基于转录组测序筛选及克隆棉花抗黄萎病相关基因

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1、密级:论文编号:中囯农业科学按:基于转录组测序筛选及克隆棉花抗黄萎病相关基因ScreeningandCloningResistanceGenestoCottonVerticilliumWiltBasedootheTranscriptomeSequencing硕士研宄生.•邵冰欣指导教师：王红梅研究员申请学位类别：农学硕士专业：彳词如^传育种研宄方向：_麵對专育和娌论与方^培养单位：中国农獅花研究所中国农业科学院研宄生院2015年6月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文基于转录组测序筛选及克隆棉花抗黄萎病相关基因ScreeningandCloningResistanceGenestoCo

2、ttonVerticilliumWiltBasedontheTranscriptomeSequencing硕士研究生：邵冰欣指导教师：王红梅研究员申请学位类别：农学硕士专业：作物遗传育种研究方向：作物遗传育种理论与方法培养单位：中国农业科学院棉花研究所中国农业科学院研究生院2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationScreeningandCloningResistanceGenestoCottonVerticilliumWiltBasedontheTranscriptomeSequencingM.S

3、.Candidate：ShaoBingxinSupervisor：Prof.WangHongmeiMajor：CropGeneticsandBreedingSpecialty:TheoriesandMethodsofCropGeneticsandBreedingJune2015本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研

4、究生签名时间：pAS年：月pH关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，5卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名时间：7^夕年1月>円导师签名:时间：>(7丨$年6月/闩答辩主席摘要棉花黄萎病严重影响棉花的产量和品质，阻碍了我国棉花的生产发展。随着分子生物学和基因工程的快速发展，利用生物技术研究棉花抗黄萎病机制和克隆与棉花抗黄萎病相关基因已经成为当前研究热点。本研究利用本课题已

5、构建的黄萎病菌诱导的棉花转录组数据库，结合在棉花D基因组中鉴定的抗病R基因筛选出与棉花抗黄萎病相关的候选抗病基因，并通过荧光定量PCR分析其在黄萎病菌诱导后的表达趋势。从候选抗病基因中选择两个GbDRP66319和GbHIR42734进行基因克隆、生物信息学分析，并通过VIGS技术初步验证其功能。研究结果如下：1、在本课题已经获得与棉花抗黄萎病性状显著关联的分子标记两端800kb范围内寻找含有NBS-LRR类R基因共64个，以R基因比对黄萎病菌诱导的转录组数据库，获得与之高度同源的Unigenes，从中选择显著差异表达的24个Unigenes进行荧光定量PCR，其在黄萎病菌诱导后的表达趋

6、势，结果显示黄萎病菌诱导后相比对照表达量总体呈上调，但是不同基因的表达模式又存在差异。大致可总结为两种情况：一种是诱导4h后上调表达，即瞬时基础防御；另一种情况是在诱导12h后上调表达，即滞后特异性防御。2、本文通过同源基因克隆法，对GbDRP66319和GbHIR42734的编码区进行克隆，测序结果显示GbDRP66319基因的CDS编码区为879bp，编码292个氨基酸。通过TMHMM软件分析跨膜结构域，该蛋白没有跨膜结构域。GbDRP66319与棉花A和D基因组数据库比对，获得29个同源基因，根据SMART等软件分析保守结构域，结果显示其含有P-loop，Kinase2，Kinas

7、e3，GLPLandMHDL五个motifs，以及LRR_BAC，LRR_CC和LRR_TYP等抗病基因的保守结构域。GbHIR42734CDS编码区为855bp，编码284个氨基酸。通过TMHMM软件分析跨膜结构域，该蛋白没有跨膜结构域。GbHIR42734与棉花A和D基因组数据库比对，获得6个同源基因，该类蛋白均含有植物过敏反应诱导的家族蛋白的保守结构域SPFH（Stomatins、Prohibitin、Flo-tillins、