血管老化相关内皮细胞衰老机制的研究和益气活血中药干预作用

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1、血管老化相关内皮细胞衰老的机制研究与益气活血中药的干预作用摘要血管老化是促进心血管疾病发生的重要危险因素，随着我国老龄化社会的到来，对其进行深入的研究显得十分必要。血管内皮细胞不仅是血液与血管平滑肌之间的一层半通透性屏障，亦是一个活跃的内分泌器官，是全身和局部血流动力学功能及细胞增生调节的重要决定因素。研究已经表明，内皮细胞衰老是血管整体老化的重要病理改变之一：因此，内皮细胞一直是血管老化研究的重点领域。本课题组前期的相关研究取得了如下成果：AngII的诱导从mRNA和蛋白水平上调ATl和NADPH氧化酶p22pho

2、x的表达，介导细胞内活性氧水平的增高，可能是血管内皮细胞衰老的主要机制之一；氧化应激在血管老化的发生、发展中有着重要的作用。同时，益气活血中药人参、三七、川芎组方能够有效降低AngII信号通路的强度，减轻氧化应激损伤，具有显著的延缓血管内皮细胞衰老的作用；并且中药低剂量干预(20mg／L)的疗效更加突出。增殖停滞被认为是细胞衰老的重要特征。人体衰老时组织器官的结构和功能退化均与其细胞数量的减少关系密切，而细胞增殖则是维持细胞数量的关键环节。衰老细胞的增殖障碍既受细胞外信号的调控，又必须通过细胞内信号级联反应的介导，而

3、促使细胞周期的停滞。研究表明，细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CDI)的表达能够明显抑制细胞的增殖，是衰老细胞处理各种信息并作出相应应答的主要方式之一，这种控制生长发育的基因在细胞生命晚期发挥作用可能是促使其衰老的主要原因。过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPARY)是核受体超家族成员之一，其主要在脂肪组织、内皮细胞以及免疫细胞中表达，参与脂肪细胞分化、血管内皮保护、及机体免疫调节等多项生命活动，是胰岛素增敏剂噻哗烷二酮类药物作用的靶分子，是近年来心血管药理研究的热点之一。现已表明，PPARY可以直接作用于血管壁，阻断血

4、管硬化的进程。同时，PPARY办能够减轻血管内皮细胞的氧化应激损伤，促进其N0的合成与分泌，从而对内皮细胞发挥重要的代偿保护作用，并成为延缓血管老化和内皮细胞衰老的重要作用靶点。研究指出老化血管的结构重塑和功能退化直接改变了各种心血管疾病的发生阈值、进展速度和严重程度，是导致心血管死亡率增高的主要原因之二。老化相关的血管硬化不同于局灶性的动脉粥样硬化，它不与临床上的梗塞、出血和动中国中医科学院二00九级博士研究生学位论文脉瘤等疾病直接相关，而表现为血管全程的管壁增厚、弹性降低和内腔扩大，与相关脏器的功能不全和衰竭关系

5、更加密切。目前，评价血管老化程度最有临床价值的无创性检测方法是测定脉搏波传播速度(PWV)。血管老化促使血管壁增厚，僵硬度增加，顺应性降低，从而导致其PWV水平升高。国外研究指出，急性心肌梗死患者的PWV水平与其心血管死亡率密切相关，并且独立于先前的心血管疾病史、年龄和糖尿病等。因此，在前期工作的基础上，本研究旨在进一步从内皮细胞衰老的角度研究血管老化的发生机制和益气活血中药干预的作用途径；并以STEMI为疾病平台，探讨血管老化的临床意义和中医舌象特征。首先，继续以AngII诱导的衰老血管内皮细胞模型为研究对象，采用

6、低剂量益气活血中药干预，以从细胞增殖调控的角度，探讨其衰老的内在机制和中药的干预作用；其次，以PPARY为靶点，探讨其对衰老内皮细胞的代偿保护作用及其变化，并揭示益气活血中药干预的可能机制。再次，以PWV为检测指标，对血管老化与ST段抬高急性心肌梗死(STEMI)患者近期预后的相关性进行分层分析，并从舌诊的角度分析血管老化的中医特征。以期为血管老化的研究及中医药防治提供新理论、新视角和新靶点，也为将来从血管老化角度评估心血管疾病的预后提供新的思路。本论文主要由基础研究、临床研究和文献综述所组成。基础研究分为以下四个部

7、分：第一部分：AngII诱导血管内皮细胞衰老的特征改变目的：探讨AngII诱导血管内皮细胞衰老的细胞学特征改变。方法：从健康产妇分娩健康婴儿的脐带中分离、培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，作形态学和vWF荧光抗体染色鉴定，采用ECM完全培养基传代培养细胞至生长良好的第4代，同步化后进行实验，分为对照组和AngII组(10‘6mol／L)。选取AngII诱导后的24h和48h点进行动态观察，运用荧光显微镜观察细胞形态的变化，采用B一半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老，通过检测细胞培养上清中NO、eNOS的含量判断内皮细胞的

8、功能状态；利用CCK-8和流式细胞周期检测评价细胞的增殖能力。结果：与对照组相比，AngII组随诱导时间的延长，其细胞数量减少，胞浆区域增2血管老化相关内皮细胞衰老的机制研究与益气活血中药的干预作用大，细胞浆／细胞核比例增加，胞浆中可见较多颗粒或空泡；B一半乳糖苷酶阳性染色的细胞数量明显增加(p锄们)；上清中N0和eNOS的含量明显下降(p<口