慢病毒介导的rna干扰gdnf表达对大鼠乳腺癌致骨癌痛疗效的研究

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分类号：R614密级：公开单位代码：10760学号：107601110518新疆医科大学XinJiangMedicalUniversity博士学位论文THESISOFDOCTORDEGREE临床医学专业学位(学位教育)论文题目：慢病毒介导的RNA干扰GDNF表达对大鼠乳腺癌致骨癌痛疗效的研究研究生孟馥芬指导教师王喜艳、王廷华专业学位领域外科学研究方向麻醉、疼痛研究起止时间2012年02月2013年08月所在学院第三临床医学院2013年10月万方数据 慢病毒介导的RNA干扰GDNF表达对大鼠乳腺癌致骨癌痛疗效的研究研究生孟馥芬指导教师王喜艳王廷华专业学位领域外科学研究方向麻醉、疼痛2013年10月万方数据 万方数据 Studyontheeffectofanalgesiainbonecancerpaininducedbylentivirus-mediatedRNAinterferencetheexpressionofGDNFgeneＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofMedicineByFu-fenMengSurgeryDissertationSupervisor:Xi-yanWangassociatepro.Ting-huaWangpro.October,2013万方数据 万方数据 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，同意（选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：万方数据 万方数据 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名GDNFGlialcellline-derivedneurotrophicfactor胶质细胞源性神经营养因子NGFnervegrowthfactor神经生长因子HIVhumanimmunodeficiencyvirus人免疫缺陷病毒PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应realtimePCR实时PCRRTPCRReverseTranscriptionPCR逆转录PCRSiRNAsmallinterferingRNA小干扰RNAshRNAshorthairpinRNA短发夹RNARNAiRNAinterferenceRNA干扰mRNAmessengerRNA信使RNAFCSfetalcalfserum胎牛血清PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲盐溶液SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠PAGEPolyacrylamidegelelectropheresis聚丙烯酰胺凝胶电泳TrkAtyrosinekinaseA酪氨酸激酶ACGRPcalcitoningene-relatedpeptide降钙素基因相关肽SPsubstancePP物质DRGdorsalrootganglion背根神经节NPneuropathicpain神经病理性疼痛GFRα1GDNFfamilyreceptorα1GDNF家族受体α1MAPKmitogen-activatedproteinkinase丝裂素活化蛋白激酶ERKextracellular-regulatedkinase细胞外信号调节激酶TrkAtyrosinekinaseA酪氨酸激酶ATRPtransientreceptorpotential瞬时感受器电位GFAPglialfibrillaryacidicprotein神经胶质原纤维酸性蛋白SCDHSpinalcorddorsalhorn脊髓背角万方数据 万方数据 目录摘要…………………………………………………………………………………………………1ABSTRACT……………………………………………………………………………………………3………前言…………………………………………………………………………………………………5第一部分：……………………………………………………………………………………………………9研究内容与方法…………………………………………………………………………………91.研究内容与方法………………………………………………………………………………91.1研究对象………………………………………………………………………………91.2内容与方法……………………………………………………………………………91.3质量控制…………………………………………………………………………………191.4统计方法……………………………………………………………………………21结果……………………………………………………………………………………………21**讨论…………………………………………………………………………………………24小结…………………………………………………………………………………………29**第二部分：…………………………………………………………………………………………30*30*研究内容与方法……………………………………………………………………………301.研究内容与方法……………………………………………………………………………301.1研究对象……………………………………………………………………………301.2内容与方法……………………………………………………………………………301.3质量控制……………………………………………………………………………331.4统计方法……………………………………………………………………………33结果…………………………………………………………………………………………34讨论…………………………………………………………………………………………37小结…………………………………………………………………………………………41第三部分：…………………………………………………………………………………………42研究内容与方法……………………………………………………………………………42万方数据 1.研究对象与方法…………………………………………………………………………………421.1研究对象………………………………………………………………………………………421.2内容与方法…………………………………………………………………………422.1质量控制………………………………………………………………………………………492.2统计方法………………………………………………………………………………………50结果………………………………………………………………………………………………………51讨论…………………………………………………………………………………………………60小结…………………………………………………………………………………………………71结论…………………………………………………………………………………………………72致谢………………………………………………………………………………………………73参考文献…………………………………………………………………………………………74综述…………………………………………………………………………………………………85攻读博士学位期间发表的学术论文……………………………………………………………94个人简历…………………………………………………………………………………………95导师评阅表……………………………………………………………………………………………96万方数据 摘要慢病毒介导的RNA干扰GDNF表达对大鼠乳腺癌致骨癌痛的疗效研究博士研究生：孟馥芬导师：王喜艳王廷华教授摘要背景：骨癌痛在临床上很常见，但机制尚不明确，目前的临床治疗手段多为药物治疗，远不能满足患者的需求，学者们转而寻求生物治疗。本研究旨在探索骨癌痛的发生机制，以期寻求新的镇痛方法。目的：1)复制大鼠乳腺癌致胫骨骨癌痛的动物模型；2)构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)shRNA慢病毒重组体；3)研究shRNA-GDNF对乳腺癌致骨转移癌痛的疗效；4)研究shRNA-GDNF镇痛的可能机制。方法：1)复制大鼠乳腺癌致胫骨骨癌痛的动物痛模型，从疼痛行为学、骨损害形态学的角度来检验评价模型；2)设计、构建慢病毒包装的RNA干扰GDNF重组体；3)选择骨癌痛模型复制成功的大鼠行鞘内置管，随机分为四组，分别给予鞘内注射：生理盐水；慢病毒包装的RNA干扰GDNF重组体(psiHIV-GDNF-mU6)；慢病毒空载体(psiHIV-U6)；以及吗啡。比较给药前、后7d、14d时的大鼠热痛阈、机械痛阈的变化。4)应用免疫荧光染色、RT-PCR及Western-blot等技术检测GDNF及星形胶质细胞标志物GFAP、疼痛相关调质P物质（SP）、降钙素基因相关肽(CGRP)和疼痛下游信号分子PERK、c-fos的表达水平。结果：1)大鼠乳腺癌致胫骨骨癌痛的动物模型复制成功；2)慢病毒包装的RNA干扰GDNF重组体构建成功；3)注药后7d时，各组机械痛结果无差异。注药后14d时，Lv-shRNA-GDNF组、吗啡组机械痛阈值明显较生理盐水组及空载体对照组延长。注药后7d、14d时Lv-shRNA-GDNF组与吗啡组温痛觉阈值较生理盐水组及空载体对照组明显延长。4)骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞显著活化，GFAP在生理盐水组及空载体组表达增高，Lv-shRNA-GDNF组与吗啡组表达下降至正常水平。5)GDNFRNA干扰表达有效，GDNF表达水平显著下降，Lv-shRNA-GDNF组与吗啡组镇痛效果相似。6)疼痛相关分子SP、CGRP、c-fos以及PERK呈现一致变化趋势，在生理盐水组及空载体组表达增高，Lv-shRNA-GDNF组与吗啡组表达下降至正常水平。结论：1)大鼠乳腺癌致胫骨骨癌痛的动物模型是有效的骨癌痛模型，同时再现了骨癌痛骨破坏和疼痛行为学变化的特点。2)骨癌痛大鼠脊髓星形胶质细胞显著活化。3)慢病毒包装的RNA干扰GDNF鞘内注射对大鼠骨癌痛的治疗是有效的。4)星形胶质细胞活化释放的GDNF、1万方数据 新疆医科大学博士学位论文疼痛相关分子SP、CGRP等以及ERK/MAPK通路引发级联放大的正反馈效应可能是骨癌痛形成痛敏的发病基础。关键词：骨癌痛；胶质细胞源性神经营养因子；RNA干扰；慢病毒；星形胶质细胞2万方数据 AbstractStudyontheeffectofanalgesiainbonecancerpaininducedbylentivirus-mediatedRNAinterferencetheexpressionofGDNFgeneProstgraduate:MengFu-fenSupervisor:WangXi-yanAssociateProf.WangTing-huaProf.AbstractBackground:Bonepainiscommonsymptominthecancerpatientsespeciallywithbonemetastasesandtheunderlyingmechanismsofcancerinducedbonepainarenotknownclearly.Clinicaltherapyisfarfrommeetingtheneedofpatients.Therefore,theaimofthispaperistoexploretheendogenousanalgesicmechanismsanddevelopnewbiotherapy.Objective：1)Toestablishratsbonecancerpainmodelswithintra-tibialinjectionsofratfemoralmammarycarcinomaMRMT-1cells.2)ToconstructlentiviruscontainrecombinantvectorofHomosapiensglialcell-derivedneurotrophicfactorisoform(GDNF):psiHIV-GDNF-mU6.3)TostudythetherapeuticeffectofpsiHIV-GDNF-mU6recombinant.4)TostudytheunderlyingmechanismsofpsiHIV-GDNF-mU6recombinant.Methods:1)Toduplicateratsbonecancerpainmodelswithintra-tibialinjectionsofratfemoralmammarycarcinomaMRMT-1cells,andthentestandevaluatethemodelfrompainbehaviorandmorphology;2)TodesignandconstructlentiviruscontainrecombinantvectorofHomosapiensglialcell-derivedneurotrophicfactorisoform(GDNF):psiHIV-GDNF-mU6;3)Successfulmodelsratswithstabilephysiclalstatuswerechoosedforintrathecaltubeindwelling.Theseratswererandomlydividedinto4groupsaccordingtodifferentdrugswhichinfusedintosubarachnoidspacethroughtheintrathecaltubes:Saline，Morphine,psiHIV-U6,psiHIV-GDNF-mU6.Toobservethechangesofthermalandmechanicalpainthresholdfrompreoperativeto7daysand14daysafteradministration.4)TodetectthelevelsofGDNF,GFAP,PERK,andsubstancePcalcitoningene-relatedPeptideandc-fosbyimmunofluorescentstainingtechnique,RT-PCRandWesternblotanalysis.Results:1)Thecloneofbonecancerpainmodelsofratshasbeenmadesuccessfully.2)TherecombinantofpsiHIV-GDNF-mU6hasbeenconstructed3万方数据 新疆医科大学博士学位论文successfully.3)MechanicalpainthresholdincreasedinMorphinegroupandpsiHIV-GDNF-mU6groupthanothergroupsat14dafteradministration(P<0.05),whilethereisnodiffierenceat7dafteradministration.ThermalpainthresholdincreasedinMorphinegroupandpsiHIV-GDNF-mU6groupthanothergroupsat7dand14dafteradministration(P<0.05).4)SignificantastrocyticactivationoccurredinSalineandpsiHIV-U6group.5)RNAinterferenceeffectivelydecreasedtheexpresslevelofGDNF.6)TheexpresslevelofSP、CGRP、c-fosandPERKandthechangeofpainbehaviorshowthesametendency.Conclusions:1)ratbonecancerpainmodelwithintra-tibialinjectionsofratfemoralmammarycarcinomaMRMT-1cellsisavailablemodel,osteoclasiaandthechangeofpainbehaviorhavebeenbothdetected.2)AstrocytichadbeenactivatedsignificantlyinSalineandpsiHIV-U6group.3)TheadministrationofrecombinantofpsiHIV-GDNF-mU6insubarachnoidspaceiseffectivetobonecancerpainmodel.ERK/MAPKpassagewaymayworkintheanalgesiaoftherecombinantofpsiHIV-GDNF-mU6.4)TheeffectofcascadeamplificationinitiatedbyastrocyticreleasedGDNF,SP,CGRPandERK/MAPKpathwaymaybethebaseofHyperalgesiainbonecancerpain.Keywords:Bonecancerpain；Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,(GDNF)；RNAinterference,(RNAi)；Lentiviral,(LV)；Astrocytic.4万方数据 前言前言癌性疼痛在临床十分常见但治疗却十分棘手，严重影响了癌症患者的生活[1]质量。临床观察显示，大约30%-50%的癌症患者会出现癌痛。当癌症到了晚[2]期，遭受癌痛折磨的患者骤升至75%-95%，其中80%来自骨转移引起的慢性[3,4]疼痛。随着肿瘤治疗的发展，带瘤生存的患者越来越多、生存时间也越来越长，骨转移引发的疼痛在临床上越来越常见。由于目前临床治疗手段的局限性，[5]至少45%的癌症患者的疼痛不能到有效控制。疼痛严重影响了这些患者的生活，甚至使他们痛不欲生，现有的临床治疗方法仍以WTO推荐的以药物治疗为主的三阶梯治疗方案为常见，治疗效果有限。其中常用的药物是：①非甾体类抗炎镇痛药物；②阿片类镇痛药；③辅助镇痛药、镇静药和营养神经药等。这些药物的搭配使用在很大程度上减轻了疼痛，改善了癌痛患者的症状。然而，癌痛属于慢性疼痛，其病程是一个长期慢性的过程，只要癌症存在就会持续发展下去，并有愈演愈烈的趋势。镇痛药物在机体内的半衰期十分有限，即便是缓释剂型也远远不能满足患者的需求。同时对于癌痛中突来突止的暴发性疼痛，药物治疗越发显得无能为力。疼痛发作时，药物尚未起效；疼痛退去时，药物副作用仍在残留。为了控制长期慢性的疼痛，患者不得不长期使用多种镇痛药物，于是嗜睡、便秘、成瘾、耐受甚至呼吸抑制等等一系列药物相关不良反应接踵而来，令患者和医生难以忍受，因而医患双方都希望能有合适的治疗方法来改变这一现状。癌痛的治疗也就因此成为世界性的公共卫生难题。目前，基因治疗在很多疾病的治疗研究中已取得了一定效果，部分甚至已经走入临床阶段。关于疼痛的基因治疗也是当前学者们关注的热点。基因治疗疼痛的研究主要从两方面进行：一是上调镇痛基因在体内的表达，二是下调致痛基因在体内的表达，使其发挥相应的生物学效应。骨癌痛的基因治疗就是寻找有效的目的基因，借助载体将外源性的目的基因导入机体，使镇痛基因在体内持续过表达，或使致痛基因在体内保持沉默不表达，从而达到为骨癌痛患者减轻疼痛，改善生活质量的目的。研究旨在探索目的基因在骨癌痛形成和维持中的作用机制以及相关的信号通路。由于基因治疗的方法是依据目的基因在疾病中的作用机制制定，针对性强，所以疗效肯定，并且没有临床上药物不良反应的限制，被很多学者认为是值得深入研究的最有前景的治疗方法。早期，学者们采用细胞移植镇痛的办法已经取得了成功。Sagen早在1986年将牛肾上腺髓质嗜铬细胞移植到大鼠蛛网膜下腔，通过移植细胞不断分泌5-TH和去甲肾上腺素以及脑啡肽等镇痛物质发挥镇痛作用。事实证明，基因治疗手段在癌痛治疗中是有效的，但是细胞移植法镇痛存在细胞来源、细胞移植后的存活率、5万方数据 新疆医科大学博士学位论文细胞移植后使用的免疫抑制剂对病人的免疫功能产生抑制等问题。后来，学者们改善了这一做法，放弃了细胞移植，借助病毒或非病毒载体将目的基因导入，避免了上述缺陷，也取得了相应的成功。有研究报道，采用脑源性神经营养因子BDNF进行基因治疗可有效减轻神经元局部缺血损伤或毒性改变引起的神经[6]源性痛以及相关症状。文献检索还可以见到类似研究报道。迄今为止，学者们对疼痛，尤其是炎性痛和神经痛的形成和维持的机制有了越来越深入的认识，疼痛的基因治疗也已取得了一定成效。相比之下，骨癌痛相关的研究仍处于落后阶段，机制不清，目的基因靶向治疗研究较少，仍处于实验室阶段，还需要经过不断的摸索、试验、检验，才能决定其临床使用价值。实验室研究不同于临床研究的最突出的一点就是需要建立可靠的动物模型。癌痛就是指癌症发展直接造成的疼痛以及癌症治疗后的疼痛。骨癌痛是其中常见且具有代表意义的一种疼痛，一般多见于恶性肿瘤的骨转移和原发于骨组织的肿瘤生长。理论上来说，骨癌痛应该是由骨质的破坏引起的，两者应该存在必然联系。骨转移的人群发病率非常高，但仅有部分的患者有临床症状。常见的症状有日益加重、间隙性渐变为持续性的深部疼痛（50%-90%）；病理性骨折（5%-40%）；高钙血症（10%-20%）；脊柱不稳和脊髓神经根压迫症状（<10%）；骨髓抑制（<10%）；恶液质表现等等。其中以骨癌痛最为常见。关于骨癌痛的临床观察显示并非所有恶性肿瘤引发骨转移或者原发骨肿瘤的患者均有疼痛表现，相当一部分患者仅在医院行CT及MRI等影像学检查过程中发现有骨质破坏存在，自己并无疼痛及不适的自觉症状。由于骨转移患者可能不伴有疼痛症状，依据骨癌痛患者的这一特点，骨损害的形态学改变和疼痛行为学改变两者的共同存在也就成了评价骨癌痛动物模型成功与否的标准。相比于其他慢性痛，如炎性痛、神经痛，骨癌痛的研究起步较晚。直到1999年，美国学者用同品系的溶骨纤维肉瘤细胞[7]种植在小鼠股骨腔内，这才成功构建了首例小鼠骨癌痛模型。开辟了骨癌痛研究的新纪元。2002年，英国学者Medhurst用MRMT-1大鼠乳腺癌细胞成功构[8]建成首例大鼠胫骨骨癌痛模型。研究证实上述两种模型动物均出现了明显的痛觉过敏现象，以及显著的骨质破坏改变。进一步的研究发现，吗啡对Medhurst[9]构建的触诱发痛和痛觉过敏治疗有效。骨癌痛治疗药物二磷酸盐和选择性COX-2[10]抑制剂等也可有效缓解疼痛症状，再次证明是上述模型是可靠的骨癌痛动物模型，也是目前世界上研究骨癌痛常用的动物模型。有研究发现，小鼠模型复制周期较短生长快，易发生病理性骨折，疼痛行为学检测比较困难，因而大鼠胫骨骨癌痛[11]模型更有利于进行骨癌痛的研究。综合以上因素，本研究设计选用了Medhurst构建的乳腺癌致大鼠胫骨骨癌痛的模型。6万方数据 前言基因治疗的核心就是选择合适有效的目的基因。本文选择的是胶质细胞源性神经营养因子，这是目前发现最强大的神经营养因子。最初发现，GDNF对多巴胺能神经元有特异性营养活性，并且在帕金森氏病的治疗中取得了一定成效。随后的研究发现GDNF对胆碱能运动神经元、感觉神经元、交感神经元都有一定的作用。随着对GDNF多种生理功能研究的进一步深入，该因子显示出越来越多的功能多样性。GDNF在疼痛中的作用也是其中一个重要方向。研究发现在小鼠和大鼠的胚胎期，约70%-80%的背根神经节的感觉神经元表达神经生长因子(NGF)的受体酪氨酸激酶A（tyrosinekinaseA，TrkA）。其中大多数也同时表达与疼痛密切相关的降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质。在小鼠和大鼠出生后的3个星期内，约有一半的DRG的感觉神经元不再表达TrkA，这些丢失了TrkA的细胞却能表达GDNF的经典受体Ret。自胚胎发育后期至出生后的第一个星期，Ret在那些TrkA下降的神经元中的表达显著增加。成年动物脊髓DRG内[12,13]存在大量GDNF免疫反应阳性的神经元，且表而分布有GDNF受体。从而表明，动物出生后DRG感觉神经元从对NGF的依赖逐渐转向对GDNF的依赖，并一直维持至成年。已知，NGF可以致痛，据此推测，GDNF可能具有相似的作用。目前，大量的研究结果显示GDNF参与了炎性痛、肌肉痛的形成和维持，但是在神经痛中可能扮演相反的角色。至于，GDNF在骨癌痛中的作用迄今仍未见相关报道。我们假设GDNF在骨癌痛中起致痛作用，那么抑制或者关闭GDNF的表达可能产生镇痛效果。RNA干扰技术可以有效实现这一目的。目的基因GDNF的导入需要一种有效载体，以保证持续有效的长期镇痛效果来对付顽固的骨癌痛。一般的，基因转运载体分为病毒载体和非病毒载体。有研究报道非病毒载体——脂质体可用于GDNF的转染。脂质体作为基因载体优点是：脂质体可以降解，无细胞毒性及免疫源性；缺点是仅对刚接种的神经[14]元转染效果好，转染率较低，且不稳定，持续表达时间短。病毒载体在既往的研究中表现出更多的优势而逐渐在基因载体领域占据了主体地位。常见的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等等。上述各种病毒载体各有其不同特点。经过比较我们在研究中选用了慢病毒(Lentiviral,LV)作为载体。慢病毒属于逆转录病毒科(Retrovidae)，是一种RNA病毒。慢病毒在宿主细胞内，能以RNA为模板，在自身反转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板合成双链DNA，经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达。慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础去除部分基因，代之以所需的目的基因和标记物构建而成。与其它载体比较，慢病毒载体具有以下突出优点：（1）既可以感染分裂期细胞又能感染非分裂期细胞。逆转录病毒载体不能感染非分裂期细胞。腺病毒和腺相关病毒载体虽然具有感染7万方数据 新疆医科大学博士学位论文非分裂期细胞的能力，但容易引起炎症和毒性反应。慢病毒可以感染非分裂细胞的特点使慢病毒更适于神经系统方面的应用。目前，慢病毒RNA干扰技术在帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬症这两种难治性神经系统疾病的研究中均有应用并取得了一定的效果。（2）没有明显的免疫反应。（3）病毒突变和产生有复制能力的病毒机率小。(4)可以兼容多个转录启动子，转录多个目的序列片段。（5）能够容纳相大的转移基因序列。慢病毒经过改建后可以容纳10Kb左右的外源基因片段，因此应用范围更加广泛。另外，慢病毒基因组可以与宿主基因组整合，因此更适合长期诱导转移基因的表达。因而，本研究选用了慢病毒载体。目前，靶向GDNF基因的siRNA(smallinterferenceRNA,siRNA)技术治疗骨癌痛的实验研究国内外文献未见报道。针对GDNF为靶点的基因治疗在骨癌痛治疗中可能具有的潜在应用前景。本课题的研究的目标就是依据RNA干扰（RNAinterference,RNAi）原理，使用RNAi质粒载体技术[42],以GDNF基因为靶点，用GDNF基因低表达的乳腺癌致胫骨骨癌痛的大鼠为研究对象，设计、构建、筛选靶向GDNF基因的小干扰RNAsiRNA,研究siRNA特异诱导GDNF基因转录后沉默，减轻骨癌痛的痛觉过敏症状，阐明GDNF-siRNA对于骨癌痛基因治疗的可行性和特异性，为寻求一种更为有效的骨癌痛基因靶向治疗提供新方法。整个研究分三部分进行：第一部分：观察设计的针对GDNF基因的SiRNA的RNA干扰效应，为后续的慢病毒载体的构建及体内实验奠定基础。比较多个GDNF基因的RNA干扰序列，构建RNA干扰质粒，通过荧光显微镜观察、WesternBlot测定GDNF蛋白含量以观察RNA干扰效应。结果显示针对GDNF基因的多条干扰片段均能使GDNF基因表达下调，其中片段3干扰效果最强。将干扰片段3重组到慢病毒穿梭质粒中，将重组质粒和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装出复制缺陷的慢病毒颗粒，检测转染效率，结果为RGDNF-HIV=0.87，RSH-GDNF-HIV=0.96。然后进88行载体病毒滴度的测定，结果为TGDNF-HIV=7.2x10pfu/ml，TSH-GDNF-HIV=1.74x10pfu/ml。这表明SH-GDNF-HIV重组体构建成功，慢病毒作为载体的转染效率高，病毒滴度高。第二部分复制大鼠胫骨骨癌痛模型，以疼痛行为学和骨损害的形态学改变来评价模型是否成功。第三部分将携带有siGDNF的慢病毒颗粒注入大鼠体内，研究siGDNF的RNA干扰效应，和GDNFRNAi对骨癌痛的治疗作用。同时采用RT-PCR、Western-blot、荧光免疫组化等技术研究GDNFRNA干扰对GDNF基因表达水平的影响，观察脊髓胶质细胞活化的情况，疼痛相关调质P物质、降钙素基因相关肽和疼痛下游信号分子细胞外信号调节激酶(PERK)和c-fos的表达水平的变化。8万方数据 第一部分·研究内容与方法第一部分慢病毒介导的GDNFshRNA重组体构建RNA干扰是由小的双链RNA介导的转录后基因沉默现象，是生物体内一种自然现象，广泛存在于生物界，在机体进化上是一种保守而古老的抵御外来病毒侵犯或转基因的防御机制，其最主要的功能是调节和关闭基因的表达，从而达到调控细胞各种高级生命活动的效应。2001年Tuchl等首次应用双链小分子干扰RNA（siRNA）在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，从而在世界范围内掀起了研究和应用RNA干扰技术的热潮。RNA干扰之所以能引起生物医学界几乎所有研究领域的广泛兴趣，是因为siRNA具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。siRNA深入揭示了细胞内基因沉默的机制，在某个基因表达异常增高引起的疾病如病毒感染，肿瘤等的治疗中可能成为一种极具前景的基因靶向药物。研究显示GDNF参与了疼痛的调控，但是在不同情况下可能表现出不同的作用。GDNF在炎性痛中可能借助炎症介质促进炎性痛的形成和维持。GDNF在神经痛中可能通过阻止河豚毒素敏感型钠通道的过度表达，以及促进止痛性质的生长抑素等神经肽的表达而产生镇痛作用。骨骼肌来源的GDNF可能导致骨骼肌的机械痛疼敏。迄今，GDNF在骨癌痛中的作用尚未见相关报道。我们假设GDNF在骨癌痛中起致痛作用，那么建立慢病毒介导的GDNFshRNA重组体即可以实现镇痛效果；反之，GDNF则可能在骨癌痛中扮演相反的角色。本部分建立GDNFshRNA重组体为下一步的疼痛治疗实验奠定基础。1研究内容与方法1.1研究对象1.1.1病毒质粒第三代三质粒慢病毒载体系统、shRNA-GDNF干扰质粒由广州复能基因有限公司(Genecopoeia)提供。293Ta细胞株和HT-1080细胞株由中科院上海细胞所提供。TM感受态细胞Stbl3由广州复能基因有限公司提供。1.2内容与方法1.2.1主要仪器高温干燥箱上海跃进医疗器械有限公司制冰机日本SANYO全自动消毒锅日本SANYO(MLS-3020)无菌操作台苏州亿达净化实验室设备有限公司(SW-ST-2FD)生物安全柜9万方数据 新疆医科大学博士学位论文低温离心机日本HITACH：CF-16RX小容量离心机上海安亭科学仪器厂大容量离心机美国ThermoFisher（D-37520）分散机德国IKA：T10全波长分光光度计美国UNICO（720BR/02050）PCR仪美国BIO－RAD：MJmini（4345240）微波炉格兰仕水平电泳槽北京六一电泳槽公司凝胶成像仪美国BIO-RAD垂直电泳槽美国BIO-RAD湿式转膜槽美国BIO-RAD水平、钟摆式摇床江苏海门市麒麟医用仪器厂塑料薄膜封口机上海麦尔多机械有限公司光学显微镜日本Olympus倒置显微镜德国LEICA（DMI6000B）普通冰箱澳柯玛低温冰箱日本SANYO（MDF-1156）HSS-1数字式超级恒温浴槽成都仪器厂隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司电子天平瑞士Precisa酶标仪美国BIO-RAD纯水设备台湾艾柯PHS-4C+型精密PH仪成都世纪方舟科技有限公司5ml玻璃匀浆器上海玻璃仪器厂高速冰冻离心机美国Thermo漩涡混匀器美国CRYSTALGelDoc凝胶成像分析仪美国BIO-RAD超声波细胞粉碎机北京比朗实验设备有限公司加样枪德国Eppendorf：1000μL、200μL、10μL、2.5μL细胞培养板6孔、96孔耗材各规格EP管、加样枪头、锡箔纸、饭盒、保鲜膜等1.2.2主要试剂1.2.2.1细胞培养试剂：高糖DMEM、opti-MEM、1mol/LHCL、1mol/LNaOH、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaCl、EDTA、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胰蛋白酶、重铬酸钾、浓硫酸、小牛血清购自杭州四季青、lipo2000转然试剂盒。1.2.2.2RT-PCR试剂：Trizol（Ivitrogen），DEPC（大连TARKRA），琼脂糖（西班牙）,genegreen（百泰克），氯仿、异丙醇、75%乙醇、EDTA、冰乙酸、Tris等均为分析纯。组织蛋白裂解液（碧云天，PIPA）、ECL显色液（南京凯基）。10万方数据 第一部分·研究内容与方法1.2.2.3WesternBlot试剂：组织蛋白裂解液，-20℃(碧云天，PIPA)，蛋白酶抑制剂，4℃(Roche)，ECL显色液，4℃(南京凯基)，第一抗体鼠源β-actin，(天津三箭)，第二抗体山羊抗鼠(北京中杉金桥)，甲醇(成都科龙)，Tween-20(Solarbio)，脱脂奶粉(完达山)，Tris碱(Solarbio)，蛋白上样缓冲液(Fermentas)，蛋白marker(Fermentas)，甘氨酸(北京鼎国)，SDS(Biosharp)，浓HCl(成都欣海兴)，NaCl(天津博迪)，BCA(显色液碧云天），过硫酸铵(Amresco)，丙烯酰胺(Amresco)，双叉丙烯酰胺(Biosharp)，TEMED(Sigma)，BSA(Wolsen)，考马斯亮蓝(国产分析纯)。1.2.2.4相关试剂配制(1)蛋白酶抑制剂：配制方法：1.准备1.5mlPCREP管一只，小心用消过毒的镊子把鸡尾酒片1片移置离心管中，用1000ul移液枪吸取双蒸水1.0ml注入EP管，可用涡旋混匀器混匀。保存条件：-20℃保存。用途：保护蛋白质，碾磨组织时，与蛋白裂解液混合与匀浆器中使用。(2)10％十二烷基硫酸钠（SDS）:配制方法：1.称量SDS10g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持SDS瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减zhikuquan20150807小以减小误差。2.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的SDS移置广口瓶中，用250ml量筒取来110ml双蒸水，倒入100ml于广口瓶用玻棒搅匀。保存条件：常温保存，其间若出现沉淀，水浴溶化后仍可使用。用途：配制SDS-PAGE胶之分离胶与浓缩胶。(3)10％过硫酸胺（AP）:配制方法：1.称量AP0.1g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持APS瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备PCREP管1.5ml一只，小心把称量好的APS移置离心管中，用1000ul移液枪吸取双蒸水1.0ml注入EP管，可用涡旋混匀器混匀。保存条件：溶解后，分装于PCR离心管中，-20℃保存。用途：配制SDS-PAGE胶之分离胶与浓缩胶。(4)1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）：配制方法：1.称量Tris碱90.75g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Tris碱瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的Tris移置广口瓶中，用1mol/LHCL调节PH至8.8。用500ml量筒取来410ml双蒸水，倒入400ml于广口瓶中定容用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：配制SDS-PAGE胶之分离胶。11万方数据 新疆医科大学博士学位论文(5)0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）：配制方法：1.称量Tris碱12g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Tris碱瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的Tris移置广口瓶中，用1mol/LHCL调节PH至6.8。用250ml量筒取来130ml双蒸水，倒入120ml于广口瓶中定容用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：配制SDS-PAGE胶之浓缩胶。(6)30％Acr/Bic（29：1）：配制方法：1.称量Acr150g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Acr瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.同理，取Bic4g。3.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的Acr和Bic移置广口瓶中。用1000ml量筒取来510ml双蒸水，倒入500ml于广口瓶中定容用玻棒搅匀。保存条件：滤纸过滤后，棕色瓶后4℃保存。使用时室温静置30min且无沉淀。用途：配制SDS-PAGE胶之浓缩胶。(7)250考马斯亮蓝溶液配制方法：1.称量考马斯亮蓝G250100mg：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持考马斯亮蓝G250瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备干净广口瓶一只,小心把称量好的考zhikuquan20150807马斯亮蓝G250移置广口瓶中。3.用100ml量筒取来95％乙醇60mL，倒入广口瓶50ml。4.用250ml量筒取来磷酸110mL，倒入广口瓶100ml.5.用1000ml量筒取来双蒸水750ml，倒入广口瓶750m并用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：电泳后染色PAGE胶来确定电泳效果。(8)100mg/mL牛血清白蛋白（BSA）：配制方法：1.称量BSA0.1g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持BSA瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备PCREP管1.5ml一只，小心把称量好的BSA移置离心管中，用1000ul移液枪吸取生理盐水1.0ml注入EP管，可用涡旋混匀器混匀。保存条件：-20℃保存。用途：绘制标准曲线时使用。(9)电泳液缓冲液：配制方法：1.称量Tris（MW121.14）3.03g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Tris瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.同理称量甘氨酸（MW75.07）18.77g，DS1g。3.准备干净广口瓶一只,小心把称量好的Tris，甘氨酸，SDS移置广口瓶中。4.用1000ml量筒取来双蒸水倒入广口瓶定容至1000ml，用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：电泳时加于电泳槽中，导电的作用。12万方数据 第一部分·研究内容与方法(10)湿转移缓冲液：配制方法：1.称量Tris（MW121.14）3.03g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Tris瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.同理称量甘氨酸（MW75.07）18.77g。3.准备干净广口瓶一只,小心把称量好的Tris，甘氨酸移至广口瓶中。4.用250ml量筒取210ml99.9%甲醇，倒入广口瓶中200ml。5.用1000ml量筒取来双蒸水倒入广口瓶定容至1000ml，用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：转膜时加入转膜槽，有导电作用。(11)TBS缓冲液（10X）：配制方法：1.称量Tris碱24g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持Tris碱瓶子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.同理称重88gNacl。3.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的Tris移置广口瓶中，用1mol/LHCL调节PH至7.6。用1000ml量筒取来双蒸水，倒入广口瓶中定容1000ml用玻棒搅匀。保存条件：常温保存。用途：配制抗体稀释液以及TBST，用前稀释到10X。(12)TBST缓冲液：配制方法：1.准备干净广口瓶一只，用1000ul的移液枪取1000ul的Tween20。2.用1000ml量筒取来双蒸水，倒入广口瓶中定容至1000ml用玻棒搅匀。保存条件：zhikuquan20150807常温保存。用途：洗膜。(13)封闭液：配制方法：1.称量脱脂奶粉5g：取一张干净滤纸置于天平上调零后，边左手持脱脂奶粉袋子右手叩击左手腕部加样于滤纸上边读数，接近所需刻度时注意抖动幅度应该减小以减小误差。2.准备干净广口瓶一只，小心把称量好的奶粉移置广口瓶中。3.用1000ml量筒取来双蒸水，倒入广口瓶中定容1000ml用玻棒搅匀。保存条件：4℃保存。用途：占据背景位点，保证一抗与蛋白质的特异性结合。(14)抗体稀释：westernblot用一抗、二抗均用1XTBS稀释至合适浓度使用，如果背景过高则使用含5%脱脂牛奶的TBST，减小非特异性结合。(15)0.01MPBS液：配制方法：①0.2MPB（pH7.4）：A液：NaH2PO4·2H2O31.2g，溶解后，加双蒸水至1000ml；B液：Na2HPO4·12H2O71.632g，溶解后，加双蒸水至1000ml；取19ml0.2MA液和81mlB液充分混合，通过改变二者的比例调整pH值，室温保存。②0.1MPB：0.2MPB100ml加入1000ml容量瓶中，加双蒸水至1000ml，充分摇匀。③0.05MPBS：取NaCl4.5g及0.1MPB500ml加入1000ml容量瓶中，加双蒸水至500ml，充分摇匀。④0.01MPBS：取NaCl8.5-9g及0.2MPB50ml加入1000ml容量瓶中，加双蒸水至1000ml，充分摇匀。13万方数据 新疆医科大学博士学位论文(16)0.25％胰蛋白酶：配制方法：①称取胰蛋白酶粉末250mg。②先用少量D-Hanks液将胰蛋白酶粉末调成糊状，再补足D-Hanks至100ml搅拌混匀。③0.22um虑膜过虑分装，置－20℃冰箱保存。(17)0.02%EDTA溶液：配制方法：①称取EDTA粉末0.02g。②量取D-Hanks至100ml，用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调PH值为7.2。③0.22um虑膜过虑分装，置4℃冰箱保存。(18)基础培养基RPMI-1640：配制方法：①取RPMI-1640粉剂一袋（10．4g）放入1000ml烧杯中。②加三蒸水至1000ml搅拌溶解。③称取NaHCO32.2g加入到已溶解的RPMI-1640的溶液中至溶解完。④用1moL/LNaOH或1moL/LHCl调PH值为7.20。⑤0．22um虑膜过虑分装，置4℃冰箱保存。(19)谷氨酰胺储存液（100MmL-Glutamine100x）：配制方法：①称取L-Glutamine1.462g入烧杯中。②加三蒸水100ml搅拌谷氨酰胺完全溶解，用0.22um滤膜过滤除菌后,1ml小量分装置－20℃冰箱储存。(20)培养液：配制方法：用干粉制备培养液的过程如下：①用石英玻璃蒸馏器烧出新鲜三蒸水。②加温水至15－30℃。③把干粉加入水中，搅拌使之溶解。④根据说明书要求加NaHCO3。⑤加新鲜三蒸水至终量。⑥用1mol/LHCL或1mol/LNaOH调PH7．2。⑦用0．22um的虑膜过滤除菌。放置4℃冰箱保存。(21)抗生素液：6配制方法：取青霉素1×10/甁、链霉素1g/瓶加入0.9%无菌的生理盐水50ml，4即可配制成青霉素浓度为2×10IU/ml，链霉素浓度为10mg/ml液体，无菌分装,-20℃保存，使用时稀释成青霉素工作浓度为100IU/ml、链霉素为100ug/ml。(22)RT-PCR试剂：配制方法：①75％乙醇：使用处理过的量筒量取75ml无水乙醇，加DEPC处理水至100ml，备用。②0.1％DEPC：按1：1000的体积比加DEPC于单蒸水中，充分混匀，静置过夜，可用于浸泡器械，高压灭菌后可用于配制液体。③1.5％琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖，放入三角锥瓶中，加少量DEPC水，微波炉加热至完全溶解，空气中冷却到60ºC，加入100ml的1×TAE溶液，振荡，混匀，加入7μlEB，混匀，插上梳子，倒入水平放置的制胶板中。④50×TAE：称取Tris242.2g，先用300ml单蒸水加热搅拌溶解后，57ml冰乙酸，加100ml500mmol/LEDTA(pH=8.0)，用冰乙酸调pH值到8.0，然后加单蒸水定容至1000ml。⑤10×MOPS的配制：称取4.18g的MOPS溶解于70ml灭菌的DEPC处理的水14万方数据 第一部分·研究内容与方法中，用2mol/L的NaOH调整pH值到7.0，加2mlDEPC处理的0.5MEDTA（pH=8.0），用DEPC处理的水将溶液的体积调整到100ml。(23)基因克隆实验试剂：TM2+①感受态细胞Stbl3：由广州复能基因有限公司提供；②2MMg母液：20.33gMgcl2·6H2O，24.65gMgSO4•7H2O，加蒸馏水至100ml，过滤灭菌，备用。③2M葡萄糖母液：18g葡萄糖，加蒸馏水至100ml，过滤灭菌，备用。④SOC培养基：2.0g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1ml1M的Nacl、0.25ml1MKcl，加入97ml的去离子水，高压灭菌备用；使用前加入Mg2+母液和葡萄糖母液，使两者的终浓度均为20mM。⑤磷酸盐缓冲液：2.31gKH2PO4,12.54gK2HPO4,溶解于100ml去离子水中，高压灭菌以备用。⑥含筛选抗生素固体TB培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml，溶解于900ml的去离子水中，高压灭菌以备用。使用前加入100ml磷酸盐缓冲液。⑦含筛选抗生素LB培养基：配制100ml培养基需要加入:胰化蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，NaCl1.0g，琼脂粉1.5g；用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至100ml。在15psi高压下蒸汽灭菌20min。一定要在温度降下之前加好抗固态LB培养基生素，并且倒好板。高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。⑧保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。1.2.1.2.5其他质粒小提试剂盒和去内毒素中提试剂盒都由Omega公司提供。见表1-1。表1-1HIV骨架的慢病毒载体的包装试剂盒：Table1-1HIVlentiviralvectorbackbonepackagingkit试剂盒成分试剂量储存条件HIV包装混合物100ul（0.5ug/ul）4-8℃（稳定保存6个月）eGFP阳性对照慢病毒载体25ul（0.06ug/ul）4-8℃（稳定保存6个月）病毒载体转染试剂500ul4-8℃（稳定保存12个月）病毒滴度增强剂500ul4-8℃（稳定保存12个月）聚凝胺：10mg/ml；增加转染效率；1.2.3实验步骤1.2.3.1Lv130HIV骨架慢病毒质粒载体DNA的转导：将慢病毒载体系统10ng加入到Stbl3TM感受态细胞100ul中冰浴30min，然后立马转移至预先设置好的42℃的水浴锅中热激60s，继续冰浴2min，加入400ul不15万方数据 新疆医科大学博士学位论文含抗生素SOC培养基，放置在摇床200rmp，摇动1h，然后使用接种环，蘸取菌液，划板后放入37℃培养箱培养过夜。第二天观察细菌生长情况，获取单克隆菌癍，用10ul枪头挑取将其打入5ml的含抗生素的液体LB中，放置与摇床上220rmp，摇菌12h。收集细菌准备下一步提取质粒载体DNA。1.2.3.2用E.Z.N.A®PlasmidMiniprepKitⅠ(100)行碱裂解法提取质粒载体DNA：收集细菌放入1.5ml的EP管中，碱裂解法提取质粒载体DNA。收集所抽提的DNA样品于1.5mlEP管中,置于-20℃冰箱保存。同时取少量样本去重点实验室利用分光光度仪测浓度以便设计酶切反应体系。同时电泳检测质粒小提情况。1.2.3.3慢病毒质粒载体DNA的限制性核酸内切酶酶切、电泳和凝胶回收：用BamHI和XhoI先后对碱裂解法抽提的质粒DNA样品进行酶切反应。根据酶的活性单位设计酶切反应体系。BamHI和XhoI酶切后置入PCR仪中37℃反应4h。结束后在90V电压下进行30min电泳实验。在紫外透射反射仪下切胶，用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0进行凝胶回收。1.2.3.4慢病毒质粒载体、与GDNF干扰片段酶切和连接：5'端克隆位点:BamHI,3'端克隆位点:EcoRI。发卡结构系列：TCAAGAG。shRNA片段及干扰位点见表GDNF4个干扰片段信息。见表1-2。表1-2GDNF4个干扰片段信息Table1-2GDNFshRNATargetSequencesCloneNameLocationLengthTargetSequenceagaaatagaaggctgHSH054954-1-HIVmU6(OS396544)41519gtgaccagaggattatcctgHSH054954-2-HIVmU6(OS258698)8219atcgcagtgcttcctagaaHSH054954-3-HIVmU6(OS258699)17219gagtgcgatgcagctgagaHSH054954-4-HIVmU6(OS258700)36719caa1.2.3.5有效干扰片段筛选：(1)PC12细胞培养传代、冻存和复苏细胞培养：PC12细胞:常规培养使用含10%胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)的DMEM培养基(含1.5mML-Glutamine,l00U/mlPenicillin,100μg/mlStreptomycin)16万方数据 第一部分·研究内容与方法o中，37C5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞传代：PC12细胞:在细胞生长旺盛，占瓶底70%-80%时，吸去培养液，PBS液洗细胞1-2次后加入1ml0.025%胰蛋白酶的消化，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，此时加入等体积的胰蛋白酶中止消化。加适量的细胞到新的培养瓶中。(1:4传代，传代期间2-3天更换培养液)。细胞的冻存：选用对数生长期、铺满瓶底80%左右细胞，在收集细胞24h前，换液一次。加入0.25%的胰酶消化l10-120s，然后中止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，移入离心管1000r/min离心10min，去上清，沉淀细胞中加入含10%胎牛血清6的DMEM培养基，调整细胞密度为5X10/ml。然后加入15%的甘油，混匀后用吸管00分装入无菌冻存管中(每管1.5m1)严密封口并作好标记，4C放置30-60min，-20C放置120min，将冻存管放入纱布小袋中移入-80℃过夜，次日将冻存管完全浸入液氮中。0细胞的复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37C水浴中快速摇动使其尽快融化。75%酒精擦拭消毒后，在超净台移入离心管(15ml装)中，补加11ml相应的培0养液(预热至37C，轻轻吹打使细胞悬浮，1000r/min离心10min，弃上清，加入l2ml相应的培养液，吹打均匀后移入培养瓶，放入培养箱中。24h后观察细胞生长情况，当细胞铺盖面积达60～70％以上开始转染。(2)实验分组：空白对照，单纯转染试剂组，空载体对照组，shRNA-1-GDNF（F1），shRNA-2-GDNF（F2），shRNA-3-GDNF（F3）和shRNA-4-GDNF（F4）。放入饱和湿度37℃，5％的CO2培养箱中培养6h。更换液体为10%小牛血清的高糖DMEM培养液，继续培养48h。倒掉培养液，提取RNA。吸取3µl分装于0.5ml的去RNA酶的管中，用于测RNA的浓度。逆转录合成cDNA，然后行RT-PCR，将PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，并在琼脂糖凝聚电泳后测定灰度值，并统计得出最有效的干扰片段。采用BIO-RAD凝胶成像系统进行凝胶成像。1.2.3.6Lv-shRNA-GDNF病毒包装(1)Lv-shRNA-GDNF重组体DNA的转导将Lv-shRNA-GDNF重组体10ng加入到Stbl3TM感受态细胞100ul中冰浴30min，然后立马转移至预先设置好的42℃的水浴锅中热激60s，继续冰浴2min，加入400ul不含抗生素SOC培养基，放置在摇床200rmp，摇动1h，然后使用接种环，蘸取菌液，划板后放入37℃培养箱培养过夜。第二天观察细菌生长情况，获取单克隆菌癍，用10ul枪头挑取将其打入5ml的含抗生素的液体LB中，放置与摇床上220rmp，摇菌12h。收集细菌准备下一步提取质粒载体DNA。(2)去内毒素质粒中提试验流程：17万方数据 新疆医科大学博士学位论文将小提剩余的1ml菌液加入到100mlAmp(+)的液体LB培养基中，继续37℃恒温摇床上摇菌14h用于中提。收集细菌，每管100ml，3200rmp/min离心20min，倒掉上清液。加入含有100ug/mlRnase的SolutionⅠ10ml，在漩涡器上混匀。加入10mlSolutionⅡ，轻轻地颠倒混匀。加入BufferN310ml，混匀后，-20℃静置10min，然后12000rmp/min离心10min，将上清液转移至新的50ml过滤柱中过滤，收集下清夜。加入等体积的ETRBindingBuffer；颠倒混匀后，加入到3硅胶柱中，12000rmp/min离心2min；将剩余的再次转移到硅胶柱中，12000rmp/min离心2min。每管加入3mlETRWashBuffer，12000rmp/min离心2min。每管加入3mlBufferEHB，12000rmp/min离心2min。每管加入3mlDNAWashBuffer，12000rmp/min离心2min。空甩12000rmp/min离心2min。最后将硅胶柱转移到新的EP管中，用Endonxin-FreeElutionBuffer溶解，每管40ul，室温静置5min后12000rmp/min离心2min；测浓度，-20℃冻存备用。(3)病毒包装和滴度的测定：①293Ta细胞株和HT1080细胞株的培养传代、冻存和复苏293Ta细胞株和HT1080细胞株的培养传代、冻存和复苏方法相同：细胞培养：含10%胎牛血清的DMEM培养基(1.5mML-Glutamine,100U/ml0Penicillin,100μg/mlStreptomycin)中，37C5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞传代：在细胞生长占瓶底80%-90%时，吸去培养液，PBS液洗细胞1-2次后，加入0.25%的胰酶，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时中止，此时加入等体积的胰蛋白酶中止消化。加适量的细胞到新的培养瓶中。(1：2-4传代，传代期间2-3天更换培养液)。细胞的冻存：选用对数生长期、铺满瓶底80%左右细胞，在收集细胞24h前，换液一次。加入0.25%的胰酶消化l10-120s，然后中止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，移入离心管1000r/min离心10min，去上清，沉淀细胞中加入含10%胎牛血清6的DMEM培养基，调整细胞密度为5X10/ml。然后加入15%的甘油，混匀后用吸管00分装入无菌冻存管中(每管1.5m1)严密封口并作好标记，4C放置30-60min，-20C放置120min，将冻存管放入纱布小袋中移入-80℃过夜，次日将冻存管完全浸入液氮中。0细胞的复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37C水浴中快速摇动使其尽快融化。75%酒精擦拭消毒后，在超净台移入离心管(15ml装)中，补加11ml相应的培0养液(预热至37C，轻轻吹打使细胞悬浮，1000r/min离心10min，弃上清，加入l2ml相应的培养液，吹打均匀后移入培养瓶，放入培养箱中。②复苏293Ta细胞株和HT1080细胞株接种到六孔板。观察细胞生长情况，如果293Ta细胞生长密度达到整个培养板60%时换成5%灭18万方数据 第一部分·研究内容与方法活血清无双抗的培养基。包装病毒：按照表3中比例进行准备。见表1-3。表1-3病毒包装所有各试剂体积表Table1-3Allthereagentsviralpackagingvolumetable培养板规格慢病毒质粒的混稀释重组质粒转染试剂稀释转染试剂合物Opti-MEM量Opti-MEM量六孔板1孔0.5ug表达质粒30ul3.0ul30ul+1ul的包装混合物稀释好后，在室温静置5min；然后将转染试剂的稀释体系成滴加入重组质粒的稀释体系当中，轻轻地晃动EP管使其混匀。室温孵育25min，然后将其加入到六孔板中，盖上盖子，轻轻地倾斜式混匀；放入37℃，5%CO2的培养箱培养12h。将原来5%灭活血清无双抗的培养基换为含10%胎牛血清和双抗的培养基1ml并同时加2.0ul的病毒滴度增强剂。放入37℃，5%CO2的培养箱继续培养48h。在倒置荧光显微镜下观察细胞的情况后可在生物安全柜里收集病毒。用移液器尽量吧所有的细胞都吹起来，然后收集到离心管中，500g/min离心10min。将上清液用0.45um的过滤器过滤。将传代的长满六孔板的80%的HT1080细胞，换为含有5ug/ml聚凝胺、5%胎牛血清和双抗的培养基2ml/孔。每孔10ul病毒，设一个为空白对照，不加病毒。加入病毒后，放入4℃冰箱放置2h；再转入37℃，5%CO2的培养箱培养12h。换为含10%胎牛血清和双抗的完全培养基，继续入37℃，5%CO2的培养箱培养48h。③图像采集：采用明场和荧光的二维重相，选取一个视野计算转染效率。转染效率（R）={细胞总数-荧光细胞总数}/细胞总数。更换视野，重复3-5次上述，然后求均值就是整体的转染效率。计算出荧光细胞的比例为R。1.2.3.7慢病毒滴度检测通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。消化每孔细胞，4进行细胞计数，计算出每孔细胞总数为M。滴度计算：T=RM×1ml/0.1ul=10RMTiter/ml。1.3质量控制(1)感受态细胞本身是一种细菌，而且是一种很脆弱的细菌，细菌的冻存和解冻遵循的原则：快冻慢融。(2)在准备载体的过程中重组体慢病毒载体10ng，加入到感受态细胞当中，用手指轻轻弹动以便于混匀；因为转导所需的重组体很少，避免浪费；同时由于感受态细19万方数据 新疆医科大学博士学位论文胞很脆弱，所以在混匀时避免用移液器吹打混匀。(3)质粒载体冰浴目的就是起到一个冷凝集的作用，让所有的重组体都均匀的凝集在感受态细胞的周围，即细胞壁上，为下一步热激做准备。在这一系列的冰浴热激冰浴的过程中，为了节省时间必须在实验一开始第一件事情就是将水浴锅设置到42℃开始工作；热激利用了两个原理：一、热胀冷缩原理：在加热时感受态细胞膨胀，细胞壁扩张，使得细胞壁上的被处理的孔的孔径增大，便于细胞外的物质进入细胞；二、分子热运动原理：在加热时，细胞外的重组体热运动加速，便于很快进入细胞内部。冰浴的原理热胀冷缩：原来膨胀的物体在受冷后，立马缩小，细胞壁上的孔径关闭，使进去的物质不在出来。(4)加入SOC培养基，放置在摇床200rmp，摇动1h；让感受态细胞自身修复的过程；同时启动重组体的复制。(5)使用接种环，蘸取菌液，划板时，板子与桌面成45°角，在酒精灯的上方，在超净台中进行；蘸取菌液后从一点划起，动作要轻，划到中间时，将接种环翻转，继续划板。划板结束后放入培养箱继续培养，需要注意在培养箱中放置要倒放。(6)包装病毒时，加入试剂的剂量的计算方法：1ul包装混合物的浓度是0.5ug/ul，再加上0.5ug的表达质粒，就是1ug；而转染试剂是3ul，所以遵循一个规律：表达质粒：包装混合物=1:1（质量比）；（表达质粒+包装混合物）：转染试剂=1:3（质量：体积）。稀释好的液体，一定是将转染试剂加入病毒质粒混合物中，顺序不能颠倒；动作要轻，成滴滴下，轻轻混匀。12h完全能够使表达质粒和包装混合物完全转染到细胞当中；时间太长，细胞暴露在转染试中，转染试剂本身有毒；同时opti-MEM是无血清的，营养成分低，会影响细胞的生长与存活。(7)收毒时，将所有细胞吹起来，细胞与细胞的间隙也是病毒躲藏的地方，吹起来便于病毒的回收；离心的目的：将细胞全部沉底，降低过滤的难度；其实在测定滴度的同时，如果需要做体外实验就应该接着做；因为病毒颗粒每解冻一次机会损失掉一半的病毒颗粒。这就需要将实验设计好，在收毒时就要现成的体外培养的准备转染的细胞生长到80%的密度，而且多个空，加不同体积的病毒颗粒。(8)接毒时，冰箱放置2h，目的就是靠冷凝集，让病毒更多地凝集在细胞表面，便于提高转染效率。37℃就相当于热激，既增加了病毒颗粒的热运动，也使得细胞热膨胀，便于病毒颗粒进入到细胞当中；在37℃中的时间不能超过12h，因为聚凝胺本身有毒，时间太长就会使细胞中毒而死亡。(9)选择细胞状态佳的293T细胞作为慢病毒包装用的细胞系。细胞的状态影响转染的效率，而转染效率的高低直接决定了慢病毒颗粒的产率。(10)铺细胞:在转染前24h，铺293T细胞，转染时细胞密度控制在80%左右。注意:铺细胞时可左右轻轻摇晃培养皿，以使细胞均匀分布在培养皿内。20万方数据 第一部分·研究内容与方法(11)胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应2+2+把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca、Mg和血清、2+2+蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca、Mg的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。(12)分装胰蛋白酶的量依据平时的实验的量做决定，如果用量不定，可以分装不同体积的胰蛋白酶，如25ml、13ml、6.5ml、3.2ml或者1ml；同时避免反复解冻，这样会降低胰蛋白酶消化效率。(13)细胞冻存时千万不能吹打，在倒置显微镜下观察细胞形态，如果呈圆形，立马终止消化。1.4统计方法应用ImageJ软件测量光密度，所测的光密度值/β-actin所得比值结果用于统计。采用SPSS11.0统计软件包对所测得的各基因与β-actin平均光密度的比值行t检验。结果以均数±标准差表示，P<0.05为有统计学差异。2结果2.1细胞源性的神经营养因子(GDNF)干扰片段的载体信息:产品编号：HSH054954-HIVmU6，载体大小：9027bp，原核筛选标记：Ampicillin，真核筛选标记：Puromycin；报告基因：mcherryFP。5'的克隆位点：BamHI，3'的克隆位点：EcoRI。发夹结构序列：TCAAGAG。见图神经胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）的载体信息。见图1-1,图1-2。2.2GDNF有效干扰片段的筛选：GDNF的干扰片段转染了PC12细胞后，提取mRNA并合成cDNA。然后行琼脂糖凝胶电泳，采集图片。并根据测定的灰度值，经SPSS统计软件分析，发现GDNF片段1与转染组比较P值为0.256，与对照组比较0.320,均大于0.05。GDNF片段2，片段3，片段4与转染组比较，P值分别为0.022,0.018,0.025，均小于0.05，有统计学意义。与对照组比较，P值分别为0.015,0.012,0.017，均小于0.05，有统计学意义。其中片段3的干扰效率更高，故GDNF的最有效干扰片段为F3。GDNF有效片段筛选的RT-PCR电泳结果见图1-3.2.3病毒包装、转染效率、滴度测定：使用筛选出来的F3片段包装病毒，48h后，开始收集伪病毒颗粒，在收毒之前使21万方数据 新疆医科大学博士学位论文用倒置荧光显微镜采集荧光图片。在293Ta细胞培养48h后，收毒，并将收的毒接种到HT1080细胞中，并且继续培养48h。培养实验及图片显示293Ta及HT1080细胞贴壁生长良好，细胞接种病毒成功。见图293Ta细胞、HT1080细胞包装结果。见图1-4.经过荧光细胞计数和明场细胞计数，计算病毒重组体的转染效率R值，结果为：RGDNF-HIV=0.87，RSH-GDNF-HIV=0.96。8利用转染效率R值，结合稀释倍数计算病毒滴度T值。结果为TGDNF-HIV=7.2x108pfu/ml，TSH-GDNF-HIV=1.74x10pfu/ml。图1-1psiHIV-GDNF-mchenryFP-U6重组体构建及干扰GDNF模式图Chart1-1ConstructionofpsiHIV-GDNF-mchenryFP-U6recombinationandmodepatternofGDNFinterference22万方数据 第一部分·结果图1-2神经胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）的载体信息Chart1-2VectorinformationofGDNF图1-3GDNF有效片段筛选的RT-PCR电泳结果Chart1-3ElectrophoresisresultofGDNFeffectivescreeningbyRT-PCRfragment注：（左到右泳道是：DL-2000marker、正常组，转染试剂组，片段1，片段2，片段3，片段4）。23万方数据 新疆医科大学博士学位论文图1-4293Ta细胞、HT1080细胞包装结果Chart1-4Resultsof293TapackagingcellsandHT1080cellstransfectedwithvirus注：一排为293Ta细胞病毒包装48h荧光照片、明场照片和合并照片，二排为HT1080细胞病毒包装48h荧光照片、明场照片和合并照片（200X）3讨论慢性疼痛的基因治疗成功与否取决于目的基因重组体的成功构建，这对于治疗研究十分重要。这部分包含三个要解决的问题：一是目的基因的合理选择，这是实验的核心。二是RNA干扰技术对目的基因表达的有效抑制。三是基因载体的选择，这决定了目的基因是否能顺利转入，并且能否持续作用，再者，是否会出现免疫反应或生物安全危险。我们的研究选择了GDNFshRNA与慢病毒共建重组体，结果显示重组体构建成功，筛选出来的干扰片段3对GDNF的表达干扰有效。病毒包装后在293Ta和HT1080细胞中贴壁生长良好，细胞接种病毒成功。重组体的转染效率高，获得的病毒滴度高。实验的成功与我们之前提到的三个要解决的问题密不可分，我们下面具体分析一下。3.1GDNF基因的选择本研究选用的胶质细胞源性神经营养因子是Lin等在1993年首先发现的。GDNF来源于神经胶质细胞或者是骨骼肌，广泛存在于中枢和外周神经系统，对多种神经元的发育、存活和再生有着强大的营养支持作用。近来研究表明，GDNF对初级传24万方数据 第一部分·结果入神经元具有营养和促进再生作用，而且与脊髓背角的伤害性感觉形成有关，因此在疼痛调节中也扮演着重要角色。哺乳动物神经元在胚胎期对致痛因子NGF的依赖在出生后部分的转向了GDNF。这些神经元发出无髓和细的有髓神经纤维投射到与[15,16]伤害性感受密切相关的脊髓背角的第II层。这暗示GDNF在成年后可能部分接替了致痛因子NGF的作用。在外周神经系统和脊髓，GDNF及其受体系统与P物质、[17,18]降钙素基因相关肤(CGRP)、钠离子通道等与痛觉感受密切相关的活性分子共存。GDNF对神经肽Y(NPY)、生长抑素(SOM)、钠离子通道等与痛觉感受密切相关的活[19-23]性分子的表达和功能都有调节作用。实验动物皮下注射弗氏佐剂诱导局部炎症或关节腔内注射弗氏佐剂诱发关节炎后，检测发现GDNFs家族成员ART,NTN的表达水平均有不同程度上调，GDNF在皮肤和DRG内的表达量也显著增加，同时GFRα在DRG内的表达水平也明显提高。动物皮下直接注射ART,NTN即可以产生一定程度的热痛过敏，但潜伏期较长。通过转基因技术使动物皮肤过表达GDNF后，其机械刺激阈值降低；敲除GDNFs受体如GFRa2基因的动物在皮下注射福尔马林后，炎症反应的程度和前期急性期不受影响，而急性期过后的疼痛持续期则显著缩短，这些实验结果支持了GDNFs能够促进炎性疼痛的产生和维持。进一步的研究发现，这种疼痛现象可能与炎症发生时产生的各种炎症介质相关。不同的是，在CCI所致的神经痛模型中GDNF能够显著缓解机械痛敏和辐射热所致的热过敏。实验研究表明，脊髓蛛网膜下腔给予外源性GDNF对25万方数据 新疆医科大学博士学位论文[24,25]大鼠神经痛有很强的镇痛作用，外源性给予GDNF或通过转基因技术使动物体内高表达GDNF都对神经痛有较好的缓解作用。结扎坐骨神经的鼠疼痛模型中鞘内给与GDNF后，可暂时逆转实验动物因神经损伤而致的痛阈降低，但这一逆转作用仅可维持2周，随后痛觉过敏将再次出现。说明GDNF对神经病理痛有一定的镇痛效果。进一步研究发现，GDNF是通过作用于未损伤侧DRG神经元的中枢端而发挥作用的。神经痛的研究表明，GDNF对一部分伤害性感受初级感觉神经元具有重要的营养、保护作用，并且可以翻转这些伤害性感受神经元在外周神经损伤后发生的[26]可塑性变化。GDNF在炎性痛或者神经痛的研究结果表明，GDNF是痛觉形成中的一种重要神经调质。目前GDNF在骨癌痛方面的研究尚未见报道，但依据上述研究结果推论：GDNF很可能参与了骨癌痛的疼痛调控。因此，我们选择GDNF作为骨癌痛研究的目的基因，借以探讨其在骨癌痛中的调控机制及可能的治疗方法。3.2RNA干扰RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是生物进化过程中存在的一种在转录后通过RNA调控基因表达的现象。广泛存在于植物、线虫以及果蝇等各种生物。2001年Tuchl等首次应用双链小分子干扰RNA（siRNA）在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，从而在世界范围内掀起了研究和应用RNA干扰技术的热潮。RNA干扰之所以能引起生物医学界几乎所有研究领域的广泛兴趣，是因为siRNA具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。RNA干扰是通过小干扰RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）作为效应分子催化与靶基因mRNA结合的级联反应而减少mRNA的含量，干扰目的基因的表达。SiRNA可以作为一种引物，在RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者在Dicer酶的作用下被裂解后又形成新的siRNA，新形成的siRNA，又进入上面的循环。这个过程称为随机降解多聚酶链反应，从反应特点来看，具有正反馈放大效应，因此，只要有少量的siRNA产生，既可导致靶mRNA的渐进性减少，出现基因沉默现象，也就是关闭了某个基因的功能。RNAi所致的基因沉默发生在转录水平，所以又被[27]称为转录后基因沉默（PTGS）。与抑制基因表达的传统工具，如反义寡核苷酸和核酶等比较，siRNA沉默基因表达的效率高达数十到数千倍，是基因工具的革命性改进。已经报道的dsRNA能阻断99.7%的细胞中调控细胞周期的关键基因CDK-2[28]的表达。2004年Dorn和2005年Tan等利用RNAi技术分别针对疼痛信号传递通路中P2X3嘌呤受体和NMDA受体2B亚基作了探索性的动物实验研究，结果证实[29,30]RNAi比ASO的镇痛作用更加有效。基因敲除技术相比，RNAi操作简单，而且具有高度特异性和高效性。它的识别可以精确到一个核昔酸，因此其治疗针对性强，副作用小。再者，RNA干扰属于转录后基因沉默，作用靶点是mRNA，26万方数据 第一部分·讨论既可避免基因改造可能带来的意想不到的后果。RNA干扰技术深入揭示了细胞内基因沉默的机制，作为阻断基因表达的新手段，RNA干扰已经广泛用于高通量基因功能研究、基因表达异常增高引起的疾病治疗等方面，并取得了较大的进展。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年小分子干扰RNA(siRNA)被《Science》杂志评为“年度分子”，RNA干扰技术则被评为“年度全球科学十大进展之冠”。后来的研究发现体外合成小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA))的实验方法费用昂贵、转移到细胞内的siRNA半衰期短、其本身不能持久性表达、而且对靶基因表达的抑制作用短暂。研究显示，siRNA注入大鼠细胞后2-3天RNAi作用最显著，靶mRNA浓度在此之后很快恢复到注射siRNA之前的水平[31]。这使得裸siRNA的应用受到很大限制。学者们进一步研究发现小发卡状RNA(smallhairpinRNA,shRNA)载体导入细胞后，能在细胞内稳定地转录生成shRNA，这种shRNA实际上是一种具有发夹结构的siRNA分子，经进一步加工后生成靶基因特异性siRNA，可发挥长期抑制靶基因表达的作用。本研究中也是采用shRNA实现了目的基因GDNF的高效抑制，与对照组相比差异具有统计学意义。3.3慢病毒载体的选择基因治疗中载体是一种非常重要、得力的工具，学者眼里理想的载体：一个理想的载体应该有理想的基因载体则应具备:(1)平稳的组织特异性而不会诱发宿主免疫反应;(2)高度稳定，易制备;(3)安全性高，无毒无害;(4)有利于基因高[32]效转移和长期表达;(5)容量大，易人工合成，缺乏自动复制能力。但是，理想不是现实，现有的载体或多或少的存在一定缺陷。研究人员需要了解每种载[33]体的特性，依据自己实验的需求选择相对合适的载体。不仅要考虑转移外源基因的大小;还要考虑转染对象是有丝分裂活性细胞(如神经胶质细胞)或有丝分裂后期的细胞(如神经细胞);以及治疗调控需要预计的间期。一般的，基因转运载体分为病毒载体和非病毒载体。有研究报道非病毒载体——脂质体可用于GDNF的转染。脂质体作为基因载体优点是：脂质体可以降解，无细胞毒性及免疫源性；缺点是仅对刚接种的神经元转染效果好，转染率较低，且不稳定，[34]持续表达时间短。相比较而言，病毒载体的适用范围、转染效率和稳定性都更有优势，也逐渐成为基因转运载体的首要选择。常见的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等等。每种病毒载体各有其不同特点。①腺病毒(adenovirus)载体:腺病毒属于双链DNA病毒，优点是能感染分裂和非分裂细胞，高滴度制备容易，感染效率高，可插入的目的基因容量大，安全性好，更适合在体外实验中作为神经元的瞬时表达载体，用以研究基27万方数据 新疆医科大学博士学位论文因在神经细胞中的功能，其优点是简便、快捷、高效。腺病毒载体也有缺点，由于腺病毒载体感染谱广，所以其靶向性较差；重组腺病毒载体在体内表达的时间短，一般的仅4-6周，需要重复给药；由于免疫原性较强，重复给药可诱[35,36]发机体的免疫清除。②腺相关病毒(AAV):属微小病毒科，优点是有效整合宿主细胞染色体，可同时表达多个目的基因，免疫反应轻，转基因表达时间可长达6个月以上。但由于腺病毒的插入区小，最大只能插入4-5kb的片段，制备时需要辅助病毒，易含野毒，且高滴度制备困难，整合基因可能导致宿主基因突变从而引起癌变，因此，从安全性方面还需进一步研究。③单纯疱疹病毒该[37]病毒对神经细胞敏感，非常适用于神经系统疾病的基因治疗。其扩增子载体系统的优点是载体的构建较快，且每一病毒颗粒均含有多个表达盒的拷贝，从而可获得高水平的表达。但它还面临不能无限增殖、毒性问题的缺点。此载体目前还需要进行减弱毒性，改进辅助系统，增强滴度的处理。④逆转录病毒((retrovirus,RTV):最早应用于临床治疗的病毒，用于腺苷脱氨酶缺乏导致的先天性免疫缺陷病人。研究发现，逆转录病毒整合是随机的，不能做到定点整合，有可能受到基因组的干扰而出现转染沉默现象。由于没有理想的病毒载体，学者们一直在努力探索，慢病毒载体年研究的热点问题。相比较其他病毒载体，慢病毒(Lentiviral,LV)作为载体有一定优势，但仍有不足，并且在不停的改造之中。慢病毒是逆转录病毒科(Retrovidae)的一员，目前最常用的是人类免疫缺陷病毒(HIV)。研究表明，gag,pol和env3个与常见逆转录病毒相似的基因结构[38,39]和vif,vpr,nef,vpu4个辅助基因，以及2个调节基因tat和rev共同构成了慢病毒基因。早期，研究人员依据HIV-1为基础构建了二质粒表达系统组成的首个慢病毒载体系统。实验表明该慢病毒载体系统使用中最严重的问题是HIV-1病毒可能在机体转染时出现复制现象。为了改进载体的生物安全性，学者们研制出了三质粒慢病毒转染系统。三质粒慢病毒转染系统将载体被分割为包装质粒，包膜质粒及载体质粒3部分，这种分割方法使得质粒间发生重叠的几率显著下降，可有效降低病毒出现不可控的意外复制可能。随着基因技术的成熟和发展，三质粒慢病毒转染系统也在学者们的努力下发生了逐步的进化。[40,41第一代三质粒慢病毒载体系统]在二质粒表达系统的基础上删除了所有顺式作用元件，除Env外的病毒蛋白的表达均可借助强启动子CMV或者U6的作用完成；同时为了扩大慢病毒载体的感染谱，引入疱疹性口炎病毒G糖蛋白代替Env基因，该系统的特点是转染效率高，滴度高。随后，学者们又推出了以[42]自身失活为特点的第二代慢病毒载体系统，载体系统的安全性较前再次改[43]善。近年，学者们又推出了具有调控功能的第三代慢病毒载体系统。该系统增加了四环素可诱导系统，不仅可以主动调控基因表达，而且具有自身失活的28万方数据 第一部分·讨论安全特性。慢病毒载体(lentiviralvector,LVs)能够利用逆转录酶和整合酶，将自身的RNA转变为DNA整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。慢病毒载体系统最显著的优点是既可以感染分裂期细胞又能感染非分裂期细胞。逆转录病毒载体不能感染非分裂期细胞。腺病毒和腺相关病毒载体虽然具有感染非分裂期细胞的能力，但容易引起炎症和毒性反应。慢病毒宽泛的感染谱使其更适用于神经系统相关的研究。有丝分裂后神经元可因此获得整合外源性目的基因的机会，也就是转基因治疗的可能性。目前，慢病毒RNA干扰技术在帕金森病这种难治性神经系统疾病的研究中均有应用并取得了一定的效果。其次，慢病毒载体系统没有明显的免疫反应。再者，第三代三质粒载体系统病毒突变和产生有复制能力的病毒机率小。而且，慢病毒载体系统可以兼容多个转录启动子，转录多个目的序列片段。最后，慢病毒载体系统能够容纳相大的转移基因序列。慢病毒经过改建后可以容纳10Kb左右的外源基因片段，因此应用范围更加广泛。上述这些优点表[44,45]明慢病毒载体系统是目前神经系统基因治疗中最接近理想载体的选择。有[46]研究证明，将基于目的基因CD8和P53构建的慢病毒RNA干扰重组体转染受精卵制备的转基因小鼠，观察到目的基因CD8和P53在小鼠体内靶器官表达的显著下调。此外，有学者发现慢病毒载体与其他逆转录病毒和腺病毒载体相比，转染中枢神经系统时能长期保持更高的目的基因表达水平且不伴有免疫反应。目的基因shRNA与慢病毒构建的重组体，具有所用慢病毒载体的优势，一是能感染分裂期细胞而且能感染非分裂期细胞；二是靶向性好，能有效将外源性目的基因有效地整合到宿主染色体上，产生长久的shRNA效应，达到下调目的基因的目的；三是慢病毒重组体经浓缩后显著改善目的基因的转染效率[47][48]。四是该载体生物安全性高，产生具复制能力的野生病毒株和引起免疫原性的可能性很小。综上，我们在研究中选择了更广谱更高效更适合于神经系统研究的第三代三质粒慢病毒载体系统。实验结果证明，RNA干扰技术可以有效抑制GDNF的表达，慢病毒载体可以保障重组体的高效转染，获得高而稳定的病毒滴度，为后续的治疗研究奠定了坚实的基础保障。GDNFRNA干扰效果则在本研究的第三部分中WesternBlot中得到再次验证。该重组体在后面的研究里证实对GDNF表达水平显著抑制，同时GDNFRNAi的导入对骨癌痛治疗有效。29万方数据 新疆医科大学博士学位论文小结4.1本实验成功构建了GDNFshRNA慢病毒重组体，并转染至HT1080细胞得到表达。4.2实验对GDNF有效片段进行筛选，RT-PCR电泳结果显示GDNF片段3的干扰效率更高，与转染组、对照组比较，P值均小于0.05。4.3GDNF有效片段F3包装病毒的倒置荧光显微镜采图显示有效片段在293Ta细胞和HT1080细胞中均生长良好，细胞接种病毒成功。重组体转染效率高达96%，8病毒滴度在10pfu/ml水平。30万方数据 第一部分·小结第二部分大鼠胫骨骨癌痛模型的建立及评价随着医学科学的发展，癌症患者带瘤生存的时间越来越长，越来越多的患者出现了癌性疼痛。研究表明带痛生存的癌症患者生活质量与无痛生存的癌症患者相比差异具有统计学意义。骨癌痛的形成因素复杂，机制尚不明确，有着不同于炎性痛和神经性疼痛的特点，属于一种特殊的疼痛，长期以来一直没有建立合适可靠的动物模型。也正是因为这一点，学者们对骨癌痛机制的研究就显得举步维艰。直到1999年Schwei等首次报道了一种小鼠股骨癌痛模型，2002年Medhurst等建立了一种大鼠胫骨癌痛模型，并且从疼痛行为学、形态学、临床治疗方式等多方面验证证实其可靠性，骨癌痛才有了世界范围内认可的动物模型。模型的建立为骨癌痛的机制和治疗研究奠定了良好的基础。由于大鼠较小鼠生命周期长，接种癌细胞后的存活更久，模型稳定性更好，不易发生病理性骨折，更有利于进一步的研究观察，所以本研究选用Medhurst大鼠胫骨骨癌痛模型。模型复制后，采用自身对照的方法比较其建立模型前后机械痛阈和热痛阈的变化，观察其胫骨X线摄片、HE染色切片有无骨损害的发生，来评价检验骨癌痛模型建立是否成功。本研究旨在为后续的骨癌痛机制的探讨和生物治疗奠定基础。1研究内容与方法1.1研究对象1.1.1实验动物清洁级雌性SD大鼠，250-300g，由四川大学动物实验中心提供，避光转运至成o都市高新区四川大学转化医学中心，实验大鼠饲养在环境温度20士5C、24小时昼夜节律、避强光、无噪音刺激的环境中，适应环境三天后进行实验，以排除应激干扰的影响。期间动物可自由进食，进水。按国际实验动物使用准则处理。1.1.2肿瘤细胞株实验选用大鼠同源的乳腺癌细胞株MRMT-1，MRMT-1细胞株购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.2内容与方法1.2.1主要仪器SW-200光热尾痛测试仪：购自北京渠道科学器材有限公司57215UgoBasile足底测痛仪：购自北京渠道科学器材有限公司倒置显微镜：德国LEICA（DMI6000B）自动组织包埋机(ZMN-7803)：常州市华利电子公司31万方数据 新疆医科大学博士学位论文电热恒温水浴箱：姜堰市新康医疗器械有限公司恒温干燥箱：(进口)日本微波炉：格兰仕冰箱(BCD-203)：容声公司光学显微镜(BX41TF)：(进口)日本OLYMPUS组织切片机(Leica2135、2145)：(进口)德国微量进样器(5ul)：宁波市镇海玻璃仪器厂移液器(50ul)：上海求精生化试剂仪器有限公司无菌操作台：苏州亿达净化实验室设备有限公司（SW-ST-2FD）无菌手术器械一套1.2.2主要试剂75%酒精；0.01MPBS；0.9%生理盐水；无菌骨蜡；4%多聚甲醛-PB固定液；10%,20%,30%的蔗糖；冰冻切片包埋剂；切片保护剂，10%水合氯醛。1.2.3实验步骤1.2.2.1体外大鼠乳腺癌细胞株MRMT-1培养MRMT-1细胞复苏：(1)将预热的培养液放到台子上；(2)穿好无菌手术衣，带好手套、口罩、帽子，酒精消毒手套；(3)撕开无菌六孔板包装，放入台子上，并从饭盒内取出15ml离心管放到架子上；(4)撕去培养液的封口膜，酒精擦拭瓶口，过火，在离管中加入9ml培养液；(5)培养液瓶口及瓶塞过火，并盖好；(6)从-150℃冰箱中取出装有要复苏的细胞293Ta的冻存管，插入漂板，在37℃水浴锅中游走晃动，将其迅速解冻；(7)将解冻的细胞放到台子上，酒精消毒双手，用酒精棉球擦拭冻存管的管口部位，过火，将瓶盖打开，过火，将冻存的含细胞的15％的甘油的培养液吸出，加入含有9ml培养液的15ml离管中，马上离心，1000rmp，离心10min，去上清；(8)再向其中加入12ml新的培养基（血清为gecbo公司的澳洲源血清），混匀后，接种到培养板中；并在倒置显微镜下观察；(9)放入37℃、5%CO2培养箱培养进行培养。MRMT-1细胞传代：(1)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，发现细胞已经占据整个培养板每孔的80%～90%，开始传代；(2)准备实验所需要的酒精和酒精棉球，并将使用的培养液放入培养箱预热；(3)紫外灯消毒试验台30min；32万方数据 第二部分·研究内容与方法(4)戴帽子、口罩，并穿上隔离衣，戴手套；将打包消毒的枪头盒和EP管放入超净台，准备开始传代；(5)将要冻存的细胞培养板和预热的培养液从培养箱中取出，放进刚喷洒酒精的超净台上，用酒精擦手消毒；(6)去掉盛有培养液的瓶子口的封口膜，用酒精棉球擦瓶口和瓶盖的连接处，酒精灯外焰过火，放在酒精灯左侧；(7)揭开培养板盖朝下放置，拿起培养板，与超净台平面成45°角，用移液枪贴住每个培养孔下边吸取培养液丢弃，用PBS冲洗1次，去掉PBS,加0.25%胰酶消化，刚好覆盖过细胞为止，盖上盖子，室温消化2-3min；(8)用带血清的培养液终止消化，开始轻轻吹打，使贴壁的细胞悬浮起来；(9)收集到离心管中，离心细胞，1000r/minx10mim；(10)去掉培养基，加入新的培养基12ml，制成细胞悬液,进行细胞计数；5(11)将细胞悬液稀释至2x10个／ml的细胞密度进行接种；(12)置入37℃、5%CO2的培养箱进行培养。1.2.2.2骨癌痛模型的复制：参考Medhurst等报道的方法，建立大鼠骨癌痛模型。(1)选择清洁级成年雌性SD大鼠20只，随机分为两组，假手术组（Sham组）和骨癌痛模型组（实验组）。(2)腹腔注射3.6%水合氯醛1ml/100g，麻醉起效后，取仰卧位固定。(3)左侧后肢剪毛，皮肤用碘伏消毒，铺无菌洞巾。(4)在胫骨上段(膝关节下约5mm)皮下组织最薄处切开1cm小口，推开皮下组织，小心暴露胫骨。(5)用10ml注射器针头分开局部骨膜，垂直于术区胫骨骨面钻孔，以食指托住胫骨对抗钻孔用力，尽量保持后肢膝关节屈曲功能位，避免牵拉，有突破感提示己进入骨髓腔。(6)用10μl注射器进入骨髓腔，缓慢注入3μl含3x103个MRMT-1大鼠乳腺癌细胞，注射完毕后用无菌骨蜡仔细封住针孔。假手术组注入等量生理盐水。(7)生理盐水清洗创口，皮肤缝合。(8)术后抗感染治疗。1.2.2.3骨癌痛模型的评价：评估大鼠不同时期的疼痛行为学（术前一天、术后一周每周温痛觉检查，至术后4周）、局部组织学、影像学改变（术后四周取材做胫骨X线及HE染色），以确保模型复制成功。在成都市高新区四川大学转化医学中心测试大鼠下肢机械压痛觉和尾部温热痛33万方数据 新疆医科大学博士学位论文觉阈值，实验过程中保持室内安静。(1)大鼠机械痛觉检测：足底测痛仪检测砝码为20g，标尺刻度0-25，压爪重量=标尺刻度x20g，大鼠左右下肢分开测定，测定时将其左侧下肢掌中部放在平台上，然后开始测定，缓慢移动测试标杆直至压力达到一定阈值时大鼠将其下肢抽回，记录此时的标尺刻度，共测4次，次与次之间相隔1min以上，第一次数据不计，后3次数据求其均值。(2)大鼠热痛觉检测：将光热尾痛测试仪红外灯强度设为80，时间阈值为22s，每只大鼠放入固定器后不能立即进行热痛觉检测，常规先让其安静1min左右然后开始检测，测定时将大鼠尾部后1/3处放在红外灯处，按开始键后，时间开始计时，当热刺激到一定阈值时大鼠尾巴摆动，离开红外灯处，计时立即停止，读取此时的时间。共测4次，次与次之间相隔1min以上，第一次数据不计，后3次数据求其均值。1.3质量控制(1)细胞培养过程要严格无菌操作，在超净工作台上完成实验操作，这对于细胞的复苏和传代十分重要。(2)大鼠手术操作中去毛、无菌操作和术后抗感染对于模型的建立是必不可少的。要绝对杜绝术后手术部位的感染，如果手术部位出现炎性感染，会出现炎性痛，严重干扰正常结果。(3)胫骨钻孔时，尽量将选择皮下组织和肌肉少的部位钻孔，将皮下组织、骨膜与穿刺部分骨面分离完全，避免软组织夹入钻孔中。如果皮下组织和肌肉过多，在分离和暴露的过程中损伤严重，会产生疼痛，干扰正常结果。(4)穿刺时一定要垂直骨面，尽量减少对胫骨骨质的破坏，否则易胫骨的抗压能力受损，容易发生穿刺处骨折。(5)术后的必须仔细进行无菌骨蜡密封，以防肿瘤细胞自穿孔处外逸。骨髓腔内压力增高是形成骨癌痛的原因之一，肿瘤的外向生长，减轻了骨髓腔内压，缓解了疼痛，不利于实验的检测。(6)痛阈水平检测属于感觉检测，易受外界因素干扰，所以进行行为学测痛检查时，一定要保持环境安静，并且给大鼠一定时间适应检测所处的环境，以保证检测制的稳定性。(7)组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。组织标本离体后30min内应进人固定液或低温保存，最佳的固定液应该是中性福尔马林，固定时间为12-24小时。中性福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩小，无论是对HE切片还是免疫组化都是最好的固定液。1.4统计方法采用SPSS11.0统计软件分析，疼痛行为学评分数据以均数士标准差表示，各组34万方数据 第二部分·研究内容与方法间比较采用单因素方差分析，组内不同时间点的比较采用重复测量资料的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。2结果胫骨接种MRMT-1细胞株术后14天可见大部分大鼠术侧后肢出现轻至中度肿胀，肿瘤生长良好。结合疼痛行为学检测和影像学检测发现无骨质破坏性生长的大鼠2只予以剔除，有肿瘤生长，但疼痛行为学检测术前与术后7d时差别无统计学意义的大鼠2只予以剔除。发生恶液质死亡的大鼠1只予以剔除。致瘤率75%。2.1疼痛行为学检测结果：假手术组大鼠与骨癌痛组大鼠术前机械痛缩爪阈值无差异（P>0.05），假手术组大鼠术后7d、14d、21d、28d与术前机械痛缩爪阈值相比略呈下降趋势，但无统计学意义（P>0.05）。骨癌痛组大鼠术后7d、14d、21d、28d与术前相比下降显著，有统计学差异（P<0.05），与同时间假手术组相比也明显下降，有统计学差异（P<0.05）。骨癌痛组大鼠在术后14天时出现手术对侧疼痛。大鼠光热甩尾阈值呈现相同的变化趋势。见图2-1,2-2.数据均为实验条件适宜情况下每个项目测3次，间隔至少1min以上。根据检测结果可以认为骨癌痛组大鼠出现了痛觉敏感。2.2影像学检测结果:放射学研究大鼠胫骨X线片显示，大鼠术侧胫骨呈现显著的骨质破坏，骨破坏的程度与病程长短呈现正相关，病程长者骨质破坏的程度较病程短者显著。造模第7天的X线片变化不明显；造模第14天，X线示松质骨骨质出现缺损病灶，同时骨皮质有缺损病灶，到第28天，骨破坏进一步加重，骨皮质完全缺失，病灶范围加大。而假手术组胫骨X线照片未显示明显的骨质破坏。图2-3为大鼠下肢胫骨平台处X线片，显示下肢胫骨平台处局部骨质密度减低、骨小梁稀疏、正常骨结构消失，单侧骨皮质缺失。2.2组织学观察结果:图2-4为骨癌痛大鼠胫骨石蜡切片、苏木精-伊红染色显示,造模大鼠骨髓腔有异物巨细胞（白色箭头）及大量破骨细胞（黑色箭头）。35万方数据 新疆医科大学博士学位论文图2-1两组大鼠术侧机械痛缩爪阈值比较Chart2-1Mechanicalhyperalgesiabetweenbonecancerpainandshamgroup注：假手术组大鼠术后7d、14d、21d、28d与术前机械痛缩爪阈值相比差异无统计学意义（P>0.05）。*：骨癌痛组大鼠术后各时点与术前相比下降显著，有统计学差异（P<0.05），#：与同时间假手术组相比也明显下降，有统计学差异（P<0.05）。图2-2两组大鼠热痛甩尾阈值比较Chart2-2Thermalhyperalgesiabetweenbonecancerpainandshamgroup注：假手术组大鼠术后7d、14d、21d、28d与术前热痛甩尾阈值相比差异无统计学意义（P>0.05）。*：骨癌痛组大鼠术后各时点均与术前相比下降显著，有统计学差异（P<0.05），#：两组间同时间相比也明显下降，有统计学差异（P<0.05）。36万方数据 第二部分·结果图2-3骨癌痛大鼠下肢胫骨平台处X线片Chart2-3X-rayfilmofhindlimbtibialplateauinbonecancerpainrats注：图示为大鼠下肢胫骨平台处X线片，显示下肢胫骨平台处局部骨质密度减低、骨小梁稀疏、正常骨结构消失，单侧骨皮质缺失。图2-4骨癌痛大鼠胫骨HE染色（200x）切片Chart2-4HEsteinphotooftibialplateauinbonecancerpainrats图示为骨癌痛大鼠胫骨石蜡切片、苏木精-伊红染色显示,造模大鼠骨髓腔有异物巨细胞（白色箭头）及大量破骨细胞（黑色箭头）。37万方数据 新疆医科大学博士学位论文3讨论本实验大鼠胫骨注射了MRMT-1乳腺癌细胞株后大部分大鼠出现了骨癌痛的征象，痛行为学检测出现了相应的改变。测试结果显示骨癌痛组大鼠术后各时点机械痛缩爪阈值与术前相比均下降；骨癌痛组大鼠术后各时点机械痛缩爪阈值与同时间假手术组相比也明显下降。假手术组大鼠术前与术后与骨癌痛组大鼠术前机械痛缩爪阈值相比均无差异。大鼠光热甩尾阈值呈现相同的变化趋势。大鼠胫骨X线片显示，大鼠肿瘤细胞注射侧胫骨出现明显的骨质破坏，骨破坏的程度与病程长短呈现正相关，病程长者骨质破坏的程度较病程短者显著。先是松质骨骨质出现小的缺损病灶，而后骨皮质有缺损病灶，之后病灶范围加大，可见骨质密度减低、骨小梁稀疏、正常骨结构消失，骨皮质缺失。骨癌痛大鼠胫骨石蜡切片、苏木精-伊红染色显示,造模大鼠骨髓腔有异物巨细胞及大量破骨细胞。上述结果显示，实验大鼠不仅出现了骨质破坏而且出现了显著的疼痛行为学改变，可以说复制乳腺癌致胫骨骨癌痛的大鼠模型成功，可用于后期的治疗研究。3.1癌痛的现状随着医学的发展，带瘤生存的晚期癌症患者在逐年增加，现有的数据表明，有70-90%的晚期肿瘤患者有严重疼痛症状，癌痛严重影响到了他们的生活质量[49]，甚至可能使患者放弃治疗。面对癌痛，目前的临床治疗手段有限。药物为主、化疗、放疗、介入、神经阻滞以及破坏为辅的综合性治疗手段只能在一定程度、一定范围内暂时解决疼痛症状，而且伴随着各种各样的药物副作用以及侵入性治疗的风险。不久，随着药效的衰减、疾病的进展，癌痛还会再次卷土重来，而且变得越发难以控制。癌痛不仅包括肿瘤引起的疼痛，还包括治疗引发的疼痛。前者的典型代表就是骨癌痛，也是癌痛中高发常见的类型。后者的常见代表是以化疗相关的周围神经病变，患者往往表现出不同程度的疼痛，这种症状在化疗结束后仍可能持续。此外，手术、放疗也会引起癌痛。目前已有针对这种患者建立的动物模型，如①紫杉醇相关的周围神经病变模型：临床症状以外周神经毒性更常见，肢端末梢出现麻木、刺痛、烧灼样的感觉异常，严重者可出现急性脑病。研究认为，轴突微管动力不足或者破坏引发的细胞分裂中断、细胞凋亡启动是紫杉醇引发外周神经病变的可能机制。②顺铂相关的周围神经病变模型：研究表明，顺铂可做为伤害性刺激引起模型动物脊髓背角表层存在免疫反应性P物质的显著增多，同时可见DRG出现大面积细胞凋亡，凋亡可被神经生长因子逆转。③长春新碱相关的周围神经病变模型：应用长春新碱引起的神经病变的患者首发症状多为感觉异常，感觉敏化次之。研究显示坐骨神经和腰段背根神经节处巨噬细胞数目增多和IL-6表达上调很可能参与了长38万方数据 第二部分·讨论春新碱相关痛觉敏化的形成。上述模型对于研究化疗引发的外周神经痛的机制和治疗都有着十分重要的意义，可能为临床治疗带来新的指导方案。事实上，骨癌痛是癌痛中最常见的类型，也是肿瘤发生骨转移时最常见的症状之一。约三分之一的晚期癌症病人都会发生骨转移，引起骨转移的常见肿瘤有乳腺癌(65%-75%)、前列腺癌(65%-75%)、甲状腺癌(60%)、膀胱癌(40%)、肺癌(30%-40%)、[50]肾癌(20%-25%)和恶性黑色素瘤((14%-45%)等。解决这一社会问题迫在眉睫，但是由于骨癌痛机制的复杂性，学者们至今尚未找到有效的治疗途径。于是，研究人员将目光转向了基因治疗。基因治疗是一项较新的事物，其功效和风险都存在许多未知性，必须要经过多次实验室验证才能进行临床试验。实验室研究的前提是建立可靠的骨癌痛动物模型。如果模型与临床差距太大，其实验结果也就失去了意义。综上，探讨骨癌痛机制的前提是骨癌痛模型的建立。3.2癌痛动物模型的选择骨癌痛形成的成分十分复杂，与临床上常见的炎性痛和神经痛不同，有其独特的机制。首先，骨癌痛多见于恶性肿瘤的骨转移和原发于骨组织的肿瘤生长。其疼痛成因与溶骨、骨质破坏相关，调节骨代谢的药物双磷酸盐、骨保护素等可以改善症状。这一点与其他性质的疼痛完全不同。但是，临床上还有一个现象广泛存在，有骨损害不等于有疼痛。理论上来说，骨癌痛应该是由骨质的破坏引起的，两者应该存在必然联系。事实上，骨破坏与患者的疼痛症状并非100%匹配，也就是说并非所有的骨破坏患者均有疼痛。关于骨癌痛的临床观察显示并非所有恶性肿瘤引发骨转移或者原发骨肿瘤的患者均有疼痛表现，相当一部分患者仅在医院行CT及ECT影像学及核素检查过程中发现有骨质破坏存在，自己并无疼痛及不适的自觉症状。部分患者甚至以疼痛为首发症状，检查后发现骨转移存在，然后再追溯寻找原发肿瘤的来源。也有研究显示，骨转移晚期的患者癌痛发生几率显著升高，甚至可达95%。我们推测这种疼痛可能与骨质破坏范围和程度相关、或者周围神经受侵情况相关。关于这一点我们假设骨破坏与骨癌痛之间的关系可以类比腔隙性脑梗与脑梗后的肢体、语言障碍或者精神异样等后遗症之间的关系。腔隙性脑梗塞不断复发，最终难免会出现严重的并发症。由于早期骨转移患者可能不伴有疼痛症状，依据骨癌痛患者的这一特点，骨损害的形态学改变和疼痛行为学改变的共同存在也就成了评价骨癌痛动物模型成功与否的标准，两者缺一不可。其次，骨癌痛在临床症状上也表现出其独自的特点：持续的[51-53]进行性的背景痛、暴发痛、痛觉敏化。阿片类镇痛药多能有效控制背景痛，但对暴发痛往往不能奏效。患者对镇痛药的需求远远大于炎性痛和神经痛，而且治疗效果的药物依从性较差。再者，骨癌痛的发生与肿瘤细胞相关。接种同种不同亚型的肿瘤细胞，可能出现不同的临床症状，表现出不同的骨侵犯力，39万方数据 新疆医科大学博士学位论文不同的癌痛性质以及不同的脊髓神经化学物质变化趋势，说明骨癌痛不单是由于骨髓腔内的肿瘤的生长压迫所引起的，不同肿瘤的生物特性等很可能也参与了骨癌痛发生和维持。鉴于上述种种特性，建立一个可用的动物模型有一定难度。早期，考虑到骨转移多经血运形成，有人提出采用静脉注射的办法将肿瘤细胞注入动物体内来建立模型。实验结果显示，大鼠在成模的过程中出现很大的不确定性，各实验动物之间差别迥异。肿瘤可能出现在大鼠的任意部位，但是对骨组织的侵犯却很少，同时实验大鼠死亡率很高。由于不能将肿瘤形成的不确定性，大鼠的症状亦是千差万别，无法进行统一的实验研究。再者，这一模型的出发点也遭到了质疑。患者的肿瘤源于原发病变处，通过循环系统源源不断的播散。而模型大鼠没有原发病灶，直接静脉注射，不符合发病规律。后来，有学者提出了将肿瘤细胞注射入动物骨髓腔内(如股骨，胫骨，跟骨等)，引起局限性的骨组织的破坏和痛觉敏化来模仿肿瘤引发的骨转移。1999年美国学者Schiwei等首次发现这种办法并建立了小鼠股骨癌症痛模型；随后，2002年英国学者Medhurst等建立了大鼠胫骨癌症痛模型。一般的，癌细胞种植后两周左右动物出现痛觉超敏和痛觉异常，这些疼痛行为可以为阿片类镇痛药所逆转。试验后期，放射学和组织学检查可发现肿瘤造模的患侧肢体生长，但未见远处播散。局部骨转移模型的实验动物之间病情差别不大，稳定性和可比性较好，有利于进一步的深入研究。随后的大量实验结果证明，学者们使用多种肿瘤[54]细胞系，如乳腺癌细胞，前列腺癌细胞，纤维肉瘤细胞和黑素瘤细胞等在大/小鼠[55][56][57]股骨、肱骨或者跟骨骨腔内接种同源肿瘤细胞，都获得了可喜的成功。另有学者报道，小鼠模型复制周期较短生长快，易发生病理性骨折，疼痛行为[58]学检测比较困难，大鼠胫骨骨癌痛模型更有利于进行骨癌痛的研究。研究证明，局部骨转移模型体现了人类骨癌痛所表现的持续性背景疼痛、痛觉过敏。暴发疼往往来去迅速，发生没有肯定的时间，研究有一定难度。即使动物出现了暴发性疼痛，研究者也不能及时发现，试验中疼痛行为学的检测属于间断性测量，往往不能捕捉这一现象，或者说对动物尚且没有统一的标准，因而还需要深一步的探讨。影像学和病理学检查发现实验大鼠出现时间相关的骨损害改变，多数为虫蚀样破坏，偶有少量骨质新生改变，这与人类的临床观察结果相似。总之，局部骨转移模型很好的模拟了人类疼痛行为学改变、骨损害等主要临床变化。阿片类镇痛药和双磷酸盐等用于治疗人类和骨癌痛动物模型显示镇痛有效。局部骨转移模型因而为广大学者所接受，也是目前研究骨癌痛的经典模型。目前许多关于骨癌痛的机制与治疗的研究都是在此基础上完成的。遗憾的是，该模型仍有一定不足——造模的成功率有限，多数的研究报道均显示为60%-70%左右。我们在大量的预试验后仍然不能有效提高这一比率。部分实验大鼠不能完成全程实验检测，多中途死于肿瘤引发的恶病质和免疫功能低下并发的40万方数据 第二部分·讨论致命感染。我们的研究结果成功复制了前述的Medhurst大鼠胫骨癌痛模型，在研究中，我们如期观察到了大鼠的疼痛行为学改变，模型动物表现为机械性痛敏和热痛觉过敏兼存，同时观察到了乳腺癌肿瘤所致的骨质破坏。与Medhurst取得了一致的结果，成功率75%。41万方数据 新疆医科大学博士学位论文小结4.1胫骨接种MRMT-1细胞株术后14天可见大部分大鼠术侧后肢出现轻至中度肿胀，肿瘤生长良好。剔除疼痛行为学检测和/或影像学检测阴性的大鼠和死亡大鼠，本实验造模成功率75%。4.2大鼠疼痛行为学检测结果显示假手术组大鼠与骨癌痛组大鼠术前机械痛缩爪阈值无差异。假手术组大鼠术后各时点与术前机械痛缩爪阈值相比无统计学意义。骨癌痛组大鼠术后各时点机械痛缩爪阈值与术前相比下降显著，有统计学差异。骨癌痛组大鼠术后各时点机械痛缩爪阈值同时间假手术组相比也明显下降，有统计学差异。大鼠光热甩尾阈值呈现相同的变化趋势。4.3放射学研究大鼠胫骨X线片显示，实验大鼠术侧胫骨呈现显著的骨质破坏，骨破坏的程度与病程长短呈现正相关，病程长者骨质破坏的程度较病程短者显著。起初松质骨出现缺损病灶，然后骨皮质也出现缺损，后来病灶范围扩大，骨皮质完全缺失，有骨折倾向。假手术组胫骨X线照片未显示明显的骨质破坏。4.4骨癌痛大鼠胫骨石蜡切片组织学观察结果显示造模大鼠骨髓腔有异物巨细胞及大量破骨细胞。42万方数据 第二部分·小结第三部分慢病毒介导的GDNFRNA干扰对骨癌痛的疗效骨癌痛由于本身涉及到很复杂的中枢、外周调控机理及神经元的结构重塑，在各种普通治疗手段及普通药物对这种顽固性疼痛越来越束手无策时，要从根本上解决慢性疼痛问题，越来越多的学者将目光投向了基因治疗。目前基因治疗常用的方法是：借助合适的载体将目的基因（镇痛基因/致痛基因）导入，使镇痛基因在机体内源源不断的产生，或者使致痛基因持续的沉默，从而产生相应的生物效应。基因治疗能够有效缓解疼痛，不存在药物的耐受、依赖及滥用等不良反应，在研究中表现出更加值得探索的前景。目前的基因治疗研究虽然仍在实验室阶段，并且存在这样那样的缺陷，但随着人们对基因治疗手段的认识和深入，建立起安全有效的基因调控体系只是或早或晚的事，基因治疗很可能成为日后处理疼痛的一种更为有效和安全的治疗手段。它不仅可以用于神经痛和病理痛，将来还可能用于各种难治性疼痛甚至对阿片类药物耐受的疼痛。1研究内容与方法1.1研究对象1.1.1实验动物清洁级雌性SD大鼠，250-300g，由四川大学动物实验中心提供，避光转运至成o都市高新区四川大学转化医学中心，实验大鼠饲养在环境温度20士5C、24小时昼夜节律、避强光、无噪音刺激的环境中，适应环境三天后进行实验，以排除应激干扰的影响。期间动物可自由进食，进水。按国际实验动物使用准则处理。1.1.2肿瘤细胞株实验选用大鼠同源的乳腺癌细胞株MRMT-1，MRMT-1细胞株购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.2内容与方法1.2.1主要仪器和试剂主要仪器SW-200光热尾痛测试仪：购自北京渠道科学器材有限公司57215UgoBasile足底测痛仪：购自北京渠道科学器材有限公司倒置显微镜：德国LEICA（DMI6000B）自动组织包埋机(ZMN-7803)：常州市华利电子公司电热恒温水浴箱：姜堰市新康医疗器械有限公司43万方数据 新疆医科大学博士学位论文恒温干燥箱：(进口)日本微波炉：格兰仕冰箱(BCD-203)：容声公司光学显微镜(BX41TF)：(进口)日本OLYMPUS组织切片机(Leica2135、2145)：(进口)德国微量进样器(5ul)：宁波市镇海玻璃仪器厂移液器(50ul)：上海求精生化试剂仪器有限公司低温离心机：日本HITACH：CF-16RX小容量离心机：上海安亭科学仪器厂大容量离心机：美国ThermoFisher（D-37520）PCR仪：美国BIO－RAD：MJmini（4345240）水平电泳槽：北京六一电泳槽公司凝胶成像仪：美国BIO-RAD垂直电泳槽：美国BIO-RAD湿式转膜槽：美国BIO-RAD水平、钟摆式摇床：苏海门市麒麟医用仪器厂塑料薄膜封口机：海麦尔多机械有限公司低温冰箱：日本SANYO（MDF-1156）HSS-1数字式超级恒温浴槽：成都仪器厂隔水式恒温培养箱：海一恒科技有限公司电子天平：瑞士Precisa酶标仪：美国BIO-RAD纯水设备：台湾艾柯PHS-4C+型精密PH仪：成都世纪方舟科技有限公司5ml玻璃匀浆器：上海玻璃仪器厂高速冰冻离心机：美国Thermo漩涡混匀器：美国CRYSTALGelDoc凝胶成像分析仪：美国BIO-RAD超声波细胞粉碎机：北京比朗实验设备有限公司加样枪：德国Eppendorf：1000μL、200μL、10μL、2.5μL细胞培养板：6孔、96孔PE10导管：英国SmithMedical耗材：各规格EP管、加样枪头、锡箔纸、饭盒、保鲜膜等无菌操作台：苏州亿达净化实验室设备有限公司（SW-ST-2FD）44万方数据 第三部分·研究内容与方法无菌手术器械主要试剂75%酒精；0.01MPBS；0.9%生理盐水；无菌骨蜡；4%多聚甲醛-PB固定液；10%,20%,30%的蔗糖；冰冻切片包埋剂；切片保护剂，10%水合氯醛。1.2.1.2实验试剂1.2.1.2.1抗体免疫荧光抗体：一抗：CGRP，兔抗，英国Abcom公司,浓度1:200一抗：SP，兔抗，美国Chemicon公司,浓度1:200一抗：GDNF，兔抗，中国Boster公司，浓度1:100一抗：GFAP，兔抗，中国ZSGB-BIO公司，浓度1:50二抗：CY3，美国Jackson公司，浓度1:300WB抗体:一抗：anti-pERK兔抗,美国CellSignalingTechnology,Danvers公司,浓度1:1000一抗：c-fos兔抗,美国Santa公司,浓度1:1000,一抗：GDNF兔抗,中国Boster公司，浓度1:300,二抗：羊抗兔抗体，英国Abcom公司，浓度1:5000RT-PCR试剂、WesternBlot试剂、WesternBlot试剂配制、其他试剂配制（见前述）1.2.2实验步骤1.2.2.1复制评价大鼠胫骨癌痛模型复制大鼠胫骨癌痛痛模型方法同第二部分。选择清洁级成年雌性SD大鼠60只，行疼痛行为学检测，检测内容包括机械痛缩爪阈值和热痛甩尾阈值。复制大鼠胫骨癌痛痛模型。其中2只大鼠死于麻醉药物引起的呼吸及循环系统抑制。发生恶液质死亡的大鼠8只予以剔除。术后两周可见大部分大鼠于出现肿瘤细胞注射侧后肢出现轻至中度肿胀，提示肿瘤生长良好。结合疼痛行为学检测和影像学检测发现无骨质破坏性生长的大鼠3只予以剔除；有肿瘤生长，但疼痛行为学检测术前与术后7d时差别无统计学意义的大鼠4只予以剔除。手术两周后造模成功大鼠43只，致瘤率71.6%。休息三天，准备行蛛网膜下腔置管，进行疗效研究实验。1.2.2.2蛛网膜下腔置管及鞘内转染(1)术前准备：PE10导管12cm（置管前先用生理盐水测其通畅程度，使管内充满盐水）；手术器械；直径约8cm圆筒。(2)3.6%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠。待麻醉起效后，将大鼠取俯卧位固定，腰部垫一圆筒，背部剃毛消毒后，铺洞巾。45万方数据 新疆医科大学博士学位论文(3)摸清两侧髂棘（其连线为L6），向上2个节段到L3-4定位，在此部位做长约3cm的皮肤纵切口，切开该处背脊肌的筋膜，切断L3-4、L4-5的棘间韧带，分离L4棘突两侧肌肉，切除L4棘突和邻近椎板，暴露L3-4棘突间隙，用神经钩的弧形钩尖仔细分离此间隙上下的筋膜及肌肉组织。(4)大鼠脊柱尽量向前弯曲，以平头的10ul微量注射器针头轻轻穿破黄韧带及硬脊膜，以此时鼠尾突然出现侧摆或后腿突然出现抽动为成功标志，并可见清亮的脑脊液外溢，用巾钳夹住L3椎板并往上提，经破口置入导管，方向与脊柱纵轴平行。(5)导管置入2cm，使开口的头端位于L1-2，导管固定后，注入生理盐水0.1ml冲洗导管并观察插管处有无液体外溢。(6)在大鼠颈背部做一小切口，经皮下隧道将导管的另一端引出于颈背部，外露2-3cm后固定，固定时先用医用胶布将导管及切口旁的鼠毛固定缠绕在一起，在用缝合针将胶布及皮肤缝合固定，固定后用止血钳钳夹外露导管口，防止脑脊液外溢，下次注药时将夹闭的那段导管剪掉后即可注药。(7)术后补液5ml糖盐，大鼠单独放置。(8)术后待大鼠清醒，观察后肢活动，无异常。(9)苏醒后的大鼠，鞘内注射2%的利多卡因10μl检测置管是否成功，置管成功的大鼠会在注射后约1min出现短暂的后肢麻痹，并逐渐恢复。如无麻痹现象或者麻痹不能恢复则为置管失败。(10)43只大鼠，1只置管失败，42只大鼠置管成功，休息2天后行药物注射治疗。(11)将大鼠随机分为4组，-SHGDNF组、病毒空载体组各11只，生理盐水组、吗啡组各10只。所有大鼠均自蛛网膜下微导管注射20μl药液，药液分别为有效载体Lv-shRNA-GDNF、慢病毒空载体、注射用生理盐水以及治疗量吗啡（1-3mg/kg），给药后的大鼠单独放置。设置吗啡组，意在与GDNFRNA干扰组对比治疗效果。但吗啡体内代谢较快，疼痛行为学检测周期较长，且临床患者会按时给药，以保证镇痛效果，所以本实验吗啡组每次行疼痛行为学检测前1小时会再次追加吗啡，其余组注药均为一次性。1.2.2.3疼痛行为学检测给药后的大鼠每7天进行一次疼痛行为学检测，检测内容包括机械痛缩爪阈值和热痛甩尾阈值，与术前的检测的水平作比较。1.2.2.4取材完成疼痛行为学检测四周的大鼠，准备取材进行下一步的实验。每组随机挑选一只大鼠做灌注，剩余的大鼠活取组织，取材部位为脊髓腰膨大。灌注取材(1)3.6%水合氯醛1ml/100g腹腔注射，待麻醉起效后将大鼠四肢固定在木板上。46万方数据 第三部分·研究内容与方法(2)沿胸骨柄处向两侧剪开胸腔，充分暴露胸腔，可见跳动的心脏，用25ml注射器吸取生理盐水，装上5ml的针头，用针头从心尖部扎入，同时将右心耳用眼科剪剪一口子，此时将生理盐水缓慢注入，可见肝、肺等内脏逐渐变白，右心耳流出血水，盐水灌注直至右心耳流出液体较清亮。(3)此时用清水冲洗胸腔，使视野变清晰，然后抽取多聚甲醛，从心尖部注入，可见大鼠四肢开始僵硬，尾巴翘起，这些现象表明灌注良好。(4)将大鼠背部皮肤剪开，分离脊柱两侧肌肉，用咬骨钳咬开椎板，暴露整个脊髓，o取腰膨大段脊髓，放入装有4%多聚甲醛的离心管中，标记，放于4C冰箱中保存，以备免疫荧光实验使用。活取(1)3.6%水合氯醛1ml/100g腹腔注射，待麻醉起效后将大鼠四肢固定在木板上。(2)用剪刀剪开大鼠一侧腹股沟皮肤，小心分离筋膜，固定大鼠同侧下肢，可见股动、静脉，用剪刀尖部挑起血管并将其剪断放血。(3)当血流停止后，快速将大鼠背部皮肤剪开，分离脊柱两侧肌肉，用咬骨钳咬开椎板，暴露整个脊髓，取腰膨大段脊髓及L4-6背根神经节，放入冰浴中的离心管中，标记，放于-20℃冰箱中保存，以备PCR及WesternBlot使用。1.2.2.5提取脊髓腰膨大组织中的RNA将研钵放在冰块中，将脊髓腰膨大组织在研钵中研成细胞悬液，将液体吸出后放入1.5mlEP管中。准备提取总RNA：(1)裂解液中加入200μl氯仿(5:1)，剧烈振荡10-15s，室温静置15min，4℃12000r/min离心15min，观分层。(2)取上清至EP管中，加入500μl异丙醇（1:1），振荡10-15s，-20℃静置30min以上，4℃12000r/min离心8min（可见管底有透明的胶状沉淀）后弃去上清液。(3)加入1ml预冷的75%乙醇（DEPC处理水）洗涤RNA，轻轻振荡几次后，4℃12000r/min离心5min，弃去上清液。(4)干燥，在弃上清液后，保持EP管口向下，在滤纸上尽量吸干管口乙醇，然后将EP管水平放置，管口朝向酒精灯方向干燥约10min，期间可用加样枪吸干EP管管壁上的液体，注意勿触及管底的RNA。(5)加入逆转录试剂盒中的DEPC处理水20µl，溶解RNA。用枪反复吹打后，吸取3µl分装于0.5ml的去RNA酶的管中，用于测RNA的浓度。1.2.2.6测RNA的浓度：(1)取3µl总RNA样品在ND-1000分光光度计中测其浓度。(2)用DEPC处理水清洗探头3次，加一滴DEPC处理水作为空白对照并调零。(3)测量样品的总RNA浓度，每测量完一个样品，需要用DEPC处理水清洗探头347万方数据 新疆医科大学博士学位论文次。期间记录所测样品的浓度，观察OD260/OD280（R）比值，为1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以允许。当R＜1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显，当R＞2.0时，说明RNA已经水解成为寡核苷酸。(4)测量结束后用DEPC处理水清洗探头多次，以便下次使用及增加仪器使用寿命。1.2.2.7逆转录合成cDNA：按照RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒说明合成cDNA。(1)按顺序将下列反应物加入PCR管中(冰浴上操作)：RNA样品3ug计算所得的总RNA体积量V=3ug/浓度Oligo(dT)引物1µl加DEPC处理水至三者总体积为12µl，轻轻振荡，稍离心3-5s,使反应物混匀。(2)PCR仪器中65℃温育5min，4℃冷却，稍加离心。(3)冰浴中加入以下反应物：5×ReactionBuffer4µlRibolockTMRibonucleaseInhibitor(20µg/µl)RI1µl10mMdNTPmix2µlRevertAidTMM-MuLVReverseTransciptaseRT1µl轻轻振荡，稍离心3-5s,使反应物混匀。(4)42℃温育60min，70℃加热10min后终止反应，冰浴冷却。1.2.2.8进行RealTimePCR扩增(1)QPCR反应体系的配制：QPCR反应体系25ul，各试剂计量如下：名称体积(ul)2Xpcrmastermix12.5Sense（上游引物）0.6Anti-sense(下游引物)0.6Taqman-proke（探针）0.6cDNAtemplate1.2（实验中一般取1-1.5）Nuclease-freewater9.5充分混匀后分装于PCR管中。瞬时离心后，转移至实时荧光定量基因扩增仪中。(2)反应条件94℃2min预变性；94℃15sec变性56℃20sec45cycles,于60℃40sec时采集荧光48万方数据 第三部分·研究内容与方法60℃30sec延伸退火(3)结果读取和变换反应结束后，观察和分析每个反应的扩增动力学曲线，根据动力学曲线读取并确定每个样品对应的Ct值，并换算成相对于内参照基因的相对表达量。1.2.2.9免疫荧光方法：(每组脊髓腰膨大30%脱水后冷冻切片15ul，切片后做GFAP、P物质、CGRP等生物活性物质的免疫荧光染色)具体实验步骤：漂片法(1)漂洗：将标本放入一盛有0.01mol/LPBS200ul溶液的96wells板中一孔进行漂洗，5min×3次。(2)封闭：5%羊血清，37℃孵育30min，为减少非特异性背景，置于湿盒中。用血清进行封闭是为了防止组织或细胞切片上剩余位点非特异性吸附抗体，导致结果假阳性，血清属性一般与二抗相同。(3)一抗孵育，37℃4h或4℃冰箱过夜。（空白对照加2%的羊血清代替一抗）(4)漂洗：将标本放入一盛有0.01mol/LPBS200ul溶液的96wells板中一孔进行漂洗，15min×3次。(5)二抗(Cy3)孵育，37℃孵育2h，避光处理。(6)0.01mol/LPBS200ul溶液漂洗，5min×3次，避光处理。(7)DAPI复染。1.2.2.10WB检测：倒掉培养液，用预冷的0.01MPBS洗3次，加入400μL中强裂解液（1mL蛋白裂解液中添加10μLPMSF），用细胞刮刀将细胞刮起，收集悬浊液。将悬浊液至于冰水浴中在超声清洗机处理3－5min，以打断DNA链。然后4℃，12000rpm/min离心15min，取上清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存。取7个200μLEP管，按照下表3-1加入试剂。表3-1WB加样顺序表Chart3-1WBpipettingsequencetable孔号0123456蛋白标准溶液（μL）01246810去离子水（μL）10986420对应蛋白含量（μg）0134681049万方数据 新疆医科大学博士学位论文根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；各管加入100μLBCA工作液，37℃孵箱放置30min，在分光光度计562nm下比色测定，生成以蛋白含量（μg）为横坐标、吸光值为纵坐标的标准曲线；吸取1μL待测样品双蒸水稀释至10μL，加入BCA工作液100μL，充分混匀，37℃放置30min后，以标准曲线0号管为空白对照，在562nm波长下比色，记录吸光度值、蛋白浓度（μg/μL）。1.2.2.11SDS－PAGE电泳：调整样品浓度至10μg/μL以下，每个样品吸取50μL，加10μL，5×loadingbuffer置于1.5mlEP管中，吹打混匀，于沸水中变性10min。瞬时离心30秒，4℃保存。上样前再次吹打混匀。上样量为35μg，体积（μL）＝35/蛋白浓度×1.2。清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，一只手蘸洗衣粉少许轻轻擦洗。自来水充分冲洗，双蒸水冲洗干净后立在筐里盖上纱布晾干。玻璃板对齐后封好橡胶条，垂直卡于架上准备灌胶；用1mL加样枪灌胶，每块胶约7mL。缓慢加双蒸水液封；20min后，当水、胶之间出现清晰的折射线时，倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。将玻板空间灌满后将梳子插入浓缩胶中；浓缩胶充分凝固后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上将其轻轻拔出。加足量的正负极电泳缓冲液，负极缓冲液没过内侧玻璃板上缘。用200μL加样枪向各加样孔吹打3－4次，除去少量杂乱的浓缩胶；以20μL微量加样枪准确吸取样品，枪头垂直向下缓慢注入胶孔；接通电源，100V恒压电泳至样品下缘接触分离胶时改用60－80V恒压继续电泳近3h，直至溴酚蓝刚刚溢出分离胶下缘时停止电泳；取下玻板，小心剪去浓缩胶，将分离胶置于湿转缓冲液中。电泳完成前30min完成以下工作：每转一张膜需准备1张7.cm×8.5cmPVDF膜，4张7.5cm×9.5cmwhatman3mm滤纸。将PVDF膜用甲醇浸泡数秒钟后和滤纸、海绵垫一同浸泡于湿转缓冲液中；按照如下顺序叠放电转三明治：负极2层滤纸胶膜2层滤纸正极，每层放好后，用试管赶去气泡，边叠放边滴加转移缓冲液，用干净玻棒赶出气泡将三明治夹子放入转移槽中，黑面对槽的黑面，白面对槽的红面。转移槽置于冰盒中，周围敷好冰块。100V，转膜1h后关闭电源，取出PVDF膜，置于TBST中继续以下步骤。将PVDF膜置于5％的脱脂奶粉中，室温（20℃－30℃）封闭1h；尽量吸干脱脂奶粉，加入一抗5mL，置于脱色摇床上室温孵育30min后，于4℃中过夜。TBST洗膜3次，每次10min；加入酶标二抗，室温孵育1.5h。TBST洗膜3次，每次10min；ECL显色：曝光盒里铺好保鲜膜，用吸水纸尽量吸干PVDF膜上的水分后，将其平放在曝光盒里；吸取A液50μL和B液50μL加入900μL双蒸水中，混匀，均匀地滴加到条带应该出现的位置；曝光并在凝胶成像仪中成像。1.3质量控制1.3.1荧光免疫组化质量控制50万方数据 第三部分·研究内容与方法⑴抗体孵育时间的选择，室温高时可适量减少孵育时间，室温低时可适量增加孵育时间。⑵抗体的选择：一抗的选择注意其种属特异性，根据一抗的种属选择相应的二抗，且应严格按照抗体说明书配制、分装、保存抗体。⑶从二抗孵育开始使用湿盒避光。⑷抗体若在-20℃保存，应避免反复冻融。1.3.2鞘内置管质量控制[59,60]大鼠蛛网膜下腔置管有两种常用方法：早期的学者多采用颈部入路的Yaksh法，于枕部正中切皮，分离颈部肌肉，暴露寰枕膜，自此开口置入微导管至腰部脊髓，与皮肤缝合固定。经此法插入的管不容易脱落，置管位置固定，但对术者要求较高，易发生脊髓损伤，引起置管失败，造成模型大鼠的浪费。鉴于此，学者们研究形成了另一种自腰骶部入路的置管方法。此法简单易行，对术者的要求不高，脊髓发生损伤的几率小，但是易发生脱管。所以术中会采用皮下隧道的方法，将导管仔细固定皮下。我们在实验中选用的是后者。置管实验需要注意以下几点：⑴术后为防止大鼠之间相互撕咬，所有大鼠必须单独饲养。给大鼠穿皮马甲可有效固定微导管防止咬脱。⑵给药管道采用弹性较好的PE-10管防止打折、管腔阻塞和漏液;采用硬膜外导管自行拉制时，要进行定容和测通，置管后妥善固定。⑶预实验时可经管道给予生物染色剂，实验结束后处死大鼠确认给药在鞘内。⑷注意无菌操作，切口用青霉素粉预防感染，术后连续3d腹腔注射青霉素，避免鞘内炎症因素对实验的干扰。⑸鞘内置管后的利多卡因试验可有效评估置管是否成功。⑹由于手术会引起脊髓急性期的可逆性水肿，所以鞘内置管成功后立即进行治疗实验是不合适的，一般需要休息3d左右开始给药，可以排除鞘内置管因素对动物疼痛行为学的影响。⑺用微量注射器经PE-10管给药时要小心操作，避免戳破管壁药液外漏。1.3.3骨癌痛造模质量控制见本研究第二部分。1.4统计方法采用SPSS11.0统计软件分析，疼痛行为学数据以均数士标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内不同时间点的比较采用重复测量资料的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。WesternBlot获得的灰度值进行单因素方差分析，P<0.05有统计学意义。51万方数据 新疆医科大学博士学位论文2结果2.1大鼠基因治疗分组：选择清洁级成年雌性SD大鼠60只，复制大鼠胫骨癌痛痛模型。其中2只大鼠死于麻醉药物引起的呼吸及循环系统抑制予以剔除。发生恶液质死亡的大鼠8只予以剔除。结合疼痛行为学检测和影像学检测发现无骨质破坏性生长的大鼠3只予以剔除；有肿瘤生长，但疼痛行为学检测术前与术后7d时差别无统计学意义的大鼠4只予以剔除。造模成功43只大鼠，致瘤率71.6%。鞘内植入微导管时，1只大鼠出现截瘫，其余42只大鼠参加疗效研究。其中又有2只大鼠在实验过程中死于恶病质，予以剔除。最后40只大鼠纳入统计，生理盐水组9只、吗啡组10只、病毒空载体组10只、GDNF-SH组11只。详见表3-2.表3-2各组大鼠编号及分组情况Table3-2Ratsineachgroupnumberandgrouping组别N编号生理盐水组93、5、6、9、16、23、48、49、55吗啡107、13、15、18、22、27、29、32、38、57病毒空载体对照组108、11、17、20、25、29、30、37、35、52GDNF-SH组114、19、33、34、36、37、39、42、51、54、602.2基因治疗后机械痛及热痛甩尾实验结果：2.2.1基因治疗后机械痛实验结果：根据分组，从蛛网膜下腔所置PE10导管中缓慢注射20ul等体积的生理盐水、吗啡、病毒空载体及ISGDNF慢病毒重组体后7d和14d分别测大鼠双下肢的机械痛及甩尾温觉测试。结果分析，注药后7d时各组机械痛结果无差异（P>0.05）。注药后14d时，注射ISGDNF慢病毒载体组机械痛阈值明显较生理盐水组及对照组延长（P<0.05），出现了类似吗啡发挥的作用（P>0.05）。见图3-1。2.2.2基因治疗后热痛实验结果：热痛甩尾试验表明在注射药物7d和14d后两次都发现ISGDNF慢病毒载体组出现了与吗啡相类似的效果（P>0.05）；与生理盐水组和病毒空载体组相比热痛觉阈值明显延长（P<0.05）。见图3-2。2.3shRNAGDNF治疗后脊髓腰膨大GDNFWesternBlot实验结果52万方数据 第三部分·结果WesternBlot实验中另取6只正常未做手术的大鼠标本作为参照。GDNF的WesternBlot检测结果显示，GDNF干扰组干扰GDNF表达有效，该组内GDNF蛋白量显著低于生理盐水组与正常大鼠(P<0.05)，但与吗啡组和空载体组的差距尚无统计学意义(P>0.05)。见图3-3。2.4大鼠脊髓免疫荧光染色结果免疫荧光实验中另取6只正常未做手术的大鼠标本作为参照。见图3-4。2.4.1GFAP免疫荧光染色结果图为各组大鼠腰膨大GFAP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为GFAP所在。各组GFAP荧光图片趋势：GFAP表达在正常大鼠、生理盐水组、空载体组明显多于GDNF基因干扰组，吗啡组GFAP(P<0.05)。星形胶质细胞阳性数呈现一致性变化。见图3-5。2.4.2CGRP免疫荧光染色结果图为各组大鼠腰膨大CGRP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为CGRP所在。各组CGRP荧光图片趋势：CGRP表达在生理盐水组和空载治疗组显著高于GDNFRNA干扰组吗啡组及正常大鼠(P<0.05)。见图3-5。2.4.3SP免疫荧光染色结果图为各组大鼠腰膨大SP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为SP所在。各组SP荧光图片趋势：SP表达在生理盐水组和空载治疗组显著高于GDNFRNA干扰组、吗啡组及正常大鼠(P<0.05)。脊髓I-II板层SP免疫阳性膨体数呈现一致性变化。图3-6。2.5脊髓PERKWesternBlot实验结果：Westernblot显示，正常脊髓可探测到PERK表达。生理盐水组、空载体组PERK44水平明显增加，与正常组比差异有统计学意义（P<0.05）。空载体组PERK42水平明显增加，显著高于其余各组（P<0.05）。GDNF干扰明显减少脊髓PERK磷酸化蛋白水平。与生理盐水组、空载体组比差异有统计学意义（P<0.05）。见图3-7。2.6脊髓c-fosWesternBlot实验结果：各组c-fos表达结果：c-fos表达在生理盐水组和空载治疗组显著高于GDNFRNA干扰组吗啡组及正常大鼠(P<0.05)。见图3-8。53万方数据 新疆医科大学博士学位论文图3-1各组蛛网膜下腔注射不同药物后14d的机械痛压爪试验结果Chart3-1Mechanicalpawwithdrawalresultsofeachgroup14daftersubarachnoidinjectionofdifferentdrugs注：生理盐水、吗啡、病毒空载体及ISGDNF慢病毒重组体注药后7d时各组机械痛结果无差异（P>0.05）。注药后14d时，ISGDNF慢病毒载体组、吗啡组术侧（左侧）机械痛阈值明显较生理盐水组及对照组延长（P<0.05）。健侧（右侧）发生相似改变。54万方数据 第三部分·结果图3-2各组蛛网膜下腔注射不同药物后7d、14d的热痛甩尾试验结果Chart3-2Tail-flicklantencyresultsofeachgroup14daftersubarachnoidinjectionofdifferentdrugs注：生理盐水、吗啡、病毒空载体及ISGDNF慢病毒重组体注药后7d,14d时，ISGDNF慢病毒载体组及吗啡组热痛甩尾痛阈值明显较生理盐水组及对照组延长（P<0.05）。图3-3各组GDNF免疫荧光染色、PCR、WesternBlot实验结果合图Chart3-3ThechangesofGDNFexpressionineachgroup注：A骨癌痛大鼠脊髓后角GDNF免疫荧光染色有表达；BGDNF的PCR检测结果；CGDNF的WesternBlot检测结果（条带从左至右依次为：正常组、生理盐水组、空载组、吗啡组、GDNF干扰组）。GDNF干扰组内GDNF蛋白翻译相对表达量显著低于生理盐水组与正常大鼠(P<0.05)；但与吗啡组和空载体组的差距尚无统计学意义(P>0.05)。55万方数据 新疆医科大学博士学位论文图3-4GFAP免疫荧光染色结果和各组星形胶质细胞阳性细胞数合图Chart3-4TheexpressionofGFAPineachgroup注：图为各组大鼠腰膨大GFAP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为GFAP所在。各组GFAP荧光图片趋势：GFAP表达在正常大鼠、生理盐水组、空载体组明显多于GDNF基因干扰组，吗啡组GFAP(P<0.05)。星形胶质细胞阳性数呈现一致性变化。56万方数据 第三部分·结果图3-5各组CGRP免疫荧光染色结果Chart3-5TheexpressionofCGRPineachgroup注：图为各组大鼠腰膨大CGRP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为CGRP所在。各组CGRP荧光图片趋势：CGRP表达在生理盐水组和空载治疗组显著高于GDNFRNA干扰组吗啡组及正常大鼠(P<0.05)。脊髓I-II板层CGRP免疫阳性膨体数呈现一致性变化。57万方数据 新疆医科大学博士学位论文图3-6各组SP免疫荧光染色结果Chart3-6TheexpressionofSPineachgroup注：图为各组大鼠腰膨大SP免疫荧光染色结果，红色荧光部分为SP所在。各组SP荧光图片趋势：SP表达在生理盐水组和空载治疗组显著高于GDNFRNA干扰组、吗啡组及正常大鼠(P<0.05)。脊髓I-II板层SP免疫阳性膨体数呈现一致性变化。58万方数据 第三部分·结果图3-7各组PERK免疫荧光染色和WesternBlot实验结果合图Chart3-7ChangesofPERKexpressionofeachgroupinimmunofluorenceandWesternBlot注：Westernblot显示，正常脊髓可探测到PERK表达。生理盐水组、空载体组PERK44水平明显增加，与正常组比差异有统计学意义（P<0.05）。空载体组PERK42水平明显增加，显著高于其余各组（P<0.05）。59万方数据 新疆医科大学博士学位论文图3-8各组c-fosWesternBlot实验结果Chart3-8Theexpressionofc-fosineachgroupinWesternBlot注：各组c-fos表达结果：c-fos表达在生理盐水组和空载体治疗组显著高于GDNFRNA干扰组、吗啡组（P<0.05）。60万方数据 第三部分·结果3讨论我们的研究结果显示，GDNF的RNA干扰是成功的，RNA干扰组GDNF水平在各组呈现最低。GDNFRNA干扰可以有效改善不同时期(给药后7-28d)骨癌痛症状，说明GDNF参与了骨癌痛的形成和维持。生理盐水组和慢病毒空载体组大鼠脊髓星形胶质细胞活化明显，GFAP大量表达。与GDNFRNA干扰组、吗啡组、正常组大鼠相比有显著性差异。GDNFRNA干扰组、吗啡组抑制星形胶质细胞活化的同时实现了镇痛效果，提高了大鼠的机械痛阈值和热痛阈值。提示，shRNAGDNF可能通过抑制星形胶质细胞的活化实现镇痛。疼痛调质CGRP、SP水平变化呈现与GFAP一致的趋势，表现了与疼痛变化相关的改变。提示CGRP、SP参与了shRNAGDNF对疼痛的调节，很可能与星形胶质细胞的活化相关。生理盐水组和慢病毒空载体组大鼠脊髓ERK显著活化，PERK呈现高表达，与GDNFRNA干扰组、吗啡组、正常组相比差异有统计学意义。伤害性刺激可引起ERK的活化，传递痛信号。GDNFRNA干扰组可能通过抑制ERK的活化，打断痛信号的扩散。GDNF是一个功能强大的神经营养因子，可能通过多种途径调节骨癌痛的形成和维持，星形胶质细胞和ERK通路、CGRP、SP很可能在其中起重要作用。下面结合我们的研究结果和以往的文献来分析shRNAGDNF在骨癌痛镇痛的可能机制和今后的研究方向。3.1骨癌痛的机制广义的癌痛包括癌症发展直接造成的疼痛、癌症治疗后的疼痛和癌症患者并发[61]疼痛性疾病。我们研究的是癌症发展直接造成的疼痛。癌症进展的突出特点就是侵犯性，表现为肿瘤局部的扩张性生长和远处的播散转移。肿瘤多经淋巴通路或者血道形成转移。哺乳动物的大动脉、静脉往往与相应的淋巴管和同名神经伴行在软组织中。所以，肿瘤转移的过程难免出现伴行神经或沿行软组织受侵，引起神经损伤，出现神经性疼痛。其次，肿瘤的扩张性生长往往引发瘤体的出血坏死，甚至感染，局部PH降低，趋化炎症因子的大量释放，最终引起初级传入神经敏化，产生炎[62]性痛。再者，有学者认为肿瘤局部异形生长导致的骨膜微折及骨膜牵拉所致的疼[63]痛在骨癌痛的形成中起重要作用。此外，研究证明肿瘤细胞的亚型与其生物学特[64]性相关，可能呈现出不同的侵犯能力以及不同的脊髓神经化学物质的表达。总之，[65,66]骨癌痛的成分比较复杂，不只是单纯的神经痛或者炎性痛，还包括肿瘤特异性的致痛机制。概括地说，肿瘤源性，炎性以及神经性等多重复杂机制共同作用引发61万方数据 新疆医科大学博士学位论文的痛觉敏化是骨癌痛形成和维持的根本，患者因而表现出持续性背景痛、暴发痛和痛觉超敏等复杂症状。临床研究发现，背景痛对阿片类镇痛药依从性较好，但需长期服药，因而伴随着各种药物不良反应及成瘾和耐受的风险。暴发痛发作时间不定，研究有一定难度。目前学者们更关注长期存在且严重干扰患者生活质量的痛觉敏化状态。骨癌痛患者的神经系统敏化不仅包括外周神经敏化，还包括中枢神经敏化。外周敏化：外周敏化主要包括两个方面：一是肿瘤自身因素，二是局部微环境的变化。(1)肿瘤的侵犯可引起局部的疼痛：骨转移早期，肿瘤细胞在骨髓腔内生长，刺激破骨细胞，引起骨形成和骨溶解的平衡失调，出现局部的骨质破坏引发疼痛的启动。肿瘤发展后期，随着肿瘤体积的增大，髓腔内压力增高，使骨膜受到牵拉；再者，肿瘤的侵犯性生长可能直接侵蚀和损伤外周神经。最终，由于神经的牵拉、压迫、缺血以及机械损伤而加重患者的疼痛症状。研究显示，骨癌痛中支配骨髓的初级传入神经元可以为肿瘤组织破坏并且致敏。支配骨膜的神经纤维集合成C类纤维[67]亚群，可表达疼痛调质CGRP，后者参与伤害性疼痛的传导，可诱发疼痛的产生。我们在研究过程中也发现多数大鼠在注射MRMT-1乳腺癌细胞株后14-28天期间出现注射侧肢体的明显肿胀，骨质的破坏和变形，以及与此相关的机械痛敏和热痛敏。(2)肿瘤细胞的生物学特性与临床症状相关：骨癌痛可能与肿瘤类型，来源和骨破坏的程度有关。即使是同一种肿瘤，如乳腺癌，其不同亚型的细胞株也表现出不同的骨侵袭能力，骨侵袭能力强的细胞株骨癌痛造模成功率更高。不同的肿瘤类型也有不同的内分泌特性，有些肿瘤细胞可分泌蛋白溶解酶，引起感觉神经纤维和交感神经纤维的溶解，出现神经性疼痛。上述临床现象的差异都是由肿瘤细胞的生物学特性决定的。(3)肿瘤组织本身以及其诱发趋化的炎症细胞核和免疫细胞均可释放一系列细胞[68,69]因子，如前列腺素，内皮素，白细胞介素-1，白细胞介素-6，缓激肽，TNF-a等[70-73][74]等，激活初级传入神经元的相关受体或者直接致敏外周伤害性感受器，引发疼痛。细胞和细胞因子之间往往存在正反馈的级联放大效应，最终使痛信息不停放大，形成外周敏化。(4)骨代谢紊乱：临床研究表明骨转移引发的骨破坏在骨癌痛的形成中起重要作用。肿瘤可破坏成骨与破骨之间的动态平衡，刺激破骨细胞，分泌酸和溶解酶降解骨基质，形成骨破坏、骨溶解。患者的疼痛行为、背角神经节的神经化学与骨破坏的程度呈相关性。RANK与RANKL之间的作用在破骨细胞活化形成骨损害的过程中起重要作用。RANK配体(RANK-L)和集落刺激因子-I等可刺激破骨细胞的形成，[75]增强破骨细胞的活力。骨保护素(OPG)与RANKL的结合阻止破骨细胞活化和减少骨吸收从而减少骨组织的破坏。RANK-L与OPG的比例处于一种动态平衡，肿瘤62万方数据 第三部分·讨论组织及炎症细胞释放的多种生物活性物质可破坏两者之间的比例平衡。RANKL激活RANK后，可通过蛋白激酶途径实现信号转导，如p38,ERK,IKK,INKc-Src酪氨酸[76,77]激酶等。产生相关基因，活化破骨细胞。治疗骨癌痛常用的药物双磷酸盐就是通过干扰破骨细胞的溶骨作用实现镇痛的。研究表明，OPG可以反转骨癌痛中星形[78]胶质细胞的活化以及c-fos蛋白和强啡肤表达上调，产生镇痛，因而可能成为未来调节骨代谢平衡的新一代药物。(5)骨肿瘤患者局部的缺氧，酸性环境和细胞外高钙离子浓度等均可引起与肿瘤细胞的过度生长和骨癌痛的发生。中枢敏化：骨癌痛的研究发现，中枢敏化参与了痛觉敏化的形成和维持。伤害性刺激或者相关的细胞因子如前列腺素，内皮素，白细胞介素-1，白细胞介素-6，缓激肽，TNF-a[79]等可激活初级传入神经元或者致敏外周伤害性感受器，引发疼痛，并将痛信号级联放大，可形成外周神经敏化。外周敏化引发的痛信息经背根神经节Aδ和C纤维传入脊髓背角，即可引发中枢敏化。有研究报道，骨癌痛大鼠肿瘤骨组织神经传入的脊髓节段出现了伤害性刺激相关的神经化学变化，①星形胶质细胞显著活化，增生肥大。②神经元上的P物质受体自脊髓板层Ⅰ内化转移。③痛觉过敏相关介质c-Fos蛋白、强啡肽表达上调。④星形胶质细胞上的谷氨酸受体重摄体转运体减少，降解[80][81]Glu的兴奋性毒性的能力下降。据此可认为骨癌痛时存在外周传入神经敏化，并且上传至脊髓。其中，星形胶质细胞的活化对于骨癌痛中痛觉敏化的维持起重要[82][83-85]作用，活化的星形胶质细胞释放一系列的细胞因子IL-1、肿瘤坏死因子、TNF、[86-88]NGF、GDNF等，后者反过来作用于胶质细胞引起滚雪球效应，从而引发了中枢神经的痛觉敏化。3.2星形胶质细胞活化与骨癌痛胶质细胞是中枢神经系统结构中的重要组成成分，中枢神经系统中约90%的细胞都是胶质细胞，其中主要有星形胶质细胞和小胶质细胞。既往的研究发现胶质细胞功能多样，如神经元信号传递的分隔和绝缘;修复损伤神经元形成胶质瘢痕;参与突触形成，营养和保护神经元；但都局限于对神经系统的营养、支持、神经免疫及神经组织的发育与再生修复等，并不参与神经元之间的痛信息传递。近年的研究提出了新的观点，胶质细胞的活化在疼痛的形成和维持中起着十分重要的作用。有研究报道，在炎症痛模型上星形胶质细胞无明显激活;在神经病理性疼痛模型上星形胶质[89]细胞中等程度激活。在神经病痛理性模型中，没有观察到星形胶质细胞的增生和肥大等形态。骨癌痛模型大鼠在术后三周脊髓患侧全层尤其是背角浅层、V-Ⅵ层星[90]形胶质细胞大量增生和过度肥大，星型胶质细胞大量激活，胶原原纤维酸性蛋白[91]GFAP作为星形胶质细胞特异性标志物也被发现在此的大量表达。因而，星形胶63万方数据 新疆医科大学博士学位论文质细胞的大量激活也被认为是癌痛的一个特征性改变。由于星形胶质细胞在体内担负着营养、支持、维持神经组织的发育与再生的多种功能，星形胶质细胞表面表达各种神经活性物质的受体，如γ氨基丁酸、谷氨酸、乙酰胆碱、5-羟色胺、肾上腺素、肽类等等；星形胶质细胞可合成并分泌多种神经营养因子和生长因子，如GDNF,NGF,BDNF,神经营养因子3/4/5、表皮生长因子、IL-1、IL-6、等等。细菌、病毒以及各种神经伤害性刺激、神经调质，如SP、CGRP、ATP,EAA等均可活化星形胶质细胞，活化的星形胶质细胞肥大、增生，其标志物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)大量增多，同时，释放多种神经活性物质如IL-1,IL-6,TNFa,NGF,BDNF,GDNF,N0,PGs,EAA,ATP等等。上述神经活性物质可以反过来作用于胶质细胞或者神经元表面的相关受体，形成正反馈，使生物信息[92]放大，参与痛觉敏化的形成。同时引发神经元发生可塑性变化。这种神经活性物质的级联放大效应使痛信号不断的延续下去，很可能是痛觉敏化维持的分子基础。我们的免疫荧光染色结果显示星形胶质细胞阳性细胞主要分布在骨癌痛模型大鼠脊髓ⅠⅡ板层区，骨癌痛大鼠生理盐水组和空载体组星形胶质细胞阳性细胞数显著高于正常组、GDNFRNA干扰治疗组和吗啡治疗组，后三者之间没有显著性差异。脊髓ⅠⅡ板层区是伤害性刺激作用的门户，胶质细胞在其中表达多种神经递质、调[93,94]质和相关的生物活性物质的受体，如ATP,SP,CGRP，NGF，GDNF以及EAAs等，参与伤害性信息中枢敏化的过程。3.3GDNF与疼痛本研究选用的胶质细胞源性神经营养因子是Lin等在1993年首先发现，来源于神经胶质细胞，对多种神经元有明显的营养与促存活作用。后来的研究发现胶质细胞源性神经营养因子在疼痛调节中也有一定的作用。体内GDNF主要有两种来源：一是神经肌肉接头处的骨骼肌可以产生GDNF经神经末梢摄取并以受体介导的方式[95]经运动神经元轴突逆行转运；二是神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞都可以合成和分泌GDNF。既往的研究和我们的实验结果都证实了，脊髓胶质细胞在骨癌痛过程中被大量激活，明显增生，肥大。前述的伤害性刺激或者有效生物活性物质活化胶质细胞后，可以释放包含GDNF在内的大量的细胞因子、炎症介质以及神经活性物质的合成和释放呈滚雪球般放大。而这些物质又能反过来作用于脊髓胶质细胞，形成正反馈的效应，使痛信号被不断级联放大。据此推断,GDNF很有可能以这种方式参与了骨癌痛痛觉敏化的形成。骨癌痛的机制从宏观上来讲是神经的痛觉敏化，包括中枢神经敏化及外周神经敏化，从微观上来讲是形成神经敏化的各种分子信号通路。胶质细胞活化的正反馈效应是痛觉敏化形成的一个重要基础，GDNF是这条通路中的重要分子，GDNF与胶质细胞彼此作用，相互协同，带动其他炎症介质以及神经活性物质，如NO、肿瘤坏死因子、白介素-6、脑源性神经营养分子共同作用，64万方数据 第三部分·讨论将局部的外周敏化升级为中枢敏化。有研究表明，皮肤过表达GDNF大鼠出现明显的机械痛敏，未观察到显著的热[96]痛敏变化。使用基因技术敲除GDNFs受体GFRa2，可以显著缩短实验大鼠皮下注[97]射甲醛后的疼痛持续期，上述研究表明GDNFs及其受体在炎性疼痛的产生和维持中起推动作用。这种作用很可能是通过调节胶质细胞及相关的生物活性物质及其受体结构来完成的，如缓激肽，SP,CGRP,ATP,IL-1，IL-6等。这些生物活性物质可以作为刺激因素致敏初级感觉神经元外周末梢上的受体，或者活化胶质细胞形成痛敏。[98,99]同时,对炎性痛的研究发现GDNF也可以通过调控缓激肽B1受体、辣椒素受体(transientreceptorpotentialvanilloidtype1,TRPV1)[100-103]、ATP受体亚型[104][105]P2X3、SP、CGRP在神经元的表达实现对疼痛的调控。研究发现，GDNF也参与了神经痛的调节，但却表现出镇痛的效果。在神经痛的研究中发现，模型大鼠患侧脊髓背角浅层和DRG内发现GDNF及其受体GFRa1的mRNA的表达上调，GDNF阳性神经元数量也明显升高，而对侧脊髓却未见明显[106]变化。我国医学传统的针灸电+电刺激也是镇痛及麻醉的一种手段，电针对阿片类、单胺类等多种内源镇痛物质的调节被认为是其发挥镇痛效果的主要机制，目前[107]有人发现电针刺激也可能与调节GDNF的表达相关。多项研究表明，模型动物GDNF基因的过表达和外源性注入均可有效改善神经痛的痛敏症状。单次鞘内注射外源性GDNF，可有效逆转坐骨神经结扎引起的神经痛，但镇痛效果维持时间有限，[108]很快会出现痛敏复发。使用慢病毒或者单纯疱疹病毒载体实现GDNF的长期、大[109,110]量表达可为神经痛提供肯定的镇痛效果，减轻痛觉敏化的症状。相反，若使用反义核酸技术降低DRG内GDNF受体GFRa1的表达，则会出现疼痛加重，电针疗[111,112]效减弱的现象。GDNF在神经痛中的镇痛效果机制尚不确定，可能的有：①Ser蛋白激酶可能是[113]GDNF促进轴突生长，抑制A型纤维向脊髓背角芽生的镇痛通路。②NCAM可能是GDNF实现镇痛的另一个有效受体，研究表明NCAM的拟似物可以使神经痛症状[114]减轻，而NCAM的寡核苷酸技术则可明显阻断GDNF的镇痛效果。③GDNF家族可以通过介导内源性镇痛神经肽生长抑素系统的合成释放来实现对疼痛调质SP的[115]调节。④神经损伤引起的河豚毒敏感的钠离子通道α亚基的上调可以为GDNF逆[116]转，实现镇痛。目前GDNF在癌痛方面的研究尚未见报道，我们的研究结果显示，GDNF在骨癌痛的形成和痛敏的维持中起肯定作用，抑制GDNF表达可实现有效镇痛，强度与吗啡无差异。由于胶质细胞活化是骨癌痛的特征性改变，且两者间存在相互作用，所以GDNF的镇痛机制很可能与胶质细胞活化相关。综上，GDNF参与了炎性痛、神经痛及骨癌痛的调节，在炎性痛和骨癌痛表现65万方数据 新疆医科大学博士学位论文为致痛作用，在神经痛表现为镇痛效应。GDNF的主要作用靶的是胶质细胞和众多神经活性物质，其中胶质细胞的活化程度在这三种疼痛的反应各不相同，炎症痛模型上星形胶质细胞无明显激活;在神经病理性疼痛模型上星形胶质细胞中等程度激活[117]，骨癌痛模型上星形胶质细胞高度活化。分析结果认为，炎性痛的形成机制与炎性介质的合成分泌密切相关，所以非甾体类镇痛药有效。胶质细胞不是炎性痛的主要成因，因而未见脊髓胶质细胞的明显活化。GDNF与胶质细胞的作用可能在骨癌痛的形成中占主导地位，所以胶质细胞的活化表现最为突出，抑制GDNF的表达也就表现出镇痛效果。神经痛的形成中GDNF与胶质细胞的作用占有一定比例，但并非主导地位，因而仅表现出中等的胶质细胞活化。神经痛成因的主导因素还有待深入研究，这可能是GDNF在神经痛中表现为镇痛原因所在。这与疼痛本就复杂的机制相一致，它是多种因素作用形成的结果，这也是疼痛治疗困难的基础。3.4ERK通路与疼痛ERK通路属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)的成员，在哺乳动物细胞内广泛存在，主要参与细胞信号的转导。主要有ERK(ERK1/ERK2)通路、JNK通路、P38MAPK通路及ERK5这4名成员。其中，ERK1/2蛋白激酶发现于90年代初期，分子量分别为44kD和42KD，两者高度同源。最初的研究主要集中在生长因子信号通路，随着研究的深入，学者们发现ERK/MAPK[118-121]在痛觉过敏的产生和发展、长时程增强、学习、记忆等多种神经可塑性变化中[122]发挥重要作用。激活ERK后，可过三级酶促级联反应(Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2)磷酸化一系列底物，如转录因子、细胞骨架蛋白和，产生相应的生物效应。研究显示，ERK参与了痛敏的形成和维持，并且在外周敏化和中枢敏化中都起着十分重要的作用。外周敏化：动物实验的结的果显示，ERK参与了伤害性刺激信号的传递，背根神经节在刺激发生后的即刻即可检测到活化的PERK，持续10分钟左右回归正常水[123]平。离体培养的背根神经节细胞也可以检测到同样的变化。此外，还有学者报道炎症、损伤、或者其他伤害性刺激如弗氏佐剂均可引起初级传入神经元的PERK表达增高。有人以MEK抑制剂U0126反证也取得了支持的结果，预先给与U0126能够阻断背根神经节初级传入神经元在弗氏佐剂注射引发的PERK表达上调，以及炎性痛引发的痛觉敏化作用。神经损伤引起的神经痛动物模型也发生了一致的改变，痛敏被反转，并且未见明显的PERK表达上调。中枢敏化：学者们在脊髓背角的研究表明ERK也参与了中枢敏化的形成和相关信息传导。非伤害性刺激很难引起ERK的磷酸化，这种变化属于伤害性刺激特异性依赖的。将辣椒素注射至大鼠足底皮下，很快就可发现脊髓背角神经元出现了大量的PERK表达，并集中分布与伤害刺激传入侧的脊髓背角浅层。然而，触摸或者温66万方数据 第三部分·讨论感觉等非伤害性刺激并不能引发相应的变化。但是发生神经损伤后的小鼠，非伤害性刺激比如触摸也可引起脊髓背角神经元PERK表达的升高。也就是说发生了触诱发痛，形成了痛觉敏化。众多的研究表明，无论是炎性痛还是神经痛，只要存在伤害性刺激，神经元及胶质细胞中ERK就会磷酸化，并且可能与病理状态下的神经触诱发痛有必然联系。足底注射弗氏佐剂诱发的慢性炎症痛模型可观察到脊髓背角浅层出现持续的ERK激活以及P物质受体NK1和强啡肽的表达上调，预先鞘内注射MEK抑制剂U0126可以阻断大鼠的热痛过敏和机械痛敏，以及P物质受体NK1和[124]强啡肽的表达的上调。这说明ERK通路可以在基因转录水平调节中枢敏化的维125]持[。初级传入神经元与脊髓背角神经元通过突触联系，前者接受伤害性刺激后可引起疼痛相关调质SP、CGRP、谷氨酸等的大量释放，引发进一步的痛信息扩散。研究发现，坐骨神经部分结扎建立的神经痛的模型中可见脊髓背角内星形胶质细胞的活化，GFAP染色和磷酸化ERK的表达上调，免疫组化组发现两者共表达于星形胶质细胞，提示脊髓胶质细胞参与了神经痛的中枢敏化过程，该过程可能通过ERK通路完成信号传递。此外，SP的鞘内注射也发现有脊髓背角Ⅰ层神经元PERK表达的增加。研究显示，骨癌痛、炎性痛、神经性痛动物模型中均发现磷酸化ERK表达[126-128]上调，不仅在神经元中而且在胶质细胞中。神经元及胶质细胞的活化会释放大量的细胞因子、炎症介质以及神经活性物质，如SP，CGRP、脑源性神经营养分子和GDNF、NO、肿瘤坏死因子、白介素-6等等，而这些物质又能作为伤害性刺激反过来作用于脊髓神经元及胶质细胞，促进ERK的磷酸化，形成正反馈的效应，使痛信号被不断级联放大，形成难以控制的痛觉敏化。我们的研究结果显示，骨癌痛模型大鼠脊髓ⅠⅡ层PERK表达升高，阻断GDNF或者使用吗啡都可以翻转这一现象，同时阻断痛敏反转疼痛行为学的改变。3.5SP、CGRP与骨癌痛SP、CGRP是两个经典的神经调质，在炎性痛、神经痛、骨癌痛多种疼痛模型均有表达，参与疼痛的调控，痛敏的形成，同时两者还会彼此作用。我们的研究结果中显示，两者呈现一致的变化趋势，与伤害性刺激共存，并且可以为GDNF的RNA干扰治疗所阻断。P物质(SubstanceP,SP)是速激肽TK族的一员，可以与TK族的NK-1,NK-2和NK3三种受体结合，并且与NK1呈现高亲和力，以往的研究认为SP具有降血压和使平滑肌收缩的性能。后来发现SP广泛存在，功能多样，除了调节血压以外还参与了疼痛信号的传递和调节，以及免疫和炎症反应。SP在疼痛中的作用比较复杂，除了传递痛信号，还参与痛信息的双向调节，可能致痛也可能镇痛。伤害性传入末梢可以释放SP，进行信息的传递。SP大量的释放可能作用于感觉神经元引起痛觉敏化。然而，不表达SP的小鼠却比正常小鼠更容易发痛觉敏化。研究表明对不表达SP的67万方数据 新疆医科大学博士学位论文小鼠肌肉注射带有伤害性刺激的酸性物质后，其对疼痛的敏感性比正常小鼠显著增高，据推测可能与SP基因缺失引起的NK1缺乏结合物质相关。SP在中枢神经系统产生明显的镇痛作用，可以平衡由脊髓发出的伤害性痛信号，这可能是SP在脊髓后角产生前馈抑制的电位作用所形成的降钙素基因相关肽(Calcitoningenerelatedpeptide,CGRP)是1983年发现的来自降钙素基因的神经肽。降钙素基因在甲状腺滤泡旁细胞内表达生成降钙素，在神经系统和其它部位表达生成CGRP，CGRP与降钙素除了名字相似来源相通以外，其分子结构和生理功能完全不同。CGRP在机体内广泛分布，在疼痛调解中起重要作用。CGRP属于G蛋白耦联受体，与特异的受体结合后可激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP升高，通过第二信使cAMP的介导而发挥生物活性，是一种重要的生物活性肽。CGRP在中枢及外周神经系统都有分布，其中脊髓含量最高。CGRP阳性纤维在脊髓的分布与伤害性信号相关，多终止于脊髓后角浅层，后角深层仅有少部分分布，脊髓前角未见分布。同样，脊髓后角的浅层也广泛分布着CGRP受体，另外，CGRP受体在初级感觉传入纤维也有分布。实验表明，弗氏佐剂注射引发的炎性痛动物模型中，背根神经节高表达CGRP，镇痛治疗可有效降低CGRP的表达。脊神经结扎诱发的神经痛模型也呈现一致变化。反过来，使用鞘内注射CGRP拮抗剂可使痛阈显著提高。这提示，CGRP不仅与伤害性信号传递相关，而且可能参与痛敏形成。CGRP与SPSP主要分布于与痛觉传导有关的C类和Aδ类纤维,传递中等到高强度痛信息的递质，背根SP含量远高于腹根。它可以增加正常及被切断轴突的DRG神经元的内向电流，抑制外向电流，从而提高其兴奋性。研究发现，在急性坏死性胰腺炎引发的腹壁牵涉痛，脊髓背角神经元释放SP及CGRP均增加，伤害性刺激相关的原癌基因c-fos在L1节段的脊髓后角Ⅰ、Ⅱ层神经元表达增加，应用TRPV1拮抗剂以及鞘内注射CGRP8-37和SP受体拮抗剂SR140333都可有效可降低c-fos表达，从而减轻牵涉痛。CGRP与SP共存于DRG的初级传入神经元中，CGRP可以抑制与SP降解有关的内肽酶，使SP的作用增加或延长，CGRP还促进SP从感觉神经末梢释放，有加强SP和其他炎症介质形成水肿的作用，可见CGRP与SP在痛觉调制中存在协同作用。CGRP等神经肽类的突触前、后效应可提高脊髓背内兴奋性氨基酸作用，通过受体上的作用引起神经元兴奋性增强，这种兴奋性增加可受CGRP等神经肽的释放而易化，其结果是感受野的扩大，过度兴奋和抑制丧失的联合作用将进一步促进高兴奋性，并导致更强、时间更长的疼痛。CGRP与兴奋性氨基酸(excitatoryaminoacids,EAA)痛敏化的形成与脊髓伤害性信息传递通路中兴奋性氨基酸的释放及其受体的激活有关，兴奋性氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。在初级感觉传入中，谷氨酸主要是68万方数据 第三部分·讨论传入神经元递质，广泛分布于脊髓背角神经元突触前膜，突触后膜及感觉神经纤维末梢，而天冬氨酸则主要是脊髓中间神经元的兴奋性递质。应用离子透入技术发现CGRP能促进兴奋性氨基酸受体中的N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl–D-asperticacid,NMDA）受体和α-氨基羟甲基异恶唑(α-amino-3-hydyoxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate,AMPA)受体与其配体的结合反应[7]。NMDA受体与离子通道Na+、K+、Ca2+耦联，引起慢兴奋性突触后电位。AMPA受体与离子通道Na+、K+耦联，引起快兴奋性突触后电位，导致神经元快速的兴奋效应。从而导致脊髓传导易化，出现功能性的痛敏化。离体实验中，NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801、竞争性拮抗剂AP-5及非NMDA受体竞争性拮抗剂CNQX均可明显降低辣椒素诱导脊髓标本中CGRP的释放。用RT-PCR及免疫印迹技术证明，兴奋性氨基酸载体1(EAAC1)mRNA及其蛋白在脊髓DRG表达，免疫组织化学方法显示46.6%的DRG神经元是兴奋性氨基酸载体1阳性神经元，部分与CGRP或IB4共存[9]。在脊髓，EAAC1阳性细胞主要位于背角浅层，表明EAAC1可能通过突触前释放谷氨酸在伤害性信息传递和调制中发挥重要作用。CGRP与辣椒素1型受体(ransientreceptorpotentialvanilloidtype-1,TRPV1)目前已知辣椒素、热、酸、缓激肽(bradykinin,BK)及脂氧化酶代谢产物均可兴奋辣椒素受体。离体实验中，辣椒素能诱导灌流的脊髓标本CGRP释放，成年大鼠小剂量应用辣椒素可兴奋细纤维，皮内注射辣椒素通过激活脊髓背角蛋白激酶B/A信号转导通路而引起机械性痛敏化。同样，TRPV1拮抗剂BCTC能够明显抑制大鼠脊髓标本中辣椒素引起的CGRP及P物质样免疫活性物质释放。用WesternBlot方法证实，脊神经CCI结扎手术后第7、14天，受损同侧腰髓TRPV1蛋白水平较假手术组明显升高，且辣椒素诱导的CGRP样免疫活性物质释放也明显升高。CGRP与神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)神经生长因子属于神经营养因子，在胚胎、细胞发生过程中，NGF促进表达TrkA(tyrosinekinasereceptor)和p75NTR(p75neurotrophinreceptor)的神经细胞的存活及成熟，成年后，NGF信号系统的作用重点从调节神经存活转至对神经表现型和功能的调节，部分受体表达消失，转而表达GDNF及其相关受体，并持续至成年，其中具体的机制不明，可能与功能转变相关。神经元的胞体、胞质和突起都有NGF表达，非神经系统的组织器官也广泛表达NGF。研究表明，NGF参与成年动物的痛觉调制。伤害性刺激或神经损伤均可引起受损部位持续表达NGF数周以上，甚至形成痛觉敏化。神经系统的NGF注入可引起被根神经节中大神经元的和脊髓Ⅲ、Ⅳ层细胞表达CGRP上调。NGF与其高亲和力受体TrKA结合形成NGF-TrkA复合物，后者在神经元胞体通过蛋白激酶A和C途径刺激DRG神经元，引发其大量合成[129]CGRP。69万方数据 新疆医科大学博士学位论文BK是体内重要的炎症介质之一，缓激肽B(1)受体在炎性痛以及癌性痛的形成中起着重要作用，参与形成痛觉敏化。DRG神经元中CGRP阳性细胞常与缓激肽B(1)受体免疫阳性共表达，两者在炎性痛的形成中共同作用，互相协同，有助于痛信号的放大。高张液、高乳酸、低pH等环境因素可直接刺激含CGRP的神经兴奋,引起CGRP的释放增加，高乳酸可加强缓激肽和低pH引起的CGRP释放增多。综上所述，CGRP与其它神经递质或神经肽、激素、细胞因子或相关受体在参与伤害性刺激信息传递过程中共同发挥作用，并相互协调，互相影响，共同调制外周和脊髓水平的痛觉信息传递。3.6c-fos与疼痛c-fos原癌基因属于是一种即刻早期基因(immediatelyearlygene,IEG),传递细胞外信号引起细胞内目的基因的转录表达。既往的研究显示，c-fos基因作用广泛，主要参与细胞内信号的传递以及细胞的生长与分化的生理过程。c-fos基因参与痛觉调控，与其在中枢神经系统的表达相关。c-fos的表达可以认为是伤害性刺激引发神经元活化的标志，可以有效上溯参与反应的各级神经元的定位及传导通路研究。纵多实验证实，机械刺激、痛刺激、缺氧以及损伤都是引起c-fos基因的表达的有效刺激。甲醛注射引起的大鼠炎性痛造模后1小时即可在相应节段的脊髓灰质检出Fos免疫[130]阳性神经元，以及大鼠痛觉变化。这种变化可以被吗啡的预先注射所抑制，也可以被纳洛酮所拮抗。另有学者报道，Fos免疫阳性神经元在电针穴位刺激和甲醛注射模型也可观察到，同时伴随甲啡肤样免疫反应阳性在中脑导水管周围灰质的标记出[131]现。这表明电针刺激同时激活了内源性阿片肽和c-fos的表达。各种伤害性刺激均可引发神经系统表达c-fos，后者形成Fos-Jun/AP-1复合体介导疼痛相关活性分子如神经生长因子、神经肤Y、前强啡肤基因的发挥其生物效应。这些神经活性物质的激活对痛信号的处理可能会形成动物的疼痛学习、伤害记忆躲避。相关研究发现，大鼠脊髓基于各种伤害性刺激产生的c-Fos蛋白表达主要集中在脊髓背角的I、Ⅱ、V层。再次表明，c-fos作为伤害性感受神经元兴奋的标志物是可信的。进一步的研究表明，伤害性刺激引发的c-Fos蛋白表达机制可能与谷氨酸-NMDA受体系统、[132-134]GABA、NO以及钙离子通道相关。我们的研究结果表明，骨癌痛模型大鼠可出现脊髓相应节段的c-fos表达升高。镇痛治疗在扭转疼痛行为学改变的同时可以下调c-fos的表达。综上所述，神经调质不是一个单一的物质，它们广布于神经系统以及非神经系统，在不同组织环境中呈现不同的生物效应。它们并不独立，他们在同一水平，如外周神经，或者说脊髓水平横向联系，彼此作用，呈现正向或者负向调节，引起同一水平的痛信号放大。同时，它们存在纵向联系，痛信息从外周接受传入，在背根神经节处理后上传至脊髓水平，而后上传至大脑水平，然后在接受自上而下的痛信70万方数据 第三部分·讨论息调节。任何一种伤害性刺激都由整个信息网络处理完成，而不是单一的那条信号通路或者某个重要介质。我们的研究显示以胶质细胞为中心的信息网络，是一个正反馈系统，可以通过级联放大效应形成痛觉敏化，也可以找到有效目的基因，阻断反馈的痛信号。本研究中GDNF成功的做到了这一点，与此同时引发了一系列相关信息分子的变化，胶质细胞活化被抑制；痛觉调质SP以及CGRP被抑制；ERK通路被抑制；伤害性刺激的标志物c-fos的表达被阻断；方才引发痛觉行为学信息的逆转，达到镇痛的效果。本研究仍存在一定不足，由于GDNF在不同的疼痛种类中发挥不同的作用，那么如果在实验设计时增加一个GDNF基因过表达组将能从反面更好地验证研究结果。再者，临床骨癌痛的特点之一是暴发性疼痛，来去突然，疼痛剧烈，并且发生时间不定。患者们可以随时表达这种痛苦感受以便寻求治疗，但是实验大鼠不能诉说，我们只能用较为客观的疼痛行为学检测来了解这一变化。事实上，对大鼠疼痛行为学的检测只是预先设定好的不同时点，是一种间断性数据，不是24小时的连续检测，因而也就很难发现是否存在暴发痛的发生。关于这一点还有待于进一步深入的研究。71万方数据 新疆医科大学博士学位论文小结4.1大鼠胫骨注射乳腺癌肿瘤细胞复制骨癌痛模型，剔除疼痛行为学检测和/或影像学检测阴性的大鼠和死亡大鼠，本实验造模成功率71.6%。4.2生理盐水组、吗啡组、病毒空载体组及ISGDNF慢病毒重组体组注药后7d时各组机械痛结果无差异。注药后14d时，注射ISGDNF慢病毒重组体组机械痛阈值明显较生理盐水组及对照组延长，与吗啡组相比无差别。4.3热痛甩尾试验表明ISGDNF慢病毒重组体组和吗啡组注药后7d和14d时热痛觉阈值明显比生理盐水组和病毒空载体组延长。4.4WesternBlot检测结果显示GDNF干扰组GDNF蛋白量显著低于生理盐水组与正常大鼠，蛋白翻译相对表达量为各组最低。4.5免疫荧光染色结果显示骨癌痛组星形胶质细胞活化，GFAP表达，同时CGRP、SP、C-fos表达上调。ISGDNF慢病毒重组体组可有效逆转上述神经化学变化，减轻疼痛，可能与星形胶质细胞和相关的ERK通路活化被抑制有关。72万方数据 第三部分·小结结论本研究采用胫骨内接种MRMT-1乳腺癌细胞株的方法构建了大鼠胫骨骨癌痛模型，致瘤率70%左右，其行为学特征主要表现为显著的机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。疼痛行为学改变开始于术后第7，术后14-21天疼痛明显且稳定。部分大鼠死于肿瘤引发的恶液质，或者是免疫功能下降引发的致命感染。病理检查及影像学观察可见胫骨内肿瘤生长，骨质破坏为主的骨损害改变。脊髓GFAP染色可见术侧全层星形胶质细胞肥大增生。表明大鼠骨癌痛模型制作成功。慢病毒用于shRNA-GDNF的转染，效率高，滴度高，维持久。ShRNA的干扰效率高，特异性好。实验大鼠造模成功后鞘内给药，疼痛行为学检测结果显示与术前相比癌症大鼠和空载体组大鼠出现了显著的机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。与癌症大鼠和空载体组大鼠相比吗啡治疗组和GDNFshRNA组机械痛阈和热痛阈显著升高。治疗可有效缓解大鼠疼痛症状。在术后28天对骨癌痛大鼠腰膨大进行检测，癌症大鼠和空载体组大鼠脊髓荧光染色可见GFAP、P物质、CGRP较正常组明显增加，吗啡治疗组和GDNFshRNA组则GFAP、P物质、CGRP则较癌症大鼠和空载体组大鼠减少，说明星形胶质细胞在癌痛模型中大量活化，痛信息引发了相关分子的上调表达。Western-blot结果显示GDNF在GDNFshRNA组表达显著下降，RNA干扰技术有效，Lv-shRNA-GDNF重组体构建成功。ERK在癌症大鼠和空载体组大鼠脊髓明显活化，PERK表达升高。治疗组较之下调。c-fos呈现相同的趋势改变。提示以GDNFshRNA为癌痛治疗的靶标可以取得明显的疗效。伤害性刺激引起的胶质细胞活化、胶质细胞的ERK活化、生物活性物质（含GDNF、CGRP和SP等）的释放之间互相作用的级联放大效应可能是骨癌痛痛觉敏化的基础。GDNFshRNA的镇痛机制与阻断了这种正反馈反应相关。73万方数据 新疆医科大学博士学位论文致谢满含深情写下这页纸，心情不是感谢两个字就能表达的，但是最后还是会衷心地说一句谢谢！感谢导师王喜艳副教授对我的督促与宽容，作为如果没有导师对课题完成的督促以及宽容不可能有我今天论文的完成，在此还是要郑重的说一声：王老师，谢谢您。自投身王喜艳副教授门下起，时时感受到导师作为医生的医者仁心，作为教授的博学和精心，作为科学家的严谨治学及超前思维，导师的身上凝结了作为我毕生努力方向的优秀品质。虽然博士即将毕业，但在医疗中求索攀登的路还将继续，这难得的求学经历必将激励我不断努力，争创佳绩。感谢导师王廷华教授对我的指导和关心，以及提供了国家重点实验室这样一个宝贵的平台，这与我今天的成绩密不可分。他的博学和谦逊巧妙地结合，耐心和严谨无处不在，思考问题的方式灵活多变，这都是值得我学习和效仿的。感谢尹极峰、张文胜、维拉老师的无私帮助，你们虽不在课堂，却总让我受到教诲，得到进步，让我无论从为人还是处事上都学到了很多，谢谢！你们是撬动我世界的杠杆，让我充满信心和动力，以及成绩。我会继续努力！新疆医科大学三附院麻醉科刘亚华主任在博士学习期间对我工作、科研和生活的关心和支持。感谢新疆医科大学三附院麻醉科同事们在工作、学习中的鼎立支持。感谢华西神经生物实验室刘佳老师、徐扬同学、何沐同学在课题实施过程中给予的大力帮助。感谢新疆医科大学一附院的郑宏、李亦梅老师提出的建议，我会将这份感激铭记在心。感谢我院研究生科张茜、董雅丽老师以及研究生院田强老师给与的帮助！最后我要感谢我的家人，你们是我的精神支柱，是我在这世界上最宝贵的财富，谢谢你们的关心、支持与鼓励，才使我得以顺利完成学业！74万方数据 致谢参考文献[1]MundyGR.Metastasistobone:causes,consequencesandtherapeuticopportunities.[J].Cancer,2002,2(8):584-593.[2]PortenoyRK,LesageP.Managementofcancerpain.[J].Lancet,1999,353(9165):1695-1700.[3]ClohisyDR,MantyhPW.Bonecancerpai[J].Cancer,2003，97(3Supply):866-873.[4]MantyhPW.Cancerpainanditsimpactondiagnosis,survivalandqualityoflife.NatRevNeurosci2006;7(10):797-809.[5]Jimenez-AndradeJM,MantyhWG,BloomAP,FerngAS,GeffreCP,MantyhPW.Bonecancerpain.AmNYAcadSci2010;1198:173-81.[6]EatonMJ,BlitsB,RuitenbergMJ，etal.Ameliorationofchronicneuropathicpainafterpartialnerveinjurybyadeno-associatedviral(AAV)vector-mediatedover-expressionofBDNFintheratspinalcord.GeneThcr,2002.9(20):1387-1395.[7]SchweiMJ,HonorsP,RogersSD,etal.Neurochemicalandcellularreorganizationofthespinalcordinamarinemodelofbonecancerpain[J].JNeurosci,1999,19(24):10886-10897[8]MedhurstSJ,WalkerK,BowesM,etal.Aratmodelofbonecancerpain.[J].Pain,2002,96(1-2):129-140.[9]WalkerK,MedhurstSJ,KiddBL,etal.Diseasemodifyingandanti-nociceptiveeffectsofthebisphosphonate,zoledronicaridinamodelofbonecancerpain.Pain,2002,100(3):219.[10]FoxA,MedhurstS,CouradeJP,etal.Anti-hyperalgesic;activityofthecox-2inhibitorlumiracoxibinamodelofbonecancerpainintherat.Pain,2004,107(1-2):33.[11]Mao-YingQL,ZhaoJ,DongZQ,WangJ,YuJ,YanMFetal.Aratmodelofbonecancerpaininducedbyintra-tibiainoculationofWalker256mammaryglandcarcinomacells.BiochemBiophysResCommun2006;345(4):1292-8.[12]GoldenJP,BalohRH,KotzbauerPT,etal.Expressionofneurturin,GDNF,andtheirreceptorsintheadultmouseCNS[J].JCompNeurol,1998,398(1):139-150.[13]GoldenJP,DeMaroJA,OsbornePA,etal.Expressionofneurturin,GDNF,and75万方数据 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新疆医科大学博士学位论文综述胶质细胞源性神经营养因子家族与疼痛孟馥芬综述王喜艳王廷华审校胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactorGDNF)与neurturin(NTN)、persephin(PSP)和Artemin(ART)共同组成了GDNF家族(GDNFfamilyligands,GFLs)。研究发现它们在结构、功能、信号转导途径上有很大的相似性，在神经元的存活、生长、分化、神经再生、突触形成与突触可塑性以及神经退行性疾病中起重要作用，并且疼痛的形成中扮演着重要角色，对它的研究已成为目前神经科学领域中的重要课题之一。本文就GDNF家族与疼痛的研究作一简要综述。1GDNF家族简介GDNF是1993年Lin等首先从大鼠神经胶质瘤细胞株B49中发现并提纯的一种[1]神经营养因子，能有效地促进多巴胺能神经元的存活和分化。后来的研究发现GDNF在外周和中枢神经系统广泛分布，对多种神经元具有营养、保护和促损伤后修复作用。近来，越来越多的证据表明，GDNF可能在痛觉信号的传导和调制中起[2]重要的作用。GDNF与家族成员NTN、PSP和ART的一级结构都具有七个保守的、[3]相对位置相同的半胱氨酸残基，并具有相似的空间结构，核苷酸序列、氨基酸顺序也具有较高的同源性。这些半胱近残基所处的空间位置与所有转化生长因子β（transforminggrowthfactorbeta,TGF-β）超家族成员相同，但两者氨基酸序列的同源性不到20%，所以，GDNF家族只能算是TGF-β的远亲[4]，是TGF-β超家族的一个亚家族。这一家族神经营养因子在生理功能、受体、信号传导途径等方而都具有相似性。2GDNF家族及受体分布[4-6]GDNF家族在体内分布广泛。成年和发育中的大鼠，其纹状体、皮层、小脑、海马和脊髓中都有GDNF存在;在成人的纹状体、皮层、海马和脊髓中也检测到GDNF[5]mRNA;另外，新生大鼠中枢神经系统以外的组织如肾、肺、心、脾、肝、血液、[6]坐骨神经、睾丸、卵巢、皮肤、骨骼肌、肾上腺都有GDNFmRNA表达。NTN与GDNF类似，在体内呈广泛存在。原位杂交显示，发育期及成年小鼠的人脑皮层、纹状体、脑干、垂体等部位都有NTN表达，但GDNF表达水平较高的脊髓未检测到NTNmRNA,另外，在非神经系统如心脏、血液、肺、视网膜、嗅粘膜、输尿管、卵86万方数据 综述巢和肠道平滑肌等部位NTN表达水平也较高。这提示它们对于神经系统和非神经组织的发育及生理功能的维持具有重要意义。PSP与GDNF、NTN不同，仅RT-PCR在成年及胚胎大鼠的部分组织中发现PSP的低表达，原位杂交法尚未检测到。ART的分布介于GDNF、NTN与PSP之间。成人外周组织中垂体、胎盘、气管可见高水平表达的ART；胎儿的肾、肺也发现高水平表达的ART。GDNF家族的分布随发育时期变化而变化。由于神经元在发育、生长过程中，对营养因子的需求或敏感性有一个变化过程，这使得GDNF家族的分布在不同时期随着神经元的需求的变化而发生相应的变化，这种变化很可能对痛觉信息的传递具[7]有重要意义。[8]GDNFmRNA在生后当天的脊髓及出生后0-10天的纹状体中表达水平最高。[9]大鼠小脑GDNF在出生前很高而生后当天就已经检测不到。另有研究报道，约70%-80%的DRG的感觉神经元在胚胎期表达神经生长因子(NGF)的受体TrkA。这些神经元，包括了所有的小型神经元。它们中的大多数也同时表达与疼痛密切相关的降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质。在小鼠和大鼠出生后的3个星期内，约有50%的DRG的感觉神经元不再表达TrkA，而成年后则只有约40%-45%的DRG感觉神[10]经元表达TrkA。这些丢失了TrkA的细胞却能表达GDNF家族的受体Ret。同时，自胚胎发育后期至出生后的第一个星期，Ret在那些TrkA下降的神经元中的表达显著增加。从而表明，动物出生后DRG感觉神经元从对NGF的依赖逐渐转向对GDNF[11]家族的依赖，这种依赖一直维持至成年。3GDNF家族受体及信号转导经典的GDNF家族神经营养因子信号传递是通过复合受体途径实现的，复合受体由两部分组成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）锚定到细胞表面的蛋白分子，称为GDNF家族受体α（GDNFFamilyRecepteralpha，GFRα）,另一部分为原癌基因c-ret编码的产物蛋白RET，它是一种受体酪氨酸激酶。由于GFRα缺乏跨膜区及膜内区，单独无法信号传导。GNDF家族与GFRα特异结合之后，尚需跨膜蛋白Ret的介导，信号才能进一步传入细胞内。GFRα特异性地结合GDNF家族成员，促使RET磷酸化，磷酸化的RET激活其下游的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）等，导致一系列胞内途径的激活，从而发挥GDNF家族神经营养因子的生理功能。目前的研究表明GFRα至少有四种，即GFRα-1、GFRα-2、GFRα-3、GFRα-4。它们在中枢神经系统的分布并不完全相同，并且不同的受体与GDNF家族神经营养因子中不同的因子相结合，这种结合有交叉现象。GFRα-1分布最广泛，它在几乎所[12]有运动神经元都有表达。而GFRα-2只在部分运动神经元（25%）有表达。GDNF87万方数据 新疆医科大学博士学位论文依赖性运动神经元表达GFRα-1，而GDNF非依赖性运动神经元以GFRα2-4的表达为特征。GDNF非依赖性运动神经元对GDNF同类物neurturin、persephin及artemin[13]更敏感。尽管GFRα受体家族成员对4种配体均有亲和力，但其亲和力并不相同。GDNF主要结合GFRα-1，NTN主要结合GFRα-2，同时GDNF、NTN与受体的结合有部分交叉，GFRα-3只能与ART结合，ART也可以与GFRα-1少量结合，PSP只能与GFRα-4结合，与其他三者无交叉。研究发现RET基因的突变与人类的某些遗传病有关，如家族性的肾上腺、甲状腺瘤、多发性的内分泌腺瘤及先天性巨结肠症。RET基因敲除小鼠实验导致一系列严重表型缺陷，包括肾发育不全、完全缺失肠道神经组织，这些缺陷与GDNF缺失突变引起的缺陷相似，也提示RET在GDNF功能的发挥中起重要作用。大多数情况下，GFRα与RET受体酪氨酸激酶分布相同，均位于GDNF反应性神经细胞所在部位，如黑质和被盖腹侧多巴胺能神经元区、脊髓前面、舌下神经核、面神经核、动眼神经核、三叉神经核、展神经核运动神经元区，丘脑、红核、缰复合体、隔、小脑及脊旁神经节，在非神经组织，如牙齿、触须、肾脏、胃肠亦有显[14-15]著表达。在少数部位，如嗅束、齿状回、发育期纹状体腹侧、海马、内侧膝、内侧缰、顶盖等，GFRα与RET受体酪氨酸激酶分布亦有不同。这些部位未发现RET[16-17]mRNA的表达，却可见GFRα的大量表达。在鸡胚中枢神经系统及周围神经系统亦可见RET及GFRα在不同组织内独立表达。这表明，可能存在GFRα可利用的不同于RET的其他因子，或者存在其它以GFRα为受体的GDNF样配体。最近的研究表明在缺乏RET的细胞系及初级神经元中，GDNF可通过GFRa-l激活SFK，引起MAPK、PLC-γ、CREB等的磷酸化及c-fos的表达。但具体机制不明。另有报道表面神经细胞粘附分子（neuralcelladhesionmolecule，NCAM）很可能是GFLs的又一跨膜受体，参与了GDNF家族的信号传递，在诸如轴突生长、细胞迁移和突触可塑性等调节中发挥作用。NCAM是一种广泛存在于神经细胞膜上的介导细胞粘附、神经纤维束形成和促进突触的可塑性粘附分子，其主要功能是参与神经系统中突触重塑，而神经突触的重塑是病理性神经痛发生发展的重要解剖学基础。有报道显示，GDNF在GFRα-1的协助下与NCAM结合，引起NCAM胞内段结合的蛋白质酪氨酸激酶磷酸化，进而磷酸化粘激酶(focaladhesionkinase,FAK)，而磷酸化的FAK可通过常规信号启动丝裂原活化蛋白激酶信号通路。实验阻断NCAM后GDNF的镇痛作用减低，说明NCAM参与了病理性神经痛的发生和调制作用，GDNF-GFR-NCAM很可能是继经典的GDNF-GFR-RET外，另一条介导GDNF在疼痛中作用的信号通路。4GDNF家族与疼痛88万方数据 综述4.1GDNF家族与疼痛的分子机制DRG神经元接受外周初级感觉信息的传入，进而将之传送到脊髓等高级中枢。DRG主要含有两种神经元，即大神经元和中小神经元。大神经元轴索是有髓鞘的，传递一般躯体的本体感觉及触压觉，而中小神经元的轴索无髓鞘，传递一般躯体的痛温觉和一般内脏感觉。一般认为感受与传递伤害性刺激的神经是后者及其发出的薄髓或无髓细纤维，向脊髓背角灰质Ⅰ层投射。根据其生长依赖特点、表达递质与中枢投射特点可分为两类：①神经生长因子(NGF)依赖性神经系统：这类神经元均表达酪氨酸蛋白激酶TrkA和神经营养因子低亲和力结合蛋白P75，因此是NGF依赖性的，其功能可被NGF调控，均表达SP、CGRP等肽递质，向脊髓背角Ⅰ层和Ⅱ层外(背)侧部投射，其被投射神经元表达P物质受体NK-1，发出轴突经前白连合交叉至对侧，构成脊髓丘脑束，是传统的痛觉感受与传递系统。②GDNF依赖性神经系统：这部分神经可被IB4标记，表达GDNF受体GDNFRs和RET，尚未发现有SP、CGRP等神经肽的表达。因此被称为Ret+非肽类神经系统，发出纤维向脊髓背角Ⅱ层内(腹)侧部投射，传统认为是与非伤害性机械性感受器传入相关联的，但近来有文献报道这部分神经元也有和TrkA+神经元一样的外周游离神经末稍，其纤维也归类为Aδ纤维或C纤维，有许多证据显示该系统可能是与伤害性感受相关联的。另外，有研究发现ATP配体门控通道P2X3特异性分布于DRG的GDNF依赖性神经系统胞体与神经末稍，而不存在于NGF依赖性神经系统，其表达受GDNF调控，己知ATP是强烈致痛介质。还有学者报道坐骨神经损伤后DRG小神经元电生理发生明显变化，产生异位电活动及超兴奋，钠通道SNS/PN3和NaN上调，且与IB4+呈现相关性。NGF不能明显增加TTX-R钠流峰值，而GDNF则能使其峰值增加两倍，提示GDNF可以提高这部分神经元的兴奋性。以上研究结果均表明GDNF依赖性神经系统参与了伤害性传导和疼痛的形成。4.2GDNF家族与炎性痛使用基因技术敲除GDNFs受体GFRa2，可以显著缩短实验大鼠皮下注射甲醛后的疼痛持续期，GDNF也可以通过调控缓激肽B1受体、辣椒素受体(transientreceptorpotentialvanilloidtype1,TRPV1)、ATP受体亚型P2X3、SP、CGRP在神经元的表达实现对疼痛的调控。也有学者报道弗氏佐剂注射引起的慢性痛模型中arteminmRNA和NGF上调,neurturinorGDNF无变化。arteminmRNA的相应受体GFR3在DRG也上升，TRPV1与之表达定位一致。后爪注射artemin,neurturin,GDNF,orNGF均可[18]诱发痛敏。M.Fang发现弗氏佐剂注射引起的慢性疼痛模型中GDNF在DRG和脊髓的表达在下降，鞘内注射GDNF抗体显示出延迟的痛敏减轻，提示在疼痛的形成[19]中发挥了作用。ErikaK报道Artemin可诱发大鼠热痛敏及TRPM8依赖的寒冷超敏反应，其受体GFRα3在TRPM8感觉神经元亚群共表达。绝大多数的学者们认为89万方数据 新疆医科大学博士学位论文GDNFs及其受体在炎性疼痛的产生和维持中起推动作用。4.3GDNF家族与神经痛研究发现，GDNF也参与了神经痛的调节，但却表现出镇痛的效果。在神经痛的研究中发现，模型大鼠患侧脊髓背角浅层和DRG内发现GDNF及其受体GFRa1的mRNA的表达上调，GDNF阳性神经元数量也明显升高，而对侧脊髓却未见明显变化[105]。多项研究表明，模型动物GDNF基因的过表达和外源性注入均可有效改善神经痛的痛敏症状。单次鞘内注射外源性GDNF，可有效逆转坐骨神经结扎引起[20]的神经痛，但镇痛效果维持时间有限，很快会出现痛敏复发。使用慢病毒或者单纯疱疹病毒载体实现GDNF的长期、大量表达可为神经痛提供肯定的镇痛效果，减[21,22]轻痛觉敏化的症状。相反，若使用反义核酸技术降低DRG内GDNF受体GFRa1[23,24]的表达，则会出现疼痛加重，电针疗效减弱的现象。有报道显示鞘内注射GDNF在神经病理痛大鼠模型有镇痛作用。Boucher等将大鼠的一侧坐骨神经或腰部脊神经结扎后使用GDNF,结果显示GDNF可预防神经痛，同时发现手术前后给予GDNF均可逆转手术所引起的感觉异常，考虑GDNF可能通过阻止了神经病理性疼痛时河豚毒素敏感型钠通道的过度表达而发挥作用。神经鞘(膜)内应用GDNF能刺激具有止痛性质的生长抑素和神经肽的表达；同样体外培养的背根神经节加入GDNF后也能[25]增加细胞内生长抑素的含量。将有助于预防神经损伤的迟发型并发症。胡玉萍等的研究结果发现，CCI术后GDNF和NCAM的蛋白及mRNA表达变化与痛阈变化规律相关。CCI术后3d即在痛敏开始形成时，先鞘内注射NCAM相似肽C3d，再给予GDNF，与对照组相比其痛阈值升高，而先给予NCAM反义寡核昔酸后再给予GDNF，其痛阈值无明显变化，提示特异性阻断了NCAM的细胞外段使其不能与GDNF结合，GDNF的镇痛作用也消失，这就说明NCAM也参与了NP的发生和调制作用。4.4GDNF家族与皮肤、肌肉痛有研究表明，皮肤过表达GDNF大鼠出现明显的机械痛敏，未观察到显著的热[26][27]痛敏变化。AlvarezP等认为骨骼肌合成的GDNF可能是导致机械痛疼敏的关键分子。肌肉注射GDNF可引起剂量依赖的(0.1–10ng/20μl)肌肉痛，和长达三周的持续性疼。GDNF在急性及慢性肌肉痛中起媒介作用，可能是GDNF作用于IB4(+)的伤害感受器上的GFRα1受体所致。背根节神经元IB4阳性伤害感受受体封闭或用干扰RNA阻断GDNF受体GFRα1可阻止GDNF诱导的机械痛。肌肉生理记录显示局[28]部肌肉GDNF注射可增加腓肠肌机械痛觉过敏。ShioriMurase发现剧烈运动常引起延迟性肌痛，主要表现为肌肉机械痛敏，以前认为缓激肽上调NGF起了关键作用。现在发现GDNF和COX-2(cyclooxy-genase)也参与其中。COX-2mRNA在训练的肌肉中上升6-13倍，GDNF上调了7-8倍，运动前口服COX-2抑制剂可完全抑制肌肉90万方数据 综述痛敏的发展和GDNF的上调。同时，运动后肌注anti-GDNF抗体可部分缓解疼痛。疼痛可能通过PLCγ,MAPK/ERK,PI3K,CDK5在IB4+的伤害感受器完成信号转导。4.5癌痛目前尚未见相关报道。5小结综上，诸多证据显示GDNF参与了疼痛的形成和调节，但GDNF究竟在疼痛中扮演怎样的角色还存在很大争议，或许镇痛，或许致痛、或许不同的信号通路带来不同的结果？一切都还有待进一步的验证。91万方数据 新疆医科大学博士学位论文参考文献[1]LinLF,DohertyDH,LileJD,etal.GDNF:aglialcellline-derivedneurotrophicfactorformidbraindopaminergicneurons［J］.Science,1993,260(5111):1130-1132.[2]BoucherTJ,OkuseK,BennettDL,etal.PotentAnalgesicEffectsofGDNFinNeuropathicPainStates.[J].SCIENCE.2000,290:124-127[3]WoodburyD,SchaarDG,RamakrishnanL,etal.NovelstructureofthehumanGDNFgene［J］.BrainRes,1998,803(1-2):95-104.[4]RémyS,NaveilhanP,BrachetP,etal.DifferentialregulationofGDNF,neurturin,andtheirreceptorsinprimaryculturesofratglialcells［J］.JNeurosciRes,2001,64(3):242-251.[5]GoldenJP,BalohRH,KotzbauerPT,etal.Expressionofneurturin,GDNF,andtheirreceptorsintheadultmouseCNS.[J].JCompNeurol,1998,398(1):139-150.[6]GoldenJP,DeMaroJA,OsbornePA,etal.Expressionofneurturin,GDNF,andGDNFfamily-receptormRNAinthedevelopingandmaturemouse[J].ExpNeurol,1999,158(2):5042-528.[7]PavelievM,AiraksinenMS,SaarmaM.GDNFfamilyligandsactivatemultipleeventsduringaxonalgrowthinmaturesensoryneurons[J].MolCellNeurosci,2004,25:453-459.[8]ParatchaG,LeddaF.TheNeuralCellAdhesionMoleculeNCAMIsanAlternativeSignalingReceptorforGDNFFamilyLigands[J].Cell,2003,113(7):867-879.[9]SakaiA,AsadaM,SenoN,etal.Involvementofneuralcelladhesionmoleculesignalinginglialcellline-derivedneurotrophicfactor-inducedanalgesiainaratmodelofneuropathicpain[J].Pain,2008,137:378-388[10]LindforsPH,V?ikarV,RossiJ,etal.Deficientnonpeptidergicepidermisinnervationandreducedinflammatorypaininglialcellline-derivedneurotrophicfactorfamilyreceptoralpha2knock-outmice[J].JNeurosci,2006,26(7):1953-1960.[11]LeeYJ,ZachrissonO,TongeDA,etal.UpregulationofbradykininB2receptorexpressionbyneurotrophicfactorsandnerveinjuryinmousesensoryneurons[J].MolCellNeurosci,2002,19(2):186-200.[12]VellaniV,ZachrissonO,McNaughtonPA.FunctionalbradykininB1receptorsareexpressedinnociceptiveneuronesandareupregulatedbytheneurotrophinGDNF[J].JPhysiol,2004,560(2):391-401.[13]MalinSA,MolliverDC,KoerberHR,etal.Glialcellline-derivedneurotrophicfactor92万方数据 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综述攻读博士学位期间获得的学术成果1.论著[1]孟馥芬,维拉,王廷华.PENK基因过表达克隆载体构建及其功能意义.四川大学学报(医学版).同意用稿｡[2]孟馥芬,刘宏宇,刘亚华等.MRMT-1致骨癌痛模型脊髓内TRKC表达变化.新疆医学.同意用稿｡[3]孟馥芬,夏庆杰,维拉,王廷华.qRT-PCR检测中通过β-ActinCt值预测检测因子Ct值.新疆医学.2013,43(11):4-8.[5]孟馥芬,吉芳.右美托咪定在颅脑肿瘤手术全麻中的优化作用.2013天坛·国际神经外科麻醉论坛(TINAS2013).论文汇编.106-112.[6]孟馥芬,严睿.帕瑞昔布钠在老年患者无痛胃镜中的临床应用.可视化技术在临床麻醉中的应用.论文汇编.85.[7]孟馥芬,刘宏宇,李瑞光,维拉.帕瑞昔布钠复合丙泊酚在无痛纤支镜检查中的应用.新疆医学.2013,43(8):67-69.[8]孟馥芬,维拉,杨峰.曲马多伍用小剂量纳洛酮在术后镇痛中的应用效果.临床麻醉学杂志.2012,28(5):436-438.[9]维拉,孟馥芬,杨峰.帕瑞昔布钠在腹腔镜下宫颈癌根治术镇痛中的应用.临床麻醉学杂志.2010,26(12):1037-10392.项目[1]单纯疱疹病毒扩增子载体转移人前脑啡肽基因对大鼠癌性疼痛疗效的研究。主持项目，新疆维吾尔自治区科技厅自然科学青年基金。项目编号：2010211B13。起止时间：2010-05-01至2013-12-13。[2]右美托咪定对老年冠心病胸科肿瘤患者心肌氧供需平衡的影响。排名第二，新疆医科大学科研创新基金。项目编号：XJC201281。起止时间：2013-01-01至2014-12-31。[3]乳腺癌改良根治术术后急、慢性疼痛治疗的临床研究。排名第二，新疆维吾尔自治区卫生厅青年基金。项目编号：2013Y13。起止时间：2013-10-01至2015-10-01。95万方数据 新疆医科大学博士学位论文个人简历姓名：孟馥芬性别：女岁龄：34岁族别：汉族籍贯：河南学习以及工作经历：1997年考入新疆医科大学临床医学院麻醉方向，学士，学制5年。2002年考入新疆医科大学基础医学院，硕士研究生，病理生理学专业，学制3年。2005年至今新疆医科大学附属肿瘤医院麻醉科住院医师、主治医师。2009年1月～7月阿勒泰地区清河县人民医院下乡服务。2011年～至今新疆医科大学博士研究生，导师王喜艳、王廷华教授。96万方数据 综述新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名孟馥芬学号107601110518所在学院第三临床医学院导师姓名王喜艳，王廷华专业外科学研究方向麻醉、疼痛慢病毒介导的RNA干扰GDNF表达对大鼠乳腺癌致骨癌痛的论文题目疗效研究学术评语：癌痛在临床上十分常见，目前的治疗手段和治疗效果却十分有限。究其原因是因为癌痛机制不明。该研究从骨癌痛机制和可能的生物治疗方法切入，以期为骨癌痛的治疗寻求科学依据和新的方向。胶质细胞源性的神经营养因子（GDNF）是一种神经营养因子，新近发现其可能参与疼痛调控。多数研究显示，GDNF在炎性痛中起推动作用，在神经痛中起镇痛作用。骨癌痛是一种不同于前两者的特殊疼痛，目前，GDNF与癌痛之间的研究未见报道。研究设计以骨癌痛大鼠模型为对象，以疼痛调质GDNF为目的基因，采用RNAi技术特异性抑制GDNF的表达，借助慢病毒载体将其导入大鼠机体，探讨GDNF在骨癌痛中的作用，以及其可能的疼痛调节机制。研究结果显示GDNF参与了骨癌痛的调控，抑制其表达可能成为新的癌痛治疗手段。抑制星形胶质细胞活化，以及相关的信息通路的级联放大反应可能是其镇痛的基础。本研究为骨癌痛的发病机制的研究提供有力的实验证据，为今后的治疗提供了科学基础。本研究研究内容较多，研究方法得当，研究结果可靠，通过实验得出了自己的新见解，论文达到了研究生学位论文的水平，同意该生提交学位论文，并进行论文答辩！指导教师签字：年月日97万方数据