毛蕊异黄酮对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机制研究

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1、毛蕊异黄酮对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机制研究TheeffectofcalycosinonCaenorhabditiseleganslifespananditsmolecularmechanism学科专业：微生物与生化药学研究生：路璐璐指导教师：周立军副教授天津大学药物科学与技术学院二零一七年五月万方数据万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使

2、用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据万方数据摘要毛蕊异黄酮(calycos

3、in)是一种黄酮类化合物，主要存在于黄芪的根中。目前报道的毛蕊异黄酮的药理作用主要涉及抗菌及抑制病毒作用,能够降血脂、降血糖、减少糖尿病并发症等。毛蕊异黄酮的抗氧化活性也逐渐引起人们的关注研究。但是，目前还未有关于毛蕊异黄酮的抗衰老研究报道。目的：以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，C.elegans)为生物模型，探讨毛蕊异黄酮对其寿命的影响及其内在的分子机制。方法：1.寿命分析实验：线虫同期化后长至L4期，而后转移至空白对照组和毛蕊异黄酮给药组逐天记录线虫寿命，评价毛蕊异黄酮对线虫寿命的影响并且筛选出

4、给药组中的最佳浓度。2.抗应激能力实验：利用百草枯或给予热刺激引发线虫体内的过氧环境，观察记录线虫的寿命变化，以此判断毛蕊异黄酮的抗氧化性。3.线虫体内活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)检测：检测毛蕊异黄酮对线虫体内ROS的清除能力以进一步说明毛蕊异黄酮的抗氧化能力。4.DAF-16和SKN-1的亚细胞定位实验：给药2h后观察记录DAF-16::GFP及SKN-1::GFP转基因线虫中DAF-16的亚细胞定位情况,以判断毛蕊异黄酮对线虫中的转录因子产生何种影响。5.突变株寿命实验：探讨毛蕊异黄酮对线

5、虫寿命影响可能的内在分子机制。6.分子机制实验：毛蕊异黄酮给药三天后提取线虫内总RNA，利用荧光定量PCR检测野生型N2中daf-16及下游相关基因sod-3、ctl-1、hsp-16.2以及daf-2(e1370)突变株中daf-16的表达量变化。7.咽泵实验：记录比较毛蕊异黄酮给药组与空白对照组线虫在1min内的咽泵次数以及限食通路相关突变株eat-2(ad1116)寿命实验，综合判断毛蕊异黄酮的延寿效果是否与热量限制途径有关。结果：1.寿命分析实验结果表明，毛蕊异黄酮在一定的浓度范围内可不同程度延长线虫寿命，且200μM

6、毛蕊异黄酮为最佳给药浓度并用作后续实验给药组。2.毛蕊异黄酮显著提高了野生型线虫在热、氧应激刺激下也就是体内过氧环境下的存活率，表明毛蕊异黄酮的抗氧化活性与其延长线虫寿命有关。3.毛蕊异黄酮明显降低了线虫体内ROS的水平，进一步说明其抗氧化性与延长寿命有关。4.在分子机制研究中，毛蕊异黄酮不能延长daf-2(e1370),age-1(hx546)及daf-16(mgDf50)突变株的寿命，说明其延寿功效是通过胰岛素信号通路实现的，另外，毛蕊异黄酮提高了N2中的daf-16的mRNA水平而对daf-2(e1370)中daf-16

7、的mRNA水平无影响则进一步说明毛蕊异黄酮延长线虫寿命与胰岛素信号通路有关。5.毛蕊异黄酮不能延长daf-16(mgDf50)突变株的寿命却对skn-1(zu169)突变株保持延寿功效，再者，毛蕊异黄酮能够提高N2中DAF-16的入核水平而对I万方数据SKN-1无影响，说明毛蕊异黄酮延寿功能主要是通过DAF-16这一转录因子实现的。毛蕊异黄酮大大提高了daf-16下游的sod-3,hsp-16.2,ctl-1的水平，表明毛蕊异黄酮激活了转录因子DAF-16并提升了抗应激基因的表达。6.毛蕊异黄酮能够延长unc-43(n1186

8、)突变株的寿命说明其延寿作用与unc-43无关。7.毛蕊异黄酮对N2线虫的咽泵频率无明显影响，并能延长限食通路相关突变线虫eat-2(ad1116)的寿命，从而确认毛蕊异黄酮的延寿作用不是通过热量限制途径实现的。结论：以线虫为生物模型，初步探索了毛蕊异黄酮的延寿功效及其内在的