编辑绵羊fgf5基因的talen质粒构建及功能验证

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1、分类号：密级：学号：2010108001单位代码：10759石河子大学硕士学位论文编辑绵羊FGF5基因的TALEN质粒构建及功能验证学位申请人梁龙指导教师皮文辉研究员申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ConstructionandfunctionalverificationofTALENvectorforFGF5geneeditinginsheepADissertationSubmittedtoShih

2、eziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLiangLong(AnimalGenetics，BreedingandReproduction)DissertationSupervisor:ResearcherPiWen-huiJune,2013编辑绵羊FGF5基因的TALEN质粒构建及功能验证摘要转录激活因子样效应子（TranscriptionActivator-Like

3、Effectors,TALEs）是植物致病菌黄单胞杆菌（Xanthomonas）通过III型分泌系统注入到宿主细胞内的一类蛋白效应子，能够与DNA实现特异性的结合。TALE-DNA结合结构域由串联重复模块单元组成，大部分重复单元含34（33～35）个氨基酸，单元的第12和13位氨基酸高度可变，称为重复可变区（repeatvariablediresidues,RVDs）。TALE的RVDs识别DNA序列的4个碱基具有高度的专一性，TALE重复单元的第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合。根据简单

4、的分子密码重新排列重复模块，能够靶向新的DNA序列。研究者几乎能够针对任何DNA靶序列，构建特异性TALE-DNA结合域。人工构建的TALEs已经成为有效的基因组编辑和转录调控工具。几乎一致的重复单元序列，利于TALEs实现模块化、工程化构建。目前有多套构建TALEs的试剂盒，如GoldenGateTALENKit、TALENEngineeringReagents和TALEToolbox。这些TALEs构建试剂盒，大多数结合“GoldenGate”克隆法，来实现TALEs的高效构建。“Golde

5、nGate”克隆法，是目前在TALE组装中常用的一种方法，该方法充分利用IIS型核酸内切酶DNA结合位点和切割位点不在同一位置，使得切割后的粘性末端具有多样性。通过人为的设计使得不同的片段在经过同一个酶切后产生差异化的粘性末端，不同片段间只有按照一定的顺序才能连接起来。由于组装的目的DNA序列中，不含IIs型限制性内切酶的识别位点，故不能被同种IIs型限制性内切酶再次切开。一、采用TALEToolbox试剂盒，运用PCR扩增结合“GoldenGate”克隆法的实验方案，人工构建了绵羊FGF5基因

6、位点TALENs。结果表明，该构建策略是一种快速高效构建TALEs的方法，能够在1周内完成TALEs构建。二、为了检测人工构建绵羊FGF5基因位点TALEN的活性，采用Lonza电转仪，将绵羊FGF5基因位点TALEN质粒电转染进入绵羊成纤维细胞，并用Surveyor试剂盒检测其活性。结果表明，针对绵羊FGF5基因位点人工构建的TALEN质粒，能够实现对绵羊基因组FGF5基因位点的编辑。三、为了编辑小鼠β酪蛋白基因位点，利用“GoldenGate”克隆法，构建了小鼠β酪蛋白基因位点同源重组靶向载

7、体。结果表明，“GoldenGate”克隆法是一种简单易行、快速高效的克隆方法，在同一反应体系中，可实现多个片段按既定顺序的准确连接。关键词：TALEs“GoldenGate”克隆法基因组编辑成纤维细胞生长因子5基因II编辑绵羊FGF5基因的TALEN质粒构建及功能验证AbstractTranscriptionalactivator-likeeffectors(TALEs)areaclassofproteineffectorswhichinjectedintohostcellsbyPlantpa

8、thogenicbacteriumXanthomonasthroughthetypeIIIsecretionsystem,anditcanbindwithDNAspecially.TheTALE-DNAbindingdomainconsistsoftandemrepeatsmoduleunitswhichcontaining34(33to35)-aasequences.The12thand13thpositionsaminoacidsofmoduleunitsishighlyvariablean