人外泌汗腺细胞的生物学特性及其ips细胞向汗腺分化的研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目人外泌汗腺细胞的生物学特性及其iPS细胞向汗腺分化的研究迹会田木pq,11»、研究生姓名张学光指导教师姓名免疫学专业名称干细胞与皮肤损伤修复研究方向2015年4月论文提交日期苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：樣

2、会良曰期：ZolS.iU苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年—_月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：MM_日期:WC.I-

3、U)导师签名：曰期：浏、人外泌汗腺细胞的生物学特性及其iPS细胞向汗腺分化的研究中文摘要中文摘要大面积皮肤严重烧伤的救治是目前亟待解决的医学和社会问题。全国每年近千万人的烧伤病人，近万人严重烧伤，其中约10%的严重烧伤病人由于缺乏皮源尚无法挽救其性命。严重烧伤获救的病人由于无汗腺功能的疤痕组织取代皮肤使其终生丧失正常皮肤功能，严重影响病人的生活质量。汗腺是人体皮肤组织中重要的功能性附属器，汗腺可分为顶泌汗腺即大汗腺，和外泌汗腺即小汗腺。一般所说的汗腺是外泌汗腺，在调节体温、分泌汗液及排出人体部分代谢废物的过程中发挥重要的作用。外泌汗腺是单管状腺，分为分泌部和导管部，分泌部位于

4、真皮层或皮下组织内，是盘曲成团的小管，而导管部开口于表皮层，连接分泌部和外界环境。汗腺的发育开始于胚胎时期14-16周，至24周基本成熟，出生之后不会有新生的汗腺组织形成。皮肤组织修复和功能重建在国内和国际上都是生物医学领域研究的核心和热点。轻度烧伤时，汗腺的导管处细胞可以其深部未受损的部分为模版从而重建汗腺被损坏的部分；但全层皮肤大面积深度烧伤时，由于汗腺组织被毁，则不能依赖细胞的分裂、增殖与终末分化来自我更新而重建其复杂结构。至今尚无有效的方法体外扩增人汗腺细胞，对其生物学特性知之甚少。同时，干细胞可以定向分化为并构建具有覆盖保护能力的表皮层组织；也有研究表明干细胞可以定

5、向分化为具有汗腺细胞表型的汗腺样细胞，但是对于汗腺组织的功能性重建还未见报道，且干细胞分化为汗腺样细胞的具体机制尚待探讨。本研究皆在建立人外泌汗腺细胞体外分离和培养方法，并分析其生物学特性，在此基础上，通过构建人汗腺细胞来源的iPS细胞，根据iPS细胞具有来源细胞的记忆性这一特性，开展汗腺细胞来源的iPS细胞分化为汗腺样细胞的研究，探讨其分化的关键分子机制，为其他类型干细胞分化为汗腺样细胞提供理论基础，使汗腺的功能性重建和功能性皮肤修复成为可能，提高大面积烧伤病人救治后的临床疗效，具有研究的创新性和潜在的应用价值。I中文摘要人外泌汗腺细胞的生物学特性及其iPS细胞向汗腺分化的

6、研究第一部分人外泌汗腺细胞体外分离和培养及其生物学特性的鉴定目的：建立体外分离、提取、培养和纯化人外泌汗腺细胞的方法，并对其生物学特性进行鉴定。2方法：将人皮肤样本除去脂肪和结缔组织，剪成1mm的小块，用分散酶于4℃消化18小时，第二天取出后用PBS漂洗。用镊子将真皮层与表皮层轻轻分离，真皮层用剪刀剪碎，加入IV型胶原酶于37℃消化1小时，然后在倒置显微镜下使用移液枪将游离的汗腺组织吸出。在6cm的培养皿中先预先铺一层鼠尾胶原，将汗腺贴于预铺了胶原的6cm细胞培养皿中，一个小时后加入汗腺细胞培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。2-3d后，汗腺细胞从汗腺组织中长出。倒

7、置显微镜观察人外泌汗腺细胞形态；免疫组化方法对比不同部位来源皮肤汗腺数量的多少；透射电镜观察皮肤样本汗腺细胞的细胞器结构；PCR分析汗腺细胞胚胎干细胞标记和角质化细胞标记；免疫荧光染色技术检测体外培养的汗腺细胞的标志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表达。结果：（1）光学倒置显微镜下观察人外泌汗腺，游离出来的汗腺组织可以观察到盘曲成球的分泌部和较直的导管部；贴壁培养后可见汗腺上皮细胞从汗腺组织中生长出来，呈典型的上皮细胞样，排列紧密，类似铺石路状，细胞边界明显，核清晰，具有一定的增殖能力；（2