蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析

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1、分类号S821.2学校代码10129UDC636学号2010301004蒙古马免疫相关基因表达研究及脾脏表达谱分析TheExpressionStudyofImmuneRelatedGenesandTheAnalysisofSpleenExpressionProfilesofMongolianHorse申请人：赵一萍学科门类：农学学科专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物分子数量遗传学与马的育种指导教师：芒来教授论文提交日期：二〇一三年六月本研究由内蒙古科技厅重大科技支撑项目(20091404)内蒙古农业大学创新团队支持计划(NDTD2010-12)提供资助Thisdiss

2、ertationwassupportedbyTheMajorSupportingProjectoftheInnerMongoliaScienceandTechnologyDepartment(20091404)TheProjectofScienceandTechnologyInnovationTeamofInnerMongoliaAgriculturalUniversity(NDTD2010-12)摘要中国马业正处在从传统马业向现代马业转型的过程中，急需培育出适应我国自然环境的马匹新品种（系）。为此，对优良地方品种蒙古马免疫相关基因进行研究，不但可以进一步了解蒙古马抗病力

3、强的原因，为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，而且可以对蒙古马种质资源的保护、利用和创新起到积极的作用，并指导地方品种马的杂交改良、品种（系）的培育。本研究以蒙古马为研究对象，以纯血马为对照，首先对蒙古马与纯血马血液生化、免疫和抗氧化指标进行测定分析，判断正常生理情况下，蒙古马与纯血马血液指标是否存在差异，从总体上掌握两个品种马抗病力的情况；其次，对马匹抗病候选基因TLR2、TLR4多态性进行研究，分析两个品种马基因型的差异性；再次，采用实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）的相对定量方法对两个品种马不同组织中TLRs基因的表达量进行差异分析，同时对在脂多糖（LP

4、S）诱导下的两个品种马单核细胞与免疫相关基因的差异表达进行研究，得到各基因的相对表达量，进而分析免疫相关基因对不同品种间抗性的影响；最后，利用高通量测序技术对蒙古马与纯血马脾脏表达谱文库进行测序，以寻找两个品种马脾脏组织中的差异表达基因。通过本研究的结果可以为揭示蒙古马抗病力遗传特性提供理论依据，并获得以下主要研究结果：1．通过对血液生化、免疫和抗氧化指标的结果分析发现，纯血马血液中白蛋白和胆固醇的含量偏高，这与其饲料营养水平相一致；蒙古马血液中球蛋白、IgG和IgA的含量均显著高于纯血马（P＜0.05），推测与蒙古马的免疫力高有关。2．采用PCR-SSCP技术对蒙古马与

5、纯血马TLR2基因进行分型，两个群体都呈现出三种基因型（AA、AB和BB型）；经测序发现该基因外显子存在两处突变：编码区945bp位置G→C的同义突变和1070bp位置G→A的错义突变；由于密码子的摆动性，945bp位置并未导致精氨酸的突变；而1070bp位置由精氨酸突变为谷氨酰胺。对基因型统计分析，蒙古马与纯血马品种之间不同基因型分布存在显著差异（0.01≤P＜0.05）。3．通过直接测序方法发现，蒙古马与纯血马TLR4基因第3外显子共发现11处碱基突变，其中8处（520bp位置T→G，668bp位置A→G，817bp位置C→T，1003bp位置C→T，1513bp位置

6、T→C，1546bp位置G→A，1771bp位置T→C和1903bp位置T→C）为同义突变；其他3处，713bp位置C→A导致谷氨酰胺变为赖氨酸，1353bp位置T→C使甲硫氨酸变为苏氨酸，1673bp位置A→G导致甲硫氨酸变为缬氨酸，并且这3处不同基因型分布存在极显著差异（P＜0.01）。-△Ct4．采用RT-qPCR的2方法对蒙古马与纯血马TLR1-9基因在肝脏、脾脏、肺脏、盲肠和骨髓组织进行了差异表达研究。结果表明各基因在5个组织中均有表达；TLRs基因在免疫器官（脾脏和骨髓）中的表达量为蒙古马高于纯血马；而在肝脏中为蒙古马低于纯血马。5．马外周血单核细胞经LPS刺

7、激后，无论是蒙古马还是纯血马TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、INF-β、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量都有所增加（与对照组相比）；TLR4、CD14、IL-1β、IL-6和IL-8基因的表达量均是蒙古马低于纯血马，其中TLR4基因和IL-1β基因表达差异显著（P＜0.05）。单核细胞上清液中细胞因子（TNF-α、INF-β、IL-1β和IL-8）含量在两个品种之间差异不显著（P≥0.05）。6．构建了蒙古马-脾脏和纯血马-脾脏组织表达谱文库，经IlluminaMiseq高通量测序，分别获得了6811804和