微镜重庆光电仪器总公司SW-CJ．2FD型超净工作台苏州净化设备有限公司4"C和．20。C冰箱青岛海尔股份有限公司．800C低温冰箱日本二洋公司WFZ751型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司高速台式离心机(5415D)购自德国EPPENDORF公司微量移液器德国EPPENDORF公司PTC．200型PCR仪美国基因工程公司漩涡震荡仪北京鼎国生物技术公司数显水浴锅国华电器有限公司ZS．2200型凝胶成像仪美国基因工程公司ECP3000三恒多用电泳仪北京六一仪器厂电子分析天平METTLER公司移液枪上海大龙医药设备有限公司自动双重纯水蒸镏器上海亚荣生化仪器厂LS-B35L型立式压力蒸汽灭菌锅江阴滨江医疗设备厂1．1．5核苷酸序列以下是实验中用到寡单链核苷酸序，由上海柏业有限公司合成。siRNA-Lue-sense5'-UUGUUUUGGAGCACGGAAA(dTdT)·3’siRNA·Luc·antisense5'-UUUCCGUGCUCCAAAACAA(dTdT)-3’siRNA-Con-sense5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU(dTdT)一3’siRNA-Con—antisense5"-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG(dTdT)．3’1．2方法1．2．1shRNA干扰表达载体的干扰效果鉴定1．2．1．1利用PSGHl载体转录shRNA对EGFP基因进行干扰1．2．1．1．1293T细胞的复苏及培养从液氮罐中取出一支(1mL)冻存的293T细胞，迅速于37"12水浴锅中融化，将融化的细胞悬液转入离心管内中，加入10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，1000rpm离 河南农业大学2013届硕士毕业论文心5min，弃去上清，重新加入10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，吹散细胞，置于培养箱(37。C、5％C02)中培养。第二天弃去培养基，加入新鲜的含10％胎牛血清DMEM培养基，约2．3天后细胞长满单层，用150pL的5％胰酶和等体积的O．4％EDTA及3mL的PBS混合液消化细胞，待细胞开始收缩变圆时，用5mL含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，并将细胞从细胞瓶壁上吹落转入离心瓶，1000rpm离心5min，弃去上清，用6mL含10％胎牛血清DMEM培养基悬浮细胞并转入细胞瓶中，置于培养箱中培养。依据以上方法将293T细胞传代两次，使细胞达到最佳生长状态时即可用于转染实验。1．2．1．1．2PSGHl、PSGHl．shGFP瞬时转染293T细胞按照大连TaKaRa公司的质粒提取说明，提取质粒PSGH和PSGH1．shGFP，测浓度后于．20℃保存备用。提取过程如下：(1)将5mL菌液转移到EP管中，做好标记，于i2000rpm离心lmin，加入250此预冷的S1溶液，震荡使沉淀菌体悬起并充分混匀；(2)加入250uLS2溶液，轻轻上下混匀5-6次，室温下静置不超过5min；(3)加入350uL溶液S3后出现白色絮状物，轻轻混匀约6次，室温下静置1min，于12000rpm，4℃，离心12min；(4)将上清液转移到相应的柱子中，注意不要吸到白色物质，然后把柱子放入2mL的离心管中，做好标记，于12000rpm离心1min。重复离心一次；(5)弃滤液，向柱子中加入500uLWl溶液，于12000rpm离心1min：(6)弃滤液，向柱子中加入700乩W2溶液，于12000rpm离心lmin，将此步骤重复一次。(7)在无菌超净台中操作，弃滤液，盖好盖子，在超净台外空甩一次；(8)无菌操作，将柱子转到标记的1．5mL的离心管中，加入已经预热(65℃)的30／aLddw，于12000rpm离心1min，将滤液重新加入柱子，再于12000rpm离心1rain：(9)将所得的质粒溶液吸出2-3pL，用紫外分光光度计检测质粒溶液的DNA含量，做好标记。将培养至最佳状态的293T细胞弃去培养液，用3mLPBS洗一遍，然后用150laL的5％胰酶和等体积的0．4％EDTA及3mL的PBS混合液消化细胞，开始收缩变圆时，用含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，并将细胞从细胞瓶壁上吹落转入离心瓶，1000rpm离心5min，弃去上清，然后加人适量的含10％胎牛血清的DMEM培养基，将细胞悬起，利用计数板计数。293T细胞按3x105cells／500IxL浓度将细胞悬液铺进24孔的细胞培养板内(每孔500儿细胞悬液)，然后将细胞板放置培养箱中培养。待细胞贴壁后(大约24小时后)，计算需要PSGHl和PSGHl．shGFP质粒的体积后，按脂质体Lipofectamine2000的转染要求将PSGHl、PSGHl一shGFP质粒分别转染已经铺在24孔细胞培养板中的293T细胞中。具体2l 河南农业大学2013届硕士毕业论文操作如下：取一个1．5mL的EP管，标记为A管，加入100laL无血清的DMEM，同时加入4此的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。再取两个1．5mL的EP管，分别标记为B、C管，分别加入50此无血清的DMEM，然后分别取准备好的PSGHl和PSGHl-shGFP质粒各O．81．tg加入B、C管中。5rain后，向B管和c管分别加入个52}．tLA管中的溶液，轻轻吹打混匀后静置20min使脂质体包裹DNA，然后加入前提铺好的细胞板中，将细胞板置于培养箱中培养。48h后置倒置荧光显微下观察转染情况。1．2．1．1．3倒置荧光显微镜检测转染后293T细胞的荧光量将分别转染PSGHI、PSGHI．shGFP质粒的293T细胞培养48h后，将细胞从培养箱取出，置倒置荧光显微下观察EGFP绿色荧光。1．2．1．2利用PSGBI载体转录shRNA对萤火虫荧光素梅报告基因(Luc)进行干扰1．2．1．2．1MARC-145细胞复苏及培养从液氮罐中取出一支(1mL)冻存的MARC．145细胞，迅速于37"C水浴锅中融化，将融化的细胞悬液转入离心管内于，加入10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃去上清，重新向细胞瓶加入10mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，放置培养箱中培养。第二天弃去培养基，加入新鲜的含10％胎牛血清DMEM培养基，约2．3天后，细胞长满单层，用150p,L的5％胰酶和等体积的O．4％EDTA及3mL的PBS混合液消化细胞，待细胞开始收缩变圆时，弃去消化液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，并将细胞从细胞瓶壁上吹落转入离心瓶，于1000rpm离心5min，弃去上清，用6mL含100／o胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞并转入培养瓶中置培养箱培养。依据以上方法将MARC．145细胞传代两次，使细胞达到最佳生长状态时即可用于转染实验。1．2．1．2．2PGL-4．17、PhRL-TK、PSGHl、PSGHI-shLuc瞬时转染MARC-145细胞按照大连TaKaRa公司的质粒提取说明，提取质粒PGL·4．17、PhRL-TK、PSGHI和PSGHl一shLuc，测浓度后丁．20。C保存备用。具体提取过程见1．2．1．1．2。将培养至最佳状态的MARC．145细胞弃去培养液，用3mL的PBS洗一遍，然后用150pL的5％胰酶和等体积的4％EDTA及3mL的PBS混合液消化细胞，开始收缩变圆时，弃去消化液，用适量的含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，并将细胞从细胞瓶壁上吹落转入离心瓶，1000rpm离心5min，弃去消化液，然后加适量的含10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞悬起，利用计数板计数。MARC．145细胞按lxl05cells／500¨L浓度，将细胞悬液铺进24孔的细胞培养板内(每孔500uL细胞悬液)，然后将细胞置于培养箱中培养。待细胞贴壁后(大约24小时后)，计算需要PGL-4．17、PhRL．TK、PSGHl和PSGHI·shLuc质粒的体积后，按脂质体Lipofectamine2000的转染要求将PGL．4．17、PhRL．TK、PSGHI和PSGHl．shLUC质粒分别转染已经铺在24孔细胞培养板中的MARC．145细胞中。将PGL．4．17、PhRL-TK质粒量不变，改变干扰表达质粒PSGHl．shLuc的含量，分别按 河南农业大学2013届硕士毕业论文100ng、200ng、400rig、800rig瞬时转染MARC-145细胞，对照质粒PSGHl也做同样的浓度梯度改变，以PSGHl．shLuc和PSGHl转染浓度为800ng为例。具体操作如下：(1)取一个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300此无血清的DMEM，同时加入12uL的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。(2)再取两个1．5mL的EP管，分别标记为B、C管，分别加入150p．L无血清的DMEM，然后分别取准备好的PSGHl和PSGHl-shLUC质粒各2．4pg加入B、C管内，将B管和C各加入1．2pg的PGL-4．17质粒和0．15lag的PhRL-TK质粒。(3)向B管和C管分别加入个150p．LA管中的溶液，轻轻吹打混匀后静置20min使脂质体包裹DNA，然后混合液按1009,L／孔加入提前铺好的板中，每个样品做重复3孔，将细胞板置培养箱中培养，4-6小时后弃去无血清DMEM，每孔中加入500uL含10％胎牛血清的DMEM。(4)转染48h后将24孔细胞板从细胞培养箱中取出，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验重复三次。1．2．2mi—RNA干扰表达载体的干扰效果鉴定1．2．2．1pcDNA6．2、pcDNA6．2-MDV—miR4、psiCHECK—MDV—UL28UTR瞬时转染MARC一145细胞按照大连TaKaRa公司的质粒提取说明，提取质粒pcDNA6．2、pcDNA6．2．MDV-miR4、psiCHECK．MDV-UL28UTR，测浓度后于．20℃保存备用，提取步骤同上。将pcDNA6．2、pcDNA6．2一MDv-miR4、psiCHECK．MDV-UL28UTR质粒转染MARC．145细胞，MARC．145细胞按l×105cells／500btL浓度将细胞悬液铺进24孔的细胞培养板内(每孔500pL细胞悬液)，然后将细胞置培养箱中培养。待细胞贴壁后(大约24小时后)，计算需要pcDNA6．2、pcDNA6．2-MDV-miR4、psiCHECK．MDV-UL28UTR质粒的体积后，按脂质体Lipofectamine2000的转染要求将pcDNA6．2、pcDNA6．2．MDV-miR4、psiCHECK．MDV-UL28UTR质粒分别转染已经铺在24孔细胞培养板中的MARC．145细胞中。pcDNA6．2、pcDNA6．2．MDv-miR4、psiCHECK—MDV-UL28UTR质粒浓度分别按100ng和400ng瞬时转染MARC-145细胞，以400ng的转染浓度为例。具体操作如下：(1)取一个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300pL无血清的DMEM，同时加入121JL的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。(2)再取两个1．5mL的EP管，分别标记为B、C管，分别加入150¨L无血清的DMEM，然后向B管各加入1．2lag的peDNA6．2和psiCHECK-MDV-UL28UTR质粒，向C管各加入1．21ag的pcDNA6．2-MDV．miIH和psiCHECK—MDV-UL28UTR质粒。(3)向B管和c管分别加入个1501JLA管中的溶液，轻轻吹打混匀后静置20min使脂质体包裹DNA，然后混合液按100pL／孑L加入提前铺好的板中，每个样品做重复3孔， 河南农业大学2013届硕士毕业论文将细胞板置培养箱中培养，4-6小时后弃去无血清DMEM，每孔中加入500皿含10％胎牛血清的DMEM。(4)转染48h后将24孔细胞板从细胞培养箱中取出，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验重复三次。1．2．3人工合成的dsRNA干扰效果的鉴定1．2．3．1人工合成的dsRNA转染MARC-145细胞按照上海Bioneer公司人工合成的dsRNA说明书，将人工合成的dsRNA稀释到合适浓度，置．20"C保存备用。dsRNA按5nM和100riM的浓度分别瞬时转染MARC．145细胞，以100riM为例，具体操作过程如下：(I)转染前～天，铺24孔细胞，MARC．145细胞浓度每孔按1×10Scells／500此，待细胞生长合适浓度进行转染实验。(2)弃去含10％眙牛血清DMEM培养基，每孔加入500肚L无血清的DMEM。(3)取一个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300uL无血清的DMEM，同时加入12IaL的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。(4)再取两个1．5mL的EP管，分别标记为B、C管，分别加入150laL无血清的DMEM，然后向B管中加入3xlOOnM的人工合成的dsRNA对照，向C管中加入3×100rim的人工合成的dsRNA—Luc。(5)向B管和C管分别加入个150p．LA管中的溶液，轻轻吹打混匀后静置20min使脂质体包裹DNA，然后混合液按100p．L／孑L加入提前铺好的板中，每个样品重复三孔，将细胞板置培养箱中培养，4-6小时后弃去无血清DMEM，每孔中加入500p．L含10％胎牛血清的DMEM。(6)转染48h后将24孔细胞板从细胞培养箱中取出，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验重复三次。1．2．4双荧光报告基因系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量(1)MARC．145细胞转染后48h，弃去每孔含10％胎牛血清的DMEM培养基，每孔各加入1501aL的5x被动裂解液。室温放置20rain。(2)按双荧光素酶报告检测试剂盒的说明书，配置LAB和Stop溶液。(3)从每孔细胞中吸出25I．tL上清溶液于96孔板待检，再依次向待检孔中加入25FtL的荧光素酶检测试剂II(LARII)，混合，用于检测萤火虫荧光素酶报告基因，最后向待检孔中依次加入25pL的Stop&GIo试剂，以淬灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活海参荧光素酶反应，并立即检测海参荧光素酶报告基因。海参荧光素酶报告基因做为内参基因，以减少实验误差。(4)实验数据统计分析。2结果 河南农业大学2013届硕士毕业论文2．1检测shRNA干扰表达载体的有效性由图2．1．A可以看出转染了PSGH质粒的293T细胞(48h)不仅荧光很强而且发荧光的细胞很多；而PSGHl．shGFP转染的293T细胞(48h)，在荧光显微镜下看到很弱的荧光而且发荧光的细胞比较少，二者荧光细胞的表达量相差明显。结果说明转染了PSGHl质粒的293T细胞的EGFP基因的表达不受影响，而转染PSGHl．shGFP质粒的293T细胞中的EGFP基因的表达被特异性的抑制，该干扰表达载体在细胞中可以特异性的抑制目标基因的表达。图2．1．A．PSGHI、PSGHI．shGFP质粒转染的293T细胞中绿色荧光蛋白的表达(48h)，下白光，上荧光，放大50倍．Figure2．1．A．eGFPexpressionin293TcellstransfectedbyPSGHlorPSGHI-shGFP(48h)，therespectivetoppanelswereobservedunderwhitelight，Magnification+50．将已转染48小时的MARC．145细胞经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．1．B)。从图中可以看出转染了PSGHl质粒的萤火虫荧光素酶报告基因表达量不变；而转染了PSGHl．shLUC质粒的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降，并且PSGHl．shLUC质粒浓度越高，其抑制基因表达量的作用越强。以上实验结果表明，shRNA干扰表达质粒可以在MARC．145细胞中对shRNA靶向的萤火虫荧光素酶报告基因的表达进行有效的抑制。 河南农业大学2013届硕士毕业论文善t2i1B¨J雌呈¨苜啦歪01Luc4-2+3+45+图2．1．BshRNA干扰表达质粒在MARC-145细胞上抑制靶基I困(Luciferase)的表达量，这种抑制作用存在剂量依赖性。Figure2．1．B．Avectorexpression锄sh-RNAinhibittargetgene，Luciferase，expressionOilMARC-145cells，bydose—dependentmanner．2．2检测mi-RNA干扰表达载体的有效性将转染pcDNA6．2和psiCHECK-MDV-UL28UTR质粒(对照组)；pcDNA6．2．MDv．miR4和psiCHECK．MDV-UL28UTR质粒(实验组)的MARC．145细胞在48小时后裂解，经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．2)。从图中可以看出与对照组相比，实验组的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降。该实验结果表明，Mirco．RNA干扰表达载体可以在MARC．145细胞上有效抑制靶基因的表达量，并且这种抑制作用存在剂量依赖性。12喜，5o玉#l02OLucUicmR州IlgI2+|00+400图2．2MicroRNA干扰表达质粒在MARC一145细胞上抑制靶基因(Lueiferase)的表达量，这种抑制作用存在剂量依赖性。Figure2．2Avectorexpressionanmi-RNAinhibittargetgene，Luciferase，expressiononMARC．145cells，bydose-dependentmanner． 河南农业大学2013届硕士毕业论文2．3检测人工合成的双链dsRNA的干扰效果将转染48小时的MARC．145细胞经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．3)。从图中可以看出与对照组相比，人工合成的dsRNA靶向的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降。该实验结果表明，人工合成的双链dsRNA的干扰效果明显，随着dsRNA浓度的增加，靶基因表达量下降的越明显。托墨矗宝O玉裂比O1Luc+dsHl队{nMl02+53+1∞图2．3人工合成的dsRNA在HARC-145细胞上抑制靶基因(Luciferase)的表达量，这种抑制作用存在剂量依赖性。Figure2．3dsRNAinhibittargetgene，Luciferase，expressiononMARC-145cells，bydose-dependentITianneE3讨论目前，RNAi技术发展十分迅速，RNAi具有高效性、高特异性、低细胞毒性等优点，是研究基因功能的有力工具。外源导入或由病毒复制产生的的双链RNA(dsRNA)，被胞内Dicer酶切割成19．2Int的siRNA，通过碱基互补，降解靶基因mRNA，导致目标基因沉默的效应。目前，获得siRNA的主要方法有，体外人工合成雨I干扰质粒载体体内表达。本实验中，shRNA、mi．RNA干扰表达质粒和人工合成的dsRNA都是以萤火虫荧光素酶(Luciferase，Luc)报告基因为靶基因，能抑制Luc的表达。Luc表达量的下降代表shRNA、mi．RNA干扰表达质粒和人工合成的dsRNA沉默靶基因的效果，shRNA、mi．RNA干扰表达质粒和人工合成的dsRNA分别瞬时转染MARC一145细胞中，通过双荧光素酶报告检测系统，检测转染的MARC．145细胞中Luc的表达量。双荧光素酶报告检测系统中，海参荧光素酶报告基因做为内参基因，以减少实验误差，海参荧光素酶报告基因由PhRL．TK质粒表达。在实验结果中发现，转染shRNA、mi．RNA干扰表达质粒和人工合成的dsRNA的MARC．145细胞的Luc的表达量明显下降。随着shRNA、mi—RNA干扰表达质粒和人工合成的dsRNA浓度的增加，其抑制Luc的效果更明显。实验结果表明， 河南农业大学2013届硕士毕业论文在MARC．145细胞上成功构建了shRNA、dsRNA和mi-RNA诱导的基因沉默的模型。外源导入人工合成的dsRNA和干扰表达质粒产生的shRNA和mi．RNA在MRAC．145细胞内被内源性的Dicer酶剪切、加工成有功能的siRRA，这些siRNA针对的靶基因是萤火虫荧光素酶报告基因，经双荧光素酶报告检测系统检测，发现靶基因的表达量明显下降，揭示了shRNA、dsRNA和mi．RNA导入到MARC一145细胞后产生的siRNA能够诱发靶基因的沉默，因此，MARC．145细胞内存在RNA沉默的现象。 河南农业大学2013届硕士毕业论文第三章PRRSV及其nspl、nspl1对RNA诱导的基因沉默的影响1材料与方法1．1材料1．1．1病毒、质粒PRRSV的BJ·4毒株，3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1Flagnspla、3．1Flagnspl[3质粒均由河南省动物免疫学重点实验室保存。1．1．2主要试剂主要试剂见第二部分的1．1．2章节。1．2方法1．2．1PRRSV对由shRNA、dsRNA、mi—RNA诱导的基因沉默的影响按照大连TaK出a公司的质粒提取说明，提取质粒3．IFlag、3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1Flagnspla、3．1Flagnspll3，测浓度后于一20℃保存备用，具体提取过程同第二部分的1．2．1．1．2。1．2．1．1shRNA、dsRNA、mi—RNA分别瞬时转染MARC-145细胞将培养至最佳状态的MARC．145细胞弃去培养液，正常消化细胞，利用计数板计数。MARC-145细胞按lxl05cells／500uL浓度将细胞悬液铺进24-孑L的细胞培养板内(每孔500gL细胞悬液)，然后将细胞置培养箱中培养。第二天观察细胞生长情况，在合适浓度下进行共转染实验，具体操作过程如下：(1)弃去细胞板中培养基，每孔加入500laL无血清的DMEM。(2)取1个10ml的玻璃管，标记为A，加入1．SmL无血清的DMEM，同时加入729L的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5rain。(3)另取3个1．5uL的EP，分别标记为B、C、D并各自加入6009L无血清的DMEM，然后从每个EP管中各分出3009L无血清的DMEM，置于新的EP管中，标记为B．1、C．1、D．1。具体标注及加入质粒如下：B管：PGL-4．17"6孑Lx400ngPhRL—TK：6孑L×50ngPSGHl：6FLxs00ngB．1管：PGL-4．17：6：i：Lx400ngPhRL—TK：6孑Lx50ngPSGHl-shRNA：6孑Lx800ngC管：dsRNA对照：6孔×lOOnMC．1管：dsRNA干扰：6孑Lxl00nMD管：(miRNA对照组) 河南农业大学2013届硕士毕业论文psiCHECK．MDV-UL28：6孑Lx400ngpcDNA6．2：6孑Lx400ngD．1管(miRNA干扰组)：psiCHECK．MDV-UL28：6孑Lx400ngpcDNA6．2-MDV-miR4：6孑L×400ng(4)分别向B、B．1、C、C．1、D、D．1的EP管中各加入300I_tL的A溶液，轻轻混匀，室温静置20min。(5)向铺好细胞的每孔细胞板中各加入lOOpL的B、B-1、C、C—l、D、D·1混合液，每个样品做3孔重复，并在细胞板上做好每孔标记，置于培养箱中培养。(6)在转染4-6小时后进行接毒实验。1．2．1．2PRRSV作用于转染了shRNA、dsRNA、mi—RNA的撇R0-145细胞PRRSV的M01分别按0．1和0．01作用于转染了shRNA、dsRNA、mi-RNA的MARC-145细胞，以MOI为O．1为例，具体操作如卜^：(1)从细胞培养箱中取出已转染6小时的细胞板，弃去培养基，用无血清的DMEM培养基稀释病毒，使PRRSV的MOI为0．1。(2)向预接毒的细胞孔中各加入250pL病毒稀释液，未接毒的转染孔各加2501aL无血清DMEM培养基做为阴性对照，放置培养箱中，使病毒吸附l-2h后，取出细胞板，每孔补加含4％胎牛血清DMEM培养基至500pL，置于细胞培养箱中培养。(3)接毒后48h将24孔细胞板从细胞培养箱中取出，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验数据重复三次。1。2．2nspl、nspll、nsplq、nspl旦对RNA诱导基因沉默的影响1．2．2．1nspl、nspll、nsplⅡ和nsplB表达质粒分别与shRNA共转染MARC一145细胞按上述方法培养消化Marc．145细胞，细胞计数，按l×105cell／mL的密度铺入24孔板中，当MARC．145细胞长至合适浓度时，进行共转染实验。nspl、nspll、nspla和nsplp基因插入pCDNA3．1真核表达质粒，且携带Flag标签，3．IFlag与shRNA共转染MARC-145细胞，具体操作过程如下：(1)弃去细胞孔中培养基，每孔加入500laL无血清的DMEM。(2)取1个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300pL无血清的DMEM，同时加入18此的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5rain。(3)取2个1．5mL的EP管，标记为B管和C管，各加入150pL无血清的DMEM，向B管中加入2．4ug的3．IFlag、1．2ug的PGL-4．17、O．15ug的PhRL-TK和2．4ug的PSGHl质粒；向C管中加入2．4ug的3．1Flag、1．2ug的PGL-4．17、0．15ug的PhRL-TK和2．4ug的PSGHI．shLuc质粒。(4)向B、C管中各加入150pL的A管溶液，轻轻混匀，室温静置20min。(5)向细胞孔中各加入100pL的B溶液，标记为PSGHl对照组，向另外细胞孔各加入30 河南农业大学2013届硕士毕业论文100I．tL的B溶液，标记为PSGHl．shRNA干扰组，每个样品做3孔重复，做好标记，放置培养箱中。(6)细胞转染后4-6小时，取出细胞板，弃去无血清的DMEM培养基，每：／L力n入10％DMEM培养基，放置培养箱中。(7)48小时后，取出细胞板，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验数据重复三次。在3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1FlagnspIct、3．1Flagnspll3与shRNA共转染MARC一145细胞实验过程中，将3．1Flag依次换成3．1FlagnspI、3．1Flagnspll、3．IFlagnspIct、3．1Flagnspll3即可，其它实验条件不变。1．2．2．2nspl、nspll、nsplQ、nsplB表达质粒分别与dsRNA共转染MARC-145细胞正常培养消化Marc-145细胞，细胞计数，按1×105cell／rnL的密度铺入24孔板中，当MARC．145细胞长至合适浓度时，进行共转染实验。3．1Flag与dsRNA共转染MARC．145细胞，具体操作过程如下：(1)弃去细胞孔中培养基，每孔加入500／aL无血清的DMEM。(2)取1个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300I．tL无血清的DMEM，同时加入1811L的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。(3)取2个1．5mL的EP管，标记为B管和C管，各加入150pL无血清的DMEM，向B管中加入2Aug的3．1Flag、3×100nM的dsRNA对照组溶液：向C管中加入2．4ug的3．1Flag、3x100nM的dsRNA干扰组溶液。(4)向B、C管中各加入150¨L的A管溶液，轻轻混匀，室温静置20min。(5)向细胞孔中各加入100扯L的B溶液，标记为dsRNA对照组，向另外细胞孔各加入100pL的B溶液，标记为dsRNA干扰组，每个样品做3孔重复，放置培养箱中。(6)细胞转染后4-6小时，取出细胞板，弃去无血清的DMEM培养基，每孔加入10％DMEM培养基，放置培养箱中。(7)48小时后，取出细胞板，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验数据重复三次。3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1Flagnsplct、3．1Flagnspll3与dsRNA共转染MARC-145细胞的实验过程中，将3．IFlag依次换成3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1Flagnsplet、3．1Flagnspll3即可，其它实验条件不变。1．2．2．3nspl、nspll、nsplQ、nsplB表达质粒分别与mi-RNA共转染MARC一145细胞正常培养消化Marc．145细胞，细胞计数，按1×105cell／mL的密度铺入24孔板中，当MARC．145细胞长至合适浓度时，进行共转染实验。3．1Flag与dsRNA共转染MARC-145细胞，具体操作过程如下：(1)弃去细胞孔中培养基，每孔加入500laL无血清的DMEM。 河南农业大学2013届硕士毕业论文(2)取1个1．5mL的EP管，标记为A管，加入300I．tL无血清的DMEM，同时加入18／aL的脂质体(Lipofectamine2000)，静置5min。(3)取2个1．5mL的EP管，标记为B管和C管，各加入1509L无血清的DMEM-向B管中加入2．4ug的3．1Flag、1．2ug的pcDNA6．2和1．2ug的psiCHECK-MDV-UL28质粒；向C管中加入2．4ug的3．IFlag、1．2ug的psiCHECK-MDV-UL28和1．2ug的pcDNA6．2．MDV-miR4质粒。(4)向B、C管中各加入150“L的A管溶液，轻轻混匀，室温静置20min。(5)向细胞孔中各加入100pL的B溶液，标记为mi．RNA对照组。向另外细胞孔各加入lOOgL的B溶液，标记为mi—RNA干扰组，每个样品做3孔重复，放置培养箱中。(6)细胞转染后4-6小时，取出细胞板，弃去无血清的DMEM培养基，每孔加入IO％DMEM培养基，细胞板放置培养箱中。(7)48小时后，取出细胞板，检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达量。每组实验数据重复三次。3．1FlagnspI、3．1Flagnspl1、3．1Flagnspla、3．1FlagnspI与mi-RNA共转染MARC-145细胞实验过程中，将3．1Flag依次换成3．1Flagnspl、3．1Flagnspll、3．1Flagnspl、3．1Flagnspll3即可，其它实验条件不变。1．2．3双荧光报告基因系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量具体的实验步骤见第二部分的2．3-3，实验数据的统计分析。2结果2．1PRRSV抑制shRNA、dsRNA、m．_RNA诱导的RNA沉默将转染的细胞在接毒48小时后，用裂解液裂解细胞，取裂解液上清，经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．1)。从图2．IA．、2．1B、2．1c中分别可以看出转染了shRNA、dsRNA和miRNA的细胞的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降，但加入PRRSV后，PRRSV能够恢复被抑制基因的表达量，并且随着病毒数量(MOI)增多，PRRSV抑制RNAi的能力增强。以上实验结果表明，PRRSV能够抑制由shRNA、dsRNA、mi—RNA介导的萤火虫荧光素酶报告基因沉默，这种抑制作用存在PRRSV的毒力依赖。32 河南农业大学2013届硕士毕业论文揣Lu。：m酗1100800粼Luc+oo1聪00100u赫喊图2．1PRRSV抑制RNAi。在MARC．145细胞上，PRRSV恢复了被抑制的靶基因的表达量。图A、B、C中显示PRRSV抑制shRNA、dsRNA、miRNA诱导的基因沉默，并且随着№I提高，PRRSV抑制RNAi的能力增强。Figure2．1PRRSVsuppressesRNAi．PRRSVrestoresexpressionofsilencedluciferasereportergeneonMARC一145cells．FigureA，B，CshownthatPRRSVinhibittheshRNA，dsRNA,miRNA-inducedgenesilencing．WithincreasingMOI，PRRSVhasthestrongerabilityofinhibitingRNAi．2．2PRRSV的nsplQ和nspll是RNA沉默的抑制子细胞转染48小时后，弃去培养基，裂解细胞，取裂解液上清，经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．2．1)从图2．2．1A、B、C中可以看出单独转染shRNA、dsRNA和miRNA的MARC．145细胞的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降，但加入nspl后被抑制的靶基因的表达量恢复了。另外，从图2．2．1D、E、F中可以得出nspll同样也能恢复被抑制的靶基因的表达量。33 河南农业大学2013届硕士毕业论文1shldag(nt毋0Vbc吣r,IFRSD!一D住喜，o∞，∞i0,402238∞800LucshLuc(nZjVg啦torn9pit2+8∞●3+B∞●BEi12胃1=∞要惦蕙¨IDg02'LUC+dsRNA(nU)0VectorT-nspl．'2岂1＆0．8●0．6iOA口j2+'∞+3●'∞一+'Luc+dsRNA(nM)0VblcIor．IFnsp41—231001∞Ct2邑1台I*,11=eJ；专·J．●】'Luc41"■icronJl^(．g)0Vtctor●nsp|一F鲜台tL8le．6i"0．423棚4001LIlc+uh棚11日0V配'tor4-nop'●一23400图2．2．1nspl和nspli抑制RNA诱导的基因沉默。图A、B、C中显示nspl抑制shRNA、dsRNA、miRNA诱导的基因沉默，图D、E、F中显示nspl1抑制shRNA、dsRNA、miRNA诱导的基因沉默。Figure2．2．1nsplandnspl1inhibittheshRNA，dsRNA，miRNA-inducedgenesilencing．FigureA，B，CillustratethatnsplrestraintheshRNA,dsRNA，miRNA·inducedgenesilencing，andfigureD，E，FdemonstratethatnspllsuppressesshRNA,dsRNA,miRNA-inducedgenesilencing．由图2．2．2A、B、C中可知nsplct抑制了shRNA、dsRNA、miRNA诱导的RNA沉默，而nspllB没有抑制RNA沉默的作用，揭示了nspl抑制RNA诱导的基因沉默的作用是通过nspla实现的。以上实验结果表明，PRRSV的nspla和nspll具有抑制RNA诱导的基因沉默的作用，是RNA沉默的抑制子。位，吐雎¨位A一享一￡oJlilI 河南农业大学2013届硕士毕业论文ABC萎◆fi『1"hnn。‰'234512345'2345Luc·+}·+Luc++-++Luc4-+4-·●shLuc(n蚺0湖珊瑚瑚dsRKA(nMl0|00t00|00t00microRgAln910枷枷瑚枷Vector++．．．Vector++．．．Vector++．．．nspf．··一．nsp'．．+．nspI．．t．nspta···+·nsp|n···"IF．nspla-一一+．nsptp’·。·'nspfp·一--+nspt}-一_-·图2．2．2nspla是RNA沉默的抑制子。图A、B、C中，nsplo能够恢复被抑制基因的表达量，然而，nsplp没有这种恢复作用。Figure2．2．2nsplaisaRNAsilencingsuppressors．FigureA，B，Crevealthatnsplarestoresexpressionofsilencedluciferasereporter，however'nsplphasnosuchrecoveryability．3讨论ItNAi是先天性抗病毒的免疫反应，广泛存在于植物、昆虫和低等无脊椎动物中。虽然，在哺乳动物中是否也存在RNAi这种抗病毒的机制一直存在着争议，但是，越来越多的实验结果表明RNAi同样也是宿主抗病毒的先天性免疫的一部分。本研究首次分析了在感染PRRSV的MARC．145细胞上PRRSV与RNAi之间的作用，MARC．145细胞存在RNAi通路。本实验中，PRRSV与RNA干扰模型(shRNA、dsRNA和mi．RNA诱导基因沉默)共作用于MARC一145细胞。结果表明，PRRSV能够抑制shRNA、dsRNA和mi．RNA诱导的基因沉默，而且PRRSV毒力越高这种恢复被抑制基因表达量的能力就越强，即抑制RNAi存在一定毒力依赖性。假如RNAi是宿主体内抗PRRSV免疫反应的一部分，那么，我们可以合理的推断PRRSV可能存在调节和抵抗RNAi抗病毒机制。病毒在受到RNAi抵抗过程中会通过病毒蛋白或非编码的病毒RNA来抑制RNA沉默，即RNA沉默抑制子(RNAsilencingsuppressor，RSS)。目前，己从植物、动物和人类病毒中鉴定了20多种RSSs。持续性感染是PRRSV感染的特点之一，这就表明PRRSV能够抵抗胞内抗病毒的防御机制，那么，PRRSV很有可能会存在可能存在RSS来拮抗RNA沉默的现象，本实验中，nspl和nspll分别与RNAi干扰模型共转染MARC-145细胞，结果发^蔓o■正_qlI■，．I■Z 河南农业大学2013届硕士毕业论文现nspl和nspl1同样也有恢复被抑制的靶基因(Luc)的表达量的能力。nspl和nspl1能够抑制shRNA、dsRNA和mi．RNA诱导的基因沉默。nspl可以自分解为nspla和nsplp，其中nspl的nspla能够抑制shRNA、dsRNA和mi．RNA诱导的基因沉默，，而nsplp没有这种抑制作用。因此，PRRSV的nspla和nspll是RNA沉默抑制子。以上研究结果表明，在MARC．145细胞上，虽然RNAi能够抵抗PRRSV的感染，但是PRRSV存在病毒逃逸机制，即通过编码RSSs抑制RNAi抗病毒的反应。PRRSV感染能引起持续性感染，本研究中以RNAi为模型系统，深入研究PRRSV先天性免疫逃逸的机制和抑制IⅢAi分子机理。nspla和nspll是抑制RNA沉默的抑制子，同时，相关研究表明，nspla和nspll能够抑制I型干扰素的产生，是干扰素的拮抗蛋白。这揭示RNAi和IFN可能存在重叠。在哺乳动物细胞中，能够抑制RNA沉默的抑制子大多数都是干扰素(IFN)的拮抗蛋白，另外miRNA能够诱导IFN，腺苷脱氨酶对miRNA的产生和增强IFN系统起着重要作用。RNAi和干扰素系统之间关系表明RNAi和IFN系统是抵抗动物病毒感染的第一防线。然而，RNAi和IFN系统之间相互作用的机制有待进一步研究。36 河南农业大学2013届硕士毕业论文第四章nsplQ木瓜蛋白酶和nspl1核酸内切酶失活后对RNA诱导的基因沉默的影响1材料与方法1．1材料1．1．1细胞、质粒MARC一145细胞，3．1Flag、3．1Flagnspla、3．1FlagnspIaC76S、3．1FlagnsplaHl46A、3．1Flagnspll、3．1FlagnspllH129A、3．1FlagnspllHl44A和3．1FlagnsplIKl73A质粒均由河南省动物免疫学重点实验室保存。1．1．2主要试剂主要试剂见第二部分的1．1．2章节。1．2方法按照大连TaKaRa公司的质粒提取说明，分别提取质粒3．1Flag、3．1Flagnspltt、3．1Flagnsplc【H146A、3．1FlagnspIaC76S、3．1Flagnspll、3．1FlagnsplIHl29A、3．1FlagnspllHl44A和3．1FlagnspIIKl73A，测浓度后于一20。C保存备用，具体提取过程同1．2．1．1．2。其中，3．1FlagnspIaHl46A、3．1FlagnsplaC76S是3．1Flagnspla的突变体，3．1FlagnspllHl29A、3．1FlagnsplIHl44A和3．1FlagnsplIKl73A是3．IFlagnspll的突变体。1．2．1nsplQ及其突变体质粒对RNA诱导基因沉默的影响I．2．1．1nsplo及其突变体质粒分别与shRNA共转染MARC-145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．1，将质粒更换。1．2．2．2nsplQ及其突变体质粒分别与dsRNA共转染MARC-145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．2，将质粒更换。1．2．2．3nsplo及其突变体质粒分别与miRNA共转染MARC-145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．3，将质粒更换。1．2．2nspl1及其突变体质粒对RNA诱导基因沉默的影响1．2．2．1nspl1及其突变体质粒分别与shRNA共转染MARC一145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．1，将质粒更换。1．2．2．2nspl1及其突变体质粒分别与dsRNA共转染MARC一145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．2，将质粒更换。1．2．2．3nspll及其突变体质粒分别与miRNA共转染MARC一145细胞具体实验过程见第三部分的1．2．2．3，将质粒更换。1．2．3双荧光报告基因系统检测萤火虫荧光素酶基因的表达量具体的实验步骤见第二部分的1．2．4，实验数据的统计分析。37 河南农业大学2013届硕士毕业论文2结果2．1nsplQ的木瓜蛋白酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的细胞转染48小时后，弃去培养基，裂解细胞，取裂解液上清，经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基冈的表达情况，结果如(图2．1)，从图中可以看出转染了shRNA、dsRNA和miRNA的细胞的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降，当加入3．1Flagnsplct后，萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显上升了，但是加入3．1FlagnsplaHl46A、3．1FlagnsplctC76S后并没有恢复被抑制基因表达量。以上实验结果表明，PRRSV的nspla能够抑制shRNA、dsRNA、miRNA介导的基因沉默，但是nspla的突变体没有抑制KNAi介导的基因沉默的作用。A'2事’¨各"!¨一1世O■02Luc’shLuc(ng)日Vector·nsp／a—nlpt口口8S·nsplalll46Y·t+嘲瑚钠跏+一-一●一．一●．一．●B一12嘉1毛雌呈饰罢¨2姣C‰‰2345+l∞，∞'∞'∞+-一，一+一+．一·．●1Luc+aicraalA{ng)0Vector·nspfa．nsp40C765一nsplglfl46Y·2345●+400400椭枷4-一·-一●一．-一t一·一．-F图2,1nspla的突变体不能抑制RNA诱导的基因沉默。图A、B、c显示nsplct没有恢复披抑制基因的表达量。Figure2．1ThemutantsofnsplttdonotinhibittheRNA-inducedgenesilencing．FigureA，B，Cshownspladidnotrestoreexpressionofthesuppressedluciferasereportergene．2。2nspl1的核酸内切酶的活性是它作为RNA沉默抑制子所必需的细胞转染48小时后，弃去培养基，裂解细胞，取裂解液上清，经双荧光素酶报告基因检测系统来检测萤火虫荧光素酶报告基因的表达情况，结果如(图2．2)，从图中可以看出转染了shRNA、dsRNA和miRNA的细胞的萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显下降，当加入3．1Flagnspll后，萤火虫荧光素酶报告基因表达量明显上升了，但是加入3．1FlagnsplIHl29A、3．1FlagnspI1H144A和3．1FlagnspI1K173A并没有恢复被抑制基因表达吣o。啭恫m一～吣一～．蛳v。脚町 河南农业大学2013届硕士毕业论文量。以上实验结果表明，PRRSV的nspll能够抑制shRNA、dsRNA、miRNA介导的基因沉默，但是nspl／的突变体没有抑制RNAi介导的基因沉默的作用。AIj拿1蓍。工三o．s1loJ02BC‰霎量‰|至k'23456Luc●4-4-4-4-4-嬲黔嚼0800900800S00潮呐咖·4-一一．一nsptt．．●．．．nsptt槲2SA．．一+．．ns们●Ht44A一·一．+．nlptlI(t73A-一-．·+Lue4-·++4-+dsRHAlnM}0400t00100400Vbcl∞+·一．．一nspt●一．+．．一nsptl砌撇一．．●．．n3pllH'44A·--．●．nspflgt73A···．·+LuC●●●●+’U硎alA(ng)0400400400400400veclnr+●．．．一nspll，．●．一一nsptlHt29A．．．+．．nsptlHl44A·--．·．nsptl融73A··-．·+图2．2nspl!的突变体不能抑制RNA诱导的基因沉默。图A、B、C显示nspll没有恢复被抑制基因的表达量。Figure2．2ThemutantsofnsplldonotinhibittheRNA—inducedgenesilencing，FigureA，B，CdemonstratensplIdidnotrestoreexpressionofthesilencedluciferasereportergene．3讨论nspla具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(Papainlikecysteineproteinseu，PCPq)活性区域，PCPa是由半胱氨酸残基和下游组氨酸组成的二聚体。点突变实验发现，Cys．76和Hisl44分别是PCPct的半胱氨酸和组氨酸发挥催化活性的重要位点，表明Cys-76和Hisl44是nspla发挥木瓜蛋白酶活性作用所必须的。在本实验中，将半胱氨酸(Cys．76)突变成丝氨酸突变体(nsplttC76S)，组氨酸(His．144)突变成亮氨酸突变体(nsplctHl46)，在突变体中PCPu的蛋白水解酶的活性失活。相关研究表明，PCPGt的蛋白水解酶的活性对抑制IFN．B的产生起关键作用。因此，探讨PCPa的蛋白水解酶的活性是否对RSSs发挥抑制作用所必须的就很有意义。本实验中，nspla及其突变体(nsplaC76S、nsplaHl46)分别与RNA干扰模型共转染MARC．145细胞，发现nspla的突变体不能恢复被抑制的靶基因(Luc)的表达量，即不能抑制RNA诱导的基因沉默。以上研究结果表明，nspla的木瓜蛋白酶活性是其作为RSS的关键所在。nspll具有套式病毒特有的核酸内切酶的活性(Endoribonuclease，NcndoU)，目前，只在套式病毒中发现有NendoU，因此，NendoU被认为是套式病毒的基因标志。一些冠状病毒的nspl5含有NendoU的晶体结构显示NendoU包括两个组氨酸和一个赖氨酸。点突变39 河南农业大学2013届硕士毕业论文实验结果表明，这三个氨基酸任一个发生突变都会失活核酸内切酶的活性。Nedialkova等研究表明，动脉炎病毒属的EAV的nspll也有核酸内切酶的活性中心(Hisl26、His．141和Lysl70)，突变任何一个氨基酸都会使核酸内切酶活性失活。SARS．Cov的nspl5、EAV的nspll和PRRSV的nspll的NendoU结构域蛋白序列同源性高，并且在PRRSV中，nspll的NendoU核酸内切酶活性的重要位点分别是His．129、His．144和Lys．173。相关的研究报道，nspll能够抑制干扰素的产生，但针对His．129、His．144和Lys．173设计突变体(nsplIHl29A、nspllHl4A和nspllKl73A)后，这些突变体就不能抑制IFN．p的产生。表明nspl1的核酸内切酶活性对抑制IFN．B产生起重要作用。那么，nspll的核酸内切酶活性是否对其发挥抑制RNA沉默的作用至关重要。在本实验中，同样也针对His．129、His-144和Lys·173设计突变体nspllHl29A、nspllHl4A和nspllKl73A，nspll及其突变体分别与RNA干扰模型共转染MARC．145细胞，发现nspll的突变体同样也不能抑制RNA诱导的基因沉默。以上研究表明，nspll的核酸内切酶活性是其作为RSS所必需的。 河南农业大学2013届硕士毕业论文第五部分全文总结1、在MARC一145细胞成功构建了由s}hRNA、dsRNA和mi．RNA诱导的RNA沉默的模型。2、RNAi是细胞抵抗病毒的一种先天性免疫机制。PRRSV能够抑制由shRNA，dsRNA和miRNA诱导的RNA沉默。揭示了PRRSV可能抑制RNA沉默这一机体先天性免疫。3、PRRSV的非结构蛋白nspl和nspll具有抑制RNA诱导的基因沉默的作用。nspltt和nsplI是抑制RNA沉默的抑制子。4、nspla的木瓜样蛋白酶的活性和nsplI的核酸内切酶活性分别是nspl和nspl1发挥抑制RNA诱导的基因沉默活性所必需的。4l 河南农业大学2013届硕士毕业论文42 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河南农业大学2013届硕士毕业论文overallexpressionlevelsofpromyelocyticleukaemia(PML)proteininculturedcells．BMCMicrobi01．3，6．【83】Lin，W．，Kim，S．S．，Yeung，E．，Kamegaya,Y，Blackard，J．T．，Kim，K⋯AHoltzman，M⋯JChung，R．T．，2006．HepatitisCviruscoreproteinblocksinterferonsignalingbyinteractionwiththeSTATlSH2domain．J．Ⅵm1．80(18)，9226巧235．【84】Johnson，R．F．，Bell，P．，Harty,R．N．，2006a．EfifectofEbolavirusproteinsGP,NPandVP35onVP40VLPmorphology．Vir01．J．3．31．【85】Huang,J．，Wang,E，Argyris，E．，Chen，K．，Liang,Z．，Tian，H．，Huang，W．，Squires，K．，Verlinghieri，G，Zhang，H．，2007．CellularmicroRNAscontributetoHIV-1latencyinrestingprimaryCD4(+)Tlymphocytes．Nat．Med．13，1241-1247．[86】Cardenas，W．B．，Loo，YM．，GaleJr．，M．，Hartman，A．L．，Kimberlin，C．R．，Martinez-Sobrido，L．，Saphire，E．O．，Basler,C．F．，2006．EbolavirusVP35proteinbindsdouble—strandedRNAandinhibitsalpha／betainterferonproductioninducedbyRIG-Isignaling．J．Ⅵr0I．80，5168-5178．[87】Chang，H．w．，Jacobs，B⋯L1993．IdentificationofaconservedmotifthatisnecessaryforbindingofthevacciniavirusE3Lgeneproductstodouble-strandedRNA．Virology194，537-547．[88】Chang，H．W．，Watswon，J．C．，Jacobs，B⋯L1992．TheE3Lgeneofvacciniavirusencodesallinhibitoroftheinterferon-induced．double—strandedRNA-dependentproteinkinase．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．89，4825--4829．[89]Lin，J．，Cullen，B．R．，2007．AnalysisoftheinteractionofprimateretroviruseswiththehumanRNAinterferencemachinery．J．Vir01．81(22)，12218—12226[90】Li，W．X．，Li，H．，Lu，R．，Li，F．，Dus，M．，Atkinson，P．，Brydon，E．W．，Johnson，K⋯LGarcia-Sastre，A．，Ball，L．A．，Palese，E，Ding，S．W．，2004．InterferonantagonistproteinsofinfluenzaandvacciniavirusesaresuppressorsofRNAsilencing．Proc．Natl．Acad．Sci．USA101，1350-1355．[91】Mathews，M．B．，Shenk，T．，1991．Adenovirusvirus-associatedRNAandtranslationcontr01．J．Viml．65．5657—5662．[92]Matskevich，A．A．，Moelling，K．，2007．DicerisinvolvedinprotectionagainstinfluenzaAvirusinfection．J．Gen．Vir01．88．2627-2635．[93]McJunkin，J．E．，delosReyes，E⋯Clrazuzta,J．E．，Caceres，M。JKhan，R．R．，Minnich，L．L．，Fu，K．D．，Lovett，G．D．，Tsai，T．，Thompson，A．，2001．LaCrosseencephalitisinchildren．N．En91．J．Med．344．801-807． 河南农业大学2013届硕士毕业论文SuppressionofRNA—mediatedgensilencingbyporcinereproductionandrespiratorysyndromevirusAbstractRNAiiSsequence·specificgenesilencingmechanismactivatedbythedouble·stranded冈NA(dsIⅢA)．Asanaturaldefensemechanismtotheforeigngeneorvirusattack，thephenomenonofRNAiexistedwidlyinplant，namatodesWOrlTI．drosophilaandhumancells．However,virusCancounteractthisanti—viraldefenseofthehostbyviralproteinsandnon-codingviralRNAs．IⅢAsilencingsuppressor(RSS)。Currently,about20RSSshavebeenidentifiedfromplant。animalandhumanviruses20，andmostoftheseRSSsaleinterferonantagonist．Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)iSallinfectiousdiseasecharacterizedbyrespiratorydisordersorabortioninpregnantSOWSandPigletsbreathingdifficulties．resultinginimportanteconomiclossestotheswineindustry．PRRSv，asmallenvelopedvirusincludingasinglepositive—strandedRNAgenome，isamemberoffamilyArteriviridaewhich，alongwiththeCoronaviridae，areclassifiedintheorderNidovirales．ThegenomeiSabout15kb．containingnineopenreadingframes(OREs)．ORF一1encodes14non-structuralproteins(nsps)．Inadditiontothecopy,nspshaveprotease，polymerasefunction，andinhibitinterferonproduction．0RF2-7encoedviralstructuralproteins．ThePRRSVexistimmunologicalcharacteristicsofimmunosuppressionandpersistentinfection．whichCancausedvirusimmuneescape．RNAicallinhibitofviralreplicationandclearthevirusasainnateimmunedefensesystem．AsuboptimalinnateinlrnuneresponseandthepersistentinfectionweretheimportantfeaturesofPRRSVinfection．SO也eaimsofourpresentworkaretoaddresswhetherPRRSVcouldsuppresstheRNAsilencing．whetherthePRRSVencodedRSSswhichhelpthevirusovercomethecellularantiviralRNAsilencingresponse．Inthisstudy’bvRNAitechnology，thesyntheticdsRNAandsh砌NAormi—RNAinterferenceexpressionplasmidweretransfectedintoMARC．145cells．Thefireflyluciferasereportergene(Luc)isthetargetgenetargetedbydsRNA，shRNAandmi．RNA．LucexpressionwassuppressedontransfectedMARC．145cellsbydualfluorescencedetectionsystem．ItindicaredthatthedsRNA．shRNA．andmi．RNA．inducedgenesilencingmodeliSsuccessfullyconstructedonMARC—l45cells；whenPRRSVandRNAimodelwereactedonMARC．145ceils．PRRSVrestoreexpressionofsilencedluciferasereportergeneonMARC一145ceils．ItshownedthatPRRSVCaninhibitthesh砌呵A，dsItNA．miR】呵A．inducedgenesilencing．WhennsplornspllandRNAimodelwerecon—transfectedonMARC．145cells．nsplandnspl1，alsoCanrestoreexpressionofsuppressedluciferase．nsplhydrolysisnsplaandnsplp，andnsplinhibitthes}瓜NA，dsRNA，miRNA—inducedgenesilencingisachievedbynspla．nsplaandnspllwereRNAsilencingsuppressor；ThePCPaactivityofnsplaandtheendoribonucleaseactivityofnspllareinaetivatedinthemutantofNsplaandnspl1．Themutantofnsplaornspl1andImAimodelwere49 河南农业大学2013届硕士毕业论文con．transfectedonN队RC．145cells．however,thesemutantscallnotinhibittheRNAi—inducedgenesilencing．ItdemonstratedthattheactivityofPCPaandtheactivityofendoribonucleasewererespectivelyrequiredfornsplaandnspl1astheRSSs．PItRSVcouldsuppresstheshRNA．ds砌呵Aandmi砌、IA—inducedRNAsilencingonMARC·145cells．nsplandnspllhaveeffectoninhibittingtheRNA-inducedgenesilencing，andnsplaandnspllaleRNAsilencingsuppressor．‘111eactivityofPCPaandtheactivityofendoribonucleasewererespectivelyrequiredfornsplaandnspllastheRSSs．Keywords：porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusRNAsilencingRNAsilencingsuppressorinmluneescape50