人脐带间充质干细胞向汗腺细胞诱导分化及向裸鼠移植的研究

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中文摘要人脐带间充质干细胞向汗腺细胞诱导分化及向裸鼠移植的研究摘要目的：人脐带间充质干细胞(uc．MSCs)具有向多种成熟细胞分化的潜能，如成软骨细胞、成骨细胞、神经细胞及成脂肪细胞等，其分离、培养较为容易，纯度高，且来源丰富，可在体外多次扩增，异体移植免疫排斥风险小。由于UC-MSCs具有以上的优点，使其逐渐被研究者所关注，尤其是在组织的修复方面，可以将其应用于器官、组织的修复及重建。本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离，在不同条件下的培养及鉴定，得出培养人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过间接共培养的诱导方式使其向汗腺细胞定向诱导分化，将诱导后的UC．MSCs用BrdU进行标定，移植入裸鼠皮肤，观察其在裸鼠体内的存活及分布状况。方法：1UC-MSCs的分离、培养和鉴定：获得无菌足月剖宫产健康胎儿脐带，剪刀将其剪成3-4em长短的脐带组织段，生理盐水反复冲洗，去除残留的血液，剪刀将其剪开后镊子剔除脐带中的两条脐动脉、一条脐静脉，以免被血管内皮细胞所污染。用镊子将脐带中的沃顿胶组织(Wharton’SJelly)呈条索状撕裂下来，剪刀剪成大小约lmm3的沃顿胶组织块，置于培养瓶中培养。当细胞长满瓶底后，0．25％胰酶消化贴壁细胞，进行传代。流式细胞术检测培养细胞的表面抗原表达情况。2UC．MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：用MTT比色法分别检测不同胎牛血清浓度在490rim处吸光度值的均数(OD值)。同样用MTT比色法分别检测当种植密度不同时在490nm处吸光度值的均数(OD值)。观察传代后不同时期UC．MSCs的生长情况，绘制生长曲线。3汗腺细胞(h-SGCs)培养：将所取正常全层皮肤，去除皮下脂肪后，剪成lmm3大小组织块，用II型胶原酶消化法获得汗腺组织，培养汗腺细胞m．SGCs)贝3壁生长；大部分汗腺团块贴壁后，进行换液，此后3。4天换液一次。对培养细胞进行免疫组化检测CEA和CK7表面抗原的表达情况。4UC．MSCs诱导分化及鉴定：将培养的汗腺细胞进行47℃水浴造成 中文摘要体外热休克，通过传三代(p3)UC—MSCs间接共培养诱导UC．MSCs分化为有汗腺表型的干细胞，免疫组化法检测CEA和CK7表面抗原的表达情况。5对诱导后干细胞进行核型分析：将诱导后细胞加入秋水仙素0．2mg／L一滴，低渗固定消化等处理，进行细胞染色体检测。6BrdU转染及鉴定：在传3代(p3)UC—MSCs中加入BrdU抗原401上g／ml用来标记培养基，48h后，可见UC．MSCs生长良好，悬浮细胞少，铺片用免疫组化法检测转染情况。7将诱导分化后的细胞进行裸鼠移植：将诱导分化后的UC．MSCs进行BrdU标定，与人脱细胞异体真皮共同覆盖在裸鼠缺损皮肤创面上，覆盖异体裸鼠皮片，打包固定。2周后将包与缝线拆除，1个月后取活检，进行HE及免疫组化检测。移植后连续观察实验鼠3个月。结果：1UC．MSCs分离、培养、鉴定：培养3．5d后，已有少量脐带组织块周围爬出成纤维样细胞。一周后，可见部分组织块周围爬出成纤维样细胞，给予换液。之后2．3天给予换液一次，传1、2代(p1、P2)的UC-MSCs呈长梭行，形态均一。培养至传八代细胞伊8)，UC．MSCs仍然存活，但生长缓慢，形态开始发生变化，折光性变得较差，部分细胞已开始脱壁凋亡。对分离培养的UC．MSCs进行流式细胞术检测，干细胞表面标志物CD29、CD44、CDl05表达率较高，造血干细胞表面标志物CDl4、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞为较纯化的MSCs。2UC—MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：当胎牛血清浓度为10％时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多。当种植密度为105／ml时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多。绘制的细胞生长曲线包括滞留期、生长对数期、平台期。3汗腺细胞(11．SGCs)培养：培养3天后，已有汗腺贴壁，镜下可见汗腺团块周围爬出不规则形细胞，呈集落状生长；培养7天后，大部分汗腺团块贴壁，给予换液；12天后，镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞，呈铺路石样生长。4UC．MSCs诱导分化及鉴定：将诱导分化后的细胞进行免疫组化检测细胞特异抗原，CEA和CK7包浆染色均为红棕色，为阳性。 中文摘要5对诱导后干细胞进行核型分析：镜下随机观察30个细胞的染色体，计数染色体条数，结果染色体数均为46条，均未见染色体变异。6BrdU转染及鉴定：免疫组化检测结果可见部分细胞核呈棕黄色。7将诱导分化后的细胞进行裸鼠移植：HE染色可见脱细胞异体真皮中细胞均匀分布。免疫组化检测BrdU抗原表达情况，可见BrdU标定的诱导后干细胞均匀分布在人脱细胞异体真皮中。结论：本实验通过研究人脐带间充质干细胞分离，在不同条件下的培养、诱导及鉴定，得出培养人脐带间充质干细胞的最优培养条件。并进一步通过间接共培养的诱导方式使其向汗腺细胞分化，将诱导后的UC—MSCs用Br(1U进行标定，移植入裸鼠皮肤，观察其在裸鼠体内的存活及分布状况，得到以下结论：1流式细胞术检测培养细胞的表面标志物CD29、CD44、CDl05表达率较高，造血干细胞表面标志物CDl4、CD34、CD45几乎不表达，提示本实验培养得到的细胞较纯，可以用于实验研究。2实验中我们发现最适宜UC．MSCs生长的环境为含lO％胎牛血清和90％DMEM(L)I拘培养液，最适宜UC．MSCs生长的种植密度为105／m1。UC．MSCs生长呈现先慢后快再慢的S型曲线，实验中我们可以发现P3以内的UC．MSCs形态稳定、适应性强、代谢旺盛，可用于后续实验研究。3经鉴定，诱导后干细胞免疫组化检测CEA和CK7表面抗原均为阳性，提示诱导后干细胞己具备汗腺细胞表型。4染色体检测结果显示，此间接共培养诱导方式对染色体核型无明显变化，为安全、可靠诱导方式。5经检测，BrdU转染为成功的。6动物实验证实：诱导分化后的人脐带间充质干细胞移植在裸鼠缺损皮肤上安全、有效。移植后连续观察实验鼠3个月，未发现有不良反应。关键词：人脐带间充质干细胞(uc—MSCs)：汗腺细胞(11一SGCs)；诱导分化；间接共培养；染色体。 英文摘要StudyoninductivedifferentiationfromtheHumanUmbilicalCordMesenchymalStemCells(uc--MSCs)totheHumanSweatGlandCells(h—SGCs)andtheirtransplantationonNudeMiceABSTRACTobjective：111ehumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(uc—MSCs)havethepotentialtodifferentiatetoavarietyofmaturecells，suchaschondrocytes，osteoblasts，nervecellsandadipocytesandtheprocedureforcellseparationandcultureisrelativelyeasy．UC—MSCscanbeobtainedthroughvariousresourceswithhighpurity，multipliedinvitroamplificationtimesandlowerriskonallograftimmunerejection．Duetotheirabove—mentionedadvantages，theusageofUC—MSChasarousetheinterestofresearchers，particularlyintermsoftissuerepair,inwhichmeycanbeusedfortherepairandreconstructionoforgansandtissues．ThisexperimentaimstoderivetheoptimalcultureconditionsforUC—MSCsbymeansofstudyingontheUC-MSCscellseparationthroughtheirculture，inductionandidentificationunderv撕ousconditions．InductivedifferentiationfromUC-MSCstosweatglandcellsthroughindirectCO—culturehasalsobeenachieved．111einduced，BrdUcalibratedUC-MSCsiSthentransplantedintothenudemiceskinandtheobservationoftheirsurvivalanddistributioninthemice．Methods：1Separation，cultureandidentificationofUC-MSCs：cutthesterilized，healthyfull-termcesareanfetalumbilicalcordintoumbilicalcordtissuesegmentwithlengthof3—4cmandwashingrepeatedlywithsalinetoremovetheresidualblood．Removewithtweezersthetwoumbilicalarteriesandoneumbilicalveinaftercuttingtheumbilicalcordopentoavoidcontaminationbythevascularendothelialcells．TeardowntheWharton’SJellyfromtheumbilicalcordintheshapeofstreakandscissorsthemintoWharton’SJellytissueblocksbylmmjandthenplacethemincultureflask．Use0．25％4 trypsindigestiontoadheretothecellsforpassagingwhenthecellsgrowfullofbottom．Flowcytometryisusedtodetectthesurfaceantigenexpressionincellsbeingcultured．2DrawingofaffectinggrowthfactorsgrowthcurveofUC．MSCs：UseMTTassaytodetectthemean(theODvalue)ofdifferentconcen删onvaluesoffetalbovineserumat490nmabsorbancevalues．UseMTTassaytodetectthemean(theODvalue)ofat490nmabsorbancevdlueswhent11eplantingdensityvaries．ObservingthegrowthofUC．MSCsindi缅删periodsafterpassageanddrawthegrowthcurve．3Cultureandidentificationofthehumansweatglandcellsm．SGCs)：Cutthenormalfull—thicknessskinintoorganizationsblocksbylmm3aftertheremovalofsubcutaneousfat；obtaintheglandtissuesbymeansofcollagenasedigestionIIandculturingthesweatglandcells(h-SGCs)adherentgrowth；changetheculturemediumwhenmostofthesweatglandsclumpsbecomeadherentwiththefollowingmediumchangingwiththeintervalof3-4days．ProcessthecellsbeingculturedbyimmunohistochemistryanddetectingtheCEAandCK7surfaceantigenexpression．4InduceddifferentiationandidentificationofUC．MSCs：Use47℃waterbathingtothesweatglandcellswatertorenderthemwithinvitroheatshockandusepassthreegenerations①3)UC-MSCstoindirectlyCO—culturingUC-MSCsinordertoinducethemtodifferentiateintothestemcellswithapocrinephenotypeandthenprocessingthembyimmunohistochemistryanddetectingtheCEAandCK7surfaceantigenexpression．5Makingkaryotypeanalysisoftheinducedstemcells：Jointheinducedcellswithonedropofcolchicinewithconcentrationof0．2mg／Landprocessthemwithhypotonicfixeddigesttoimplementchromosomedetection．6BrdUtransfectionandidentification：ApplyBrdUantigenof40pg／mltothepassage3①3)UC—MSCsinordertomarkthemediumandifUC-MSCsgrowwellafter48hrswithfewsuspensioncells，measurethe 英文摘要transfectionbyimmunohistochemistryassayusingstretchedpreparation．7transplantingtheinductivelydifferentiatedUC—MSCsinnudemice：processtheinductivelydifferentiatedUC—MSCswithBrdUcalibrationandcoverthemonthedefectintheskinwoundofthemicealongwiththehumanacellulardermalSOastocoverallogeneicskingraitofthemiceandthenfixbypackaging．RemovethepackageandthesutureaftertwoweeksandmakethebiopsyafteramonthinordertocarryouttheHEandimmunohistochemicaldetection．Continuousobservationofmice3monthsaftertransplantation．Continuouslyobservethemicefor3monthsaftertransplantation．Results：1Separation，cultureandidentificationofUC．MSCs：fibroblast-likecellshaveclimbedoutaroundafeWumbilicalcordtissueblocksafterthecultureof3—5days．Aweeklater,fibroblast．1ikecellshaveclimbedoutaroundthevisiblepartofthetissueblockandthemediumchangehasbeenimplemented．，nleintervalforchangeis2-3days．Passage1或and2们generation(P1，P2)oftheUC—MSCselongatebobbinrowwithmorphologicaluniformity．111epassage8m0'8)UC—MSCsarestillalive，butslowingrowth，andtheshapechangesandtherefractionbecomespoor．Somecellshavebeguntotakeo行thewallapoptosis．MeasuringresultsofseparatelyculturedUC．MSCsbyflowcytometryisthatthestemcellsurfacemarkersCD29，CD44，CD105havehigherexpressionrate；hematopoieticstemcellsurfacemarkersCD14，CD34，CD45almosthavenoexpression，whichindicatesthecellsculturedinthisexperimentarerelativelypurifiedMSCs．2DrawingofaffectinggrowthfactorsgrowthcurveofUC．MSCs：Mt丌colorimetricassayOD490valuetopsamongtheresultswhentheconcentrationofthefetalbovineserumis10％withhighcellactivityandmorelivingcells．1hecellgrowthcurvedrawnincludesretentionperiod,growthlogarithmicphaseandplateau．3Cultureandidentificationofthehumansweatglandcellsm．SGCs)：After3daysofculture，therewereadherentsweatglandsandsomecellsin 英文摘要irregularshapeshadclimbedoutaroundsweatglandsclumpsinthemannerofcolony-likegrowth；after7daysofculture，mostofthesweatglandsagglomerateshadbecomeadherentandthemediumwasthenchanged；12dayslater,thesweatglandsclumpshadbeensurroundedbyirregularcellsinamannerofcobblestone—likegrowth．4InduceddifferentiationandidentificationofUC—MSCs：processtheinductivelydifferentiatedcellswithimmunohistochemistryforthedetectionofcell-specificantigen，withresultbeingthepackslurrystainingofCEAandCK7areinreddishbrown，whichindicatestobepositive．5Makingkaryotypeanalysisoftheinducedstemcells：30cellswererandomly．chosenformicroscopeobservationandchromosomenumbercounting，theresultbeingallchromosomenumbersare46，showingnochromosomalaberrations．6BrdUtransfe：ctionandidentification：Immunohistochemicaldetectionofthevisiblepartofthenucleusindicatetheywereinbrownishyellow．7transplantingtheinductivelydifferentiatedUC—MSCsinnudemice：throughHEstaining，cellsintheAlloDermallogeneicdermalwereevenlydistributed．ThroughBrdUantigenexpressionbyimmunohistochemicaldetection，theinducedstemcellswithBrdUcalibrationwereevenlydistributedinthehumanacellulardermal．Conclusion：1Bvflowcytometry,thestemcellsurfacemarkersCD29，CD44，CD105havehigherexpressionrateandhematopoieticstemcellsurfacemarkersCD14．CD34，CD45almosthavenoexpression，whichindicatesthecellsculturedinthisexperimentarerelativelypurifiedMSCsandarecapableforexperimentalresearch．2Fromtheexperiment，wefoundthatthemostsuitableenvironmentforUC．MSCsgrowthisthemediumcontaining10％fetalcalfserumand90％DMEM皿)，andtheplantingdensitythatmostsuitableformegrowthofUC．MSCsis106／m1．UC．MSCsgrowthratepresentsallS-shapedcurvewith‘andendbeingsicandmiddlebeinfast．硼ouhtheexperimentbeginningandendbeingslowanOmlOOleoemgIastrtrougn[Fieexperlmem．上 英文摘要wecanfindUC．MSCswithinP3areinstableform，highadaptabilityands订ongmetabolism．Sotheycanbeusedforfollow-upexperimentalstudy．3Ithasbeenconfirmedtheintheimmunohistochemicaldetectionfortheinductiveofstemcell，bothCEAandCK7surfaceantigenarepositive，indicatingtheinducedstemcellshavethephenotypeofthesweatglandcells．4ThechromosomaltestresultsshowthisindirectCO．cultureinductivemethodsignificantlychangesthekaryotype，suggestingitisasafeandreliablewayforinduction．5Aftertesting．BrdUtransfectioniSsuccessful．6AnimalexperimentsconfirmedtheinductivelydifferentiatedhumanumbilicalcordmesenchymalstemcelliSsafeanderiectivefortransplantationintheskindefectsofthenudemice．Continuousobservationfor3monthsaftertransplantation，andnoadversereactionshavebeenfound．Keywords：humanumbilicalcordmesenchymalstemcells(UC-MSCs)；sweatglandcell；inductivedifferentiation；indirectCO—culture；Chromosome8 研究论文人脐带问充质千细胞向汗腺细胞诱导分化及向裸鼠移植的研究．▲厶-^_刖置汗腺为皮肤的重要附属器官，在物质代谢、体温调节及体液平衡等方面都有重要作用。当环境温度高于30℃时，对流、辐射、传导等机体其它散热方式停止作用，汗腺的重要功能．发汗成为人体唯一的散热途径。大面积、重度烧伤患者创面愈合后因汗腺损毁或瘢痕增生，使皮肤丧失了正常分泌汗液、调节体温的功能，使患者的生活质量降低。因此如何解决汗腺的再生问题已成为当今研究中的热点。随着对干细胞的研究深入，间充质干细胞(MSCs)N有来源广、纯度高、排斥小等优点，成为研究人员的新宠。目前对间充值干细胞研究最多、最全面的为骨髓间充质干细胞(BM．MSCs)，研究表明BM-MSCs可以分化为神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、成骨细胞、表皮干细胞、肝细胞等。近年来，人们研究发现脐带中的沃顿胶中也有间充质干细胞即人脐带间充质干细胞(UC．MSCs)，UC．MSCs}=LBM-MSCs更加接近胚胎干细胞，两者表面标志物相似，相较BM．MSCs，UC．MSCs具有来源广且方便无创，细胞形态好纯度高，免疫排斥性低，适合同种异体间的移植。本研究使用胶原酶消化法获得正常汗腺组织，使汗腺细胞的来源保证纯正，对汗腺细胞进行47。C水浴造成汗腺细胞热休克的微环境，对UC．MSCs向h-SGCs进行诱导分化。将诱导分化后的干细胞进行BrdU标定转染，把标定后的干细胞与裸鼠自体微粒皮、人脱细胞异体真皮、异体裸鼠皮片共同覆盖在裸鼠皮肤缺损处，构建基本的具有简单功能的全层皮肤。干细胞具有在特定条件下可以分化成各种成熟细胞的多向分化潜能。本研究利用干细胞的这种潜能，探索UC．MSCs的分离培养情况，探索适宜培养条件，与热损伤后汗腺细胞间接共培养实现向汗腺细胞诱导分化，以及移植入裸鼠体内的存活情况，为UC-MSCs实现烧伤后汗腺再生在临床上应用提供理论依据。 研究论文材料与方法1材料1．1标本脐带：来自于2011．06．2012．06期间本院妇产科足月剖宫产健康胎儿脐带。全层皮肤：来自于本院烧伤整形科患者的上、下眼睑或头、面、颈部皮肤扩张器II期手术后的多余正常皮肤。所有标本均在无菌条件下收集、处理，使用均获得患者知情同意。裸鼠：6．8周龄，雄性，由北京华阜康生物科技有限公司提供，动物许可证号：0275066，裸鼠饲料许可证号：0275141。脱细胞异体真皮：由北京桀亚莱福生物技术有限责任公司提供的J．1型脱细胞异体真皮。1．2主要试剂和仪器BrdU抗体SigmaBrdU抗原Sigma秋水仙素Sigma二甲基亚砜(DMSO)Sigma鼠抗人单克隆CK7一抗Sigma鼠抗人单克隆CEA一抗SigmaMTTSigma胰蛋白酶／EDTA消化液Solarbio重组表皮细胞生长因子(EGF)PeproTech胶原酶IISolarbioDMEM／F12Hyclone三碘甲状腺原氨酸(T3)Sigma琥珀酰氢化考的松Calbiochem胰岛素一转铁蛋白一亚硒酸钠(ITS)Sigma胎牛血清fibs)Gibco显色试剂盒PV6002北京中山生物技术公司注射用青霉素钠华北制药集团股份有限公司 研究论文注射用硫酸链霉素华北制药集团股份有限公司2实验仪器超净工作台(苏州福华净化设备有限公司)；C02恒温培养箱(上海Lishen科学仪器有限公司)；台式离心机(日本久保田公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂)；Finnpipette微量移液器(赛默飞世尔仪器有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；光学显微镜(日本Olympus)；冰箱(中国海尔，SC．278L)；载玻片(中国青岛26x76mm)；6孔培养板(美国Colstar)；96孔培养板(美国Colstar)；6孔transwell培养板(美国Colstar)；lOml细胞培养瓶(美国Colstar)；0．22}tm针头滤器(爱尔兰Corri曲wohill)；低温高速离心机(德国Heraeus)；紫外分光光度计(美国Aliment8453)；实验室纯水系统f美国Milipore)。3主要试剂配制3．1PBS溶液的配制取成品PBS粉末，加到250ml烧杯中，加水100ml、37"C水浴使之完全溶解后转入2000ml大容量瓶中，加水至刻度线，混匀，测量pH值为7．5。将上述溶液分装至500ml、250ml玻璃瓶中，8磅10．20min高压蒸汽消毒灭菌后，4"C冰箱保存备用。3．2青霉素、链霉素配制青霉素溶液的配制：取青霉素160万单位加无菌注射用水至16ml，依照公式计算其浓度为105n／ml，链霉素溶液的配制：取10万单位链霉素注射液一支，加无菌注射用水至10ml，则浓度为104u／ml，将两种溶液以ET管分装后一20℃冻存备用。3．3UC．MSCs培养液配制DMEM／F12(1：1)培养基为基础培养液，加入体积分数为10％的胎牛血清、100U／nd青霉素、100U／fml链霉素。3．4皮肤消化液配制DMEM／F12(1：1)培养基为基础培养液，加入体积分数为5％的胎牛血清、2mg／mlII型胶原酶、青霉素lOOU／ml、链霉素100U／ml。3．5汗腺培养液配制DMEM／F12(1：1)培养基为基础培养液，加入体积分数为5％的胎牛血清、表皮细胞生长因子(EGF)10ng／ml、琥珀酰氢化考的松0．4ng／ml、三 研究论文碘甲状腺原氨酸(T3)2nmol／ml、胰岛素一转铁蛋白．亚硒酸钠(ITS)10pl／ml、青霉素100U／ml、链霉素100U／ml。4实验方法4．1组织块培养法获得UC—MSCs：获得无菌足月剖宫产健康胎儿脐带，剪刀将其剪成3-4cm长短的脐带组织段，生理盐水反复冲洗，去除残留的血液，剪刀将其剪开后镊子剔除脐带中的两条脐动脉、一条脐静脉，以免被血管内皮细胞所污染。用镊子将脐带中的沃顿胶组织(Wharton’SJelly)呈条索状撕裂下来，剪刀剪成大小约lmm3的沃顿胶组织块，置于10ml培养瓶中，加入DMEM培养液9ml，胎牛血清(FBS)lml，青霉素、链霉素后，放进37℃、5％C02、饱和湿度的培养箱培养。镜下观察细胞生长情况，1周后对其进行第一次换液，此后每3．4天换液一次。当细胞长满瓶底后，0．25％胰酶消化贴壁细胞，进行传代。4．2计算细胞浓度：倒掉细胞培养液，生理盐水冲洗3次，加入胰蛋白酶／EDTA混合消化液消化，镜下观察，大部分细胞变圆后，加入FBS终止消化，加入适量生理盐水，用移液管反复吹打瓶壁，制成细胞悬液并离心。利用细胞计数板计算细胞浓度。细胞浓度=四大格细胞数／4×104×n(稀释倍数)／ml4．3不同FBS浓度对UC．MSCs生长的影响：96孔细胞培养板中接种P1代UC．MSCs，每孔约105个细胞，总体系为200lal，加入UC．MSCs培养基培养。微量移液器将FBS浓度分别调整为：5％、10％、15％、20％，每个浓度接种15孔。培养3天后，每孔加入20ulMTT(5mg／ml二苯基四氮唑溴盐)，混匀后孵育箱中培养4h，吸去培养基，加入DMSO(--甲基亚砜)100lal／孔，把96孔板放在振荡器上振荡20min，使结晶物完全溶解，以UC．MSCs培养基做为空白对照，在分光光度计上读取OD490值。4．4不同种植密度对UC．MSCs生长的影响：用含10o／60胎牛血清的培养基调节细胞密度，使UC．MSCs分别按以下密度：2、4、6、8、10、12、14、16(X104个／m1)接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100ul，每一密度接种10孔，培养3天后，每孔加入20ulMTT(5mg／m1)，混匀后孵育箱中培养4h，吸去培养基，加入100ul／TLDMSO，震荡20min，使结晶物完全溶解，以UC．MSCs培养基做为空白对照，在分光光度计上读取OD490值。4．5UC．MSCs生长曲线的测定：传一代(P1)、传三代(P3)、传八代(8)的 研究论文UC-MSCs达到90％融合时，0．25％的胰蛋白酶消化液将其消化，按1×105个／ml密度分别传代接种于96孔板中，每天在固定时间随机抽取4孔细胞用MTT法检测活细胞数，连续培养8d。取均值记录各代细胞生长曲线。以培养时间(d)为横轴，490nm处吸光度值似)为纵轴，绘制生长曲线。4．6人皮肤汗腺的分离、培养：无菌条件下获取正常全层皮肤，生理盐水反复冲洗干净后，剪刀去除皮下脂肪，剪成lmm3大小的组织块，加入II型胶原酶适量，置于细胞培养箱中过夜。次日在显微镜下用微量移液器挑取游离汗腺组织，经纯化后置于培养瓶，细胞培养箱中培养。大部分汗腺团块贴壁后，进行换液，此后3．4天换液一次。汗腺细胞的纯化：培养的汗腺细胞中如果存在成纤维细胞的污染，可用0．25％的胰蛋白酶对细胞进行消化处理，汗腺细胞较成纤维细胞贴壁牢靠，故成纤维细胞首先脱落，镜下观察，待大部分成纤维细胞变圆脱落后，滴入几滴FBS终止消化，生理盐水冲洗2遍后，加入新鲜的汗腺培养基，放入孵育箱中继续对汗腺细胞培养。4．7间接共培养诱导UC．MSCs向h．SGCs分化：原代培养的h．SGCs达到80％融合后，将其放置于47℃的水浴中培养40min，人工制造h．SGCs体外热损伤的微环境，造成汗腺细胞的热休克。将细胞放回培养箱中培养O．5h后，消化收集细胞。用6孔tanswell培养板对热休克后的h．SGCs和UC．MSCs进行间接共培养，tanswell培养板分为上下两层小室，下层先放置血清包被好的盖玻片，将达到90％融合的P3代UC-MSCs消化收集后，以1×105个／ml每孔的种植密度接种于下层小室，热休克后的h-SGCs以l×105个／ml每孔的种植密度接种于上层小室。上层各室分别加入配制的汗腺培养液1．5ml，下层各室分别加入配制的汗腺培养液2ml，每3天换液一次，一周后行免疫组化染色法检测CK7、CEA的表面抗原的表达情况。4．8诱导分化后细胞核型分析：取诱导分化后干细胞消化、离心，制成细胞悬液，加入秋水仙素0．2mg／L处理5h，0．075mol／LKCL低渗25min，甲醇：冰醋酸(3：1)固定，烘干，烤片，显带脱水，透明，封固，读片，制备染色体标本，进行核型分析。4．9BrdU转染：待P3代UC-MSCs长至80％融合时，吸去培养液，加入终浓度为5lamol／L的BrdU，置于37℃，5％C02饱和湿度条件下培养， 研究论文每2天更换培养一次，直至UC—MSCs达到80％融合。0．25％胰蛋白酶消化后，爬片。对细胞进行固定后，进行免疫组化染色。4．10BrdU标定并诱导分化后的干细胞进行裸鼠移植：将BrdU标定并经过与热休克汗腺细胞间接共培养的具有汗腺细胞表型的干细胞消化，离心后制成细胞悬液，待用。将裸鼠麻醉后，在其背部人为制造一直径为2cm皮肤缺损，把所取皮肤皮下组织去掉，制成薄皮待用。将细胞悬液均匀涂抹在缺损皮肤的创面上，把脱细胞异体真皮剪成缺损皮肤大小平铺在细胞上面，将所修剪好的裸鼠薄皮覆盖在脱细胞异体真皮上，打包固定。2周后拆包，1月后将手术部位取出，4％多聚甲醛固定。进行脱水、包埋、切片等处理后，HE染色及免疫组化染色。4．11流式细胞术具体步骤：倒掉细胞内的培养液，用生理盐水冲洗干净，向培养瓶内加入适量胰蛋白酶／EDTA；上细胞消化脱落后，以胎牛血清终止消化；J加入适量生理盐水冲洗培养瓶，将获得的细胞移入45ml离心管内J以1500r／min离心3min，获得细胞，制成lxl06／ml细胞悬液上用固定液固定25min，每组细胞用微量移液器分离出每管均为100ul的细胞悬液工分别加入直接荧光标记小鼠抗人单抗CDl4．FITC、CD29．FITC、CD34．FITC、CD44．FITC、CD45．PC5、CDl05．PE及小鼠同型阴性对照IgG2a．FITC各10ul上室温下反应30min上每管加入1．5mlPBS清洗，1200r／min离心5min，弃上清，将细胞混匀后每管加入100u1PBS 研究论文上行流式细胞术检测4．12染色体检测步骤：4．12．1接种：接种后放入37。C恒温培养箱中72小时。4．12．2加入秋水仙素：2．8滴，放入37。C恒温培养箱中1．5小时。秋水仙素：lOOml0．85％生理盐水加入lmg秋水仙素原液。4．12．3低渗：去上清液加kcl溶液低渗，然后放入37。C恒温培养箱中30．40分钟。低渗液0．075kcl溶液由5．5879kcl+1000ml蒸馏水室温保存，用之前半小时放置水浴箱37度温浴。4．12．4预固定：加入lml固定液混匀后，离。1l,(2000转，10分钟)弃上清。4．12．5固定液固定：加入固定液6-8m1(甲醇：冰醋酸=3；1)，混匀，离心弃上清。重复2次，留0．5ml细胞悬液。重复两次。4．12．6染色体扩散滴片：冰玻片滴片，快速，置75。C烤片3小时，室温下放置冷却。玻片提前半小时放置冰箱。4．12．7显带染片：胰酶显带15。55s，生理盐水漂洗，吉姆萨染色5分钟。试片，条件符合后，分批染色。胰酶：2．59+0．85％生理盐水1000ml溶解56度除菌三次。4．12．8核型分析4．13BrdU染色具体步骤：切片二甲苯脱蜡至水，PBS(PH7．4)漂洗5minx3次上抗原修复上PBS漂洗5min×3次上切片置于3％1-1202中室温浸泡lOmin，灭活内源性过氧化物酶上PBS漂洗5min×3次J滴JJIDNaseSolution(终浓度100U／ml或109／m1)37。C温箱中孵育30min上PBS漂洗5min×3次 研究论文—————————————————————————————————————————一上滴加封闭液(即10％山羊血清，用含O．1％TritonX．100的PBS配制)，室温放置30minj甩去血清封闭液，滴加小鼠抗弓rdU抗体(用封闭液1：50稀释)，4℃过夜J用PBST(即含0．05％Tween．20的PBS)漂洗5miIl×3次J滴加山羊抗小鼠IgG琉体．瑚冲多聚体，37"C放置30minjPBST漂洗5minx3次土DAB显色：室温显色，流水冲洗，终止反应上苏木素复染细胞核lmin，流水冲洗10min梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片上显微镜下观察结果、计数、拍照4．14免疫组化染色具体步骤：玻片用蒸馏水清洗三次，3％过氧化氢溶液室温浸泡1O．15分钟，消除内源性过氧化物酶活性；JI％BSA0'J',牛血清白蛋白)封闭，室温10．15分钟(封闭组织内电荷)，倾去血清(勿洗)；J滴加一抗CK7(效价1：50)，CEA(效价1：70)置于湿盒中40C冰箱过夜；00．01MPBS振洗，5分钟)【3次；上 研究论文滴加PV-6002二抗葡聚糖．酶复合物，37度孵育60分钟；上0．01MPBS振洗，5分钟x3次；0显色：PBS4ml，DAB59，H2025ul，显色5分钟左右(以镜下适度为好)；上蒸馏水洗5次；上苏木素复染1分钟，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；上显微镜下观察结果、计数、拍照。4．15计算CEA、CK7免疫组化的阳性率，各选取选取8个视野，得到各个视野的阳性细胞与总细胞数的数量之和，计算各细胞的阳性率，利用SPSS16．0软件进行统计分析，数据均以均数4-标准差(x4-S)表示，检验标准0【=0．05，P<0．05为差异具有统计学意义。 研究论文结果1UC．MSCs的分离、培养及鉴定：通过对人脐带间充质的组织块培养法得到UC．MSCs，培养3．5d，有少量脐带组织块周围爬出梭形成纤维样细胞饵ig．1)。一周后，可见大部分组织块周围爬出梭形成纤维样细胞，给予换液。之后2．3天给予换液一次，传1．3代(p1、P2、P3)的UC．MSCs呈长梭行，形态均一但瞎2)。培养至传八代细胞(P8)，UC．MSCs仍然存活，但生长缓慢，形态开始发生变化，折光性变得较差，部分细胞已开始脱壁凋亡。对分离培养的UC．MSCs进行流式细胞术检测，干细胞表面标志物CD29、CD44、CDl05表达率较高，分别为91．3％、99．1％、99．2％；造血干细胞表面标志物CDl4、CD34、CD45几乎不表达，分别为5．5％、1．6％、2．O％(Fig．3)，提示本实验培养得到的细胞为较纯化的间充质干细胞。2UC．MSCs生长的影响因素及生长曲线的绘制：当胎牛血清浓度为10％时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多(Table．1)。当种植密度为105／ml时MTT比色法检测OD490值最高，细胞活性好，活细胞数量较多(F培4)。绘制的UC．MSCs细胞生长曲线中，P1代细胞增殖较P3、P8快，而P3增值速度快于P8，并且随着细胞传代次数增多，细胞增殖速度逐渐下降(Fig．5)。3汗腺细胞m．SGCs)培养：II型胶原酶对人正常全层皮肤消化后，显微镜下微量移液器挑取汗腺组织，镜下可见汗腺组织为团块状卷曲组织@ig．6)。培养3天后，已有汗腺贴壁，镜下可见汗腺团块周围爬出不规则形细胞，呈多角形，集落状生长(Fig．7)；培养7天后，大部分汗腺团块贴壁，给予换液；12天后，镜下可见汗腺团块周围爬满不规则细胞，呈铺路石样生长(Fig．8)。4UC．MSCs诱导分化及鉴定：CEA和CK7表面抗原相结合作为汗腺细胞的特异性抗原，将诱导分化后的细胞进行免疫组化检测，CEA和CK7染色为阳性但ig．9、10)。5对诱导后干细胞进行核型分析：镜下随机观察30个细胞的染色体，计数染色体条数，结果染色体数均为46条(Fig．11)，未见染色体变异。6BrdU转染及鉴定：免疫组化检测结果可见部分细胞核呈棕黄色但ig．12)。 研究论文7将诱导分化后的细胞进行裸鼠移植：将脱细胞异体真皮平铺在裸鼠缺损皮肤上伊远13)，均匀涂抹上诱导分化及BrdU标定的干细胞后，打包固定(Fig．14)，2周后拆线，1个月后将手术部位取出固定，HE染色可见脱细胞异体真皮中细胞分布均匀(Fig．15)。免疫组化检测BrdU抗原表达情况，可见BrdU标定的诱导后干细胞均匀分布在人脱细胞异体真皮中(Fig．16)。 研究论文附图Fig．1TheUC-MSCsgrow3days(arrow,x40)Fig．2TheUC-MSCsgrow10days(arrow,x40) 研究论文Fig．3CD29antigenexpressionof91．3％CD105antigenexpressionof99．2％CD34antigenexpressionof1．6％CD44antigenexpressionof99．1％CD14antigenexpressionof5．5％CD45antigenexpressionof2．O％21 研究论文Fig．4DifferentplantingdensityontheinfluenceofUC—MSCsgrowthFig．5UC-MSCsgrowthcurve 研究论文Fig．6Freehtveat-organises(arrow,x40)ereehuman$weorganisesarl'ow,x40●Fig．7Humansweat-organisesgrow3days(arrow,x40) 研究论文Fig．8Humansweat-organisesCobblestone—likegrowth(arrow,x40)Fig．9TheUC—MSCsofCEApositiveinduceddifferentiation(arrow,x100) 研究论文Fig．10TheUC—MSCsofCK7positiveinduceddifferentiationFig．11InduceddifferentiationofUC-MSCschromosome 研究论文Fig．12BrdUtransfectionUC-MSCs(arrow,xl00)Fig．13AlloDermskintilingdefectsinnudemice 研究论文Fig．14PackagedfixedFig．15TheAUoDermHEstaining(arrow,x40) 研究论文Fig．16BrdUcalibrationstemcellsafterinductionuniformlydistributedinthehumanacellulardermal(arrow,×40) 研究论文附表Table1DifferentconcentrationsFBSofUC—MSCsgrowthimpact．不同FBS浓度0D490对照组5％组10％组15％组20％组O．07560士O．03285O．13560士O．04523*O．19550土O．03114，lc水O．19480士O．03114水水O．13560士O．04037*Note：Comparedwith对照组：水尸