全沟硬蜱种群生态及蜱传病原体研究

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学校代码：10094密级：公开中图分类号：Q969UDC：590博士学位论文全沟硬蜱种群生态及蜱传病原体研究StudiesonPopulationEcologyofIxodespersulcatusanditsInfectionwiththeTick-bornePathogens研究生姓名：许士奇指导教师：刘敬泽教授学科专业：生态学研究方向：病原生物生态学论文开题日期：2012年3月18日二〇一五年三月十八日 DoctoralDissertationStudiesonPopulationEcologyofIxodespersulcatusanditsInfectionwiththeTick-bornePathogensbyXuShiqiSupervisedbyProf.JingzeLiuHebeiNormalUniversityMarch,2015 学校代码：10094密级：公开中图分类号：Q969UDC：590博士学位论文全沟硬蜱种群生态及蜱传病原体研究StudiesonPopulationEcologyofIxodespersulcatusanditsInfectionwiththeTick-bornePathogens研究生姓名：许士奇指导教师：刘敬泽教授学科专业：生态学研究方向：病原生物生态学论文开题日期：2012年3月18日二〇一五年三月十八日 学位论文原创性声明本人所提交的学位论文《全沟硬蜱种群生态学及蜱传病原体研宂》，、是在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均已在文中标明。本声明的法律后果由本人承担。论文作者（签名>?|5年爻月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在年解密后适用本授权书）论文作者（签名）：>丨ST年K月Vlfl 摘要全沟硬蜱Ixodespersulcatus在全球广泛分布，范围横跨欧亚大陆，从波罗地海到太平洋，不仅包括前苏联(主要是俄罗斯)的大部分地区，而且有一些分布在波兰、中国北部、蒙古、韩国以及日本北海道岛和附近的几个小的岛屿。上世纪九十年代以前，全沟硬蜱主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、甘肃、山西、新疆、西藏地区。随着全球气候变暖、城市扩张、土地利用、人类户外运动行为增加等多种原因，导致蜱类种群分布面积逐渐扩大，蜱传病原体增多。近些年的研究表明全沟硬蜱在河北、内蒙古、宁夏、天津、北京已经有分布，甚至河南也有发现，提示其种群分布范围有逐渐扩大的趋势。蜱作为一种专性吸血的寄生动物，可以携带多种病原体，从而被越来越多的人重视。现在已经证明蜱可以携带原生生物、细菌、立克次氏体、原虫和病毒。在中国，全沟硬蜱主要是莱姆病，埃立克体病，巴贝西虫病，立克次体病和森林脑炎的传播媒介，对人和家畜威胁巨大，而这些蜱传疾病的分布与全沟硬蜱种群分布相一致。本研究以全沟硬蜱为研究对象，在内蒙古中俄边境地区的额尔古纳国家级自然保护区内，调查研究这种蜱的分布、种群动态变化、季节消长和宿主寄生状况。研究结果表明，全沟硬蜱主要在保护区林区内的灌丛和草地上滋生，全沟硬蜱的成蜱在4月上旬开始出现找寻宿主吸血，5月下旬出现活动高峰，至8月上旬停止活动。活动高峰出现在5月下旬。幼蜱和若蜱活动期相似，都在5月开始出现，直到9月中旬消失，活动高峰在6、7、8月份出现多次。全沟硬蜱成蜱主要侵袭羊体颈部和躯干部，耳部、犄角部、面部也会被侵袭，未见侵袭啮齿类动物。幼蜱、若蜱主要侵袭啮齿类动物的耳部和面部。9月后，在羊体上未发现越冬的成蜱寄生，在野外自然环境也未能通过拖旗法捕获到成蜱。本研究又通过实验设计，调查了全沟硬蜱实验室条件下的生活史中各个发育阶段的生物学特性。全沟硬蜱幼蜱、若蜱和成蜱在兔体吸血，非寄生期在可控实验环境生活状况，观察并记录其发育阶段生活史参数。结果表明全沟硬蜱幼蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为25.6天；若蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为29.3天；雌蜱吸血前期、吸血期、产卵前期、产卵期合计为36.6天；卵孵化期为31.7天。完整生活史需123.2天（范围93～149天），雌蜱饱血体重与生殖力呈显著相关(r=0.716,p<0.001),雌蜱的生殖效率指数为4.35。卵的孵化率平均为88.5%。I 从内蒙古中俄边境地区采集全沟硬蜱，选择其中的224只，通过PCR分子检测方法研究蜱携带病原体情况。结果表明，在中俄边境地区的全沟硬蜱携带有莱姆病螺旋体、巴贝西原虫、斑点热立克次体，感染率分别为4.02%、4.91%、0.89%，说明额尔古纳自然保护区是这三种蜱传病原体的自然疫源地。未检测到查菲埃立克体和嗜吞噬细胞无形体，也未发现有这些病原体共感染的情况。关键词：全沟硬蜱，种群动态，生活史，蜱传病原体，莱姆病，森林脑炎，斑点热II AbstractTheixodidtickIxodespersulcatusiswidelydistributedinthewholeworld,acrosstheEurasianContinent,fromtheBalticSeatothePacificOcean,includingnotonlytheterritoryoftheformerSovietUnion(mainlyRussia),butalsosomespotsinPolandandcertainpartsinNorthernChina,MongoliaandKorea,aswellaspartofHokkaidoIslandandseveralsmallernearbyislandsinJapan.Bythe1990s,I.persulcatusdistributedinHeilongjiangProvince,JilinProvince,LiaoningProvince,GansuProvince,ShanxiProvince,XinjiangUygurAutonomousRegionandTibetAutonomousRegioninChina.Foravarietyofreasons,suchasglobalwarming,urbanexpansion,landuse,increasingoutdoorhumanbehaviorandsoforth,thetickspeciesdistributionareaisexpandingandtick-bornepathogensareincreasing.Inrecentyears,researchhasshownthatI.persulcatushasbeenfoundinHebeiProvince,InnerMongoliaAutonomousRegion，NingxiaAutonomousRegion，Tianjin,Beijing,andeveninHenanProvince,whichindicatesthatI.persulcatuspopulationdistributionhasatendencytoexpand.Ticksareblood-feedingobligateparasitesthathaveattractedincreasingscientificattentionprimarilybecauseoftheirroleasvectorsofnumerouspathogens.Ithasbeentestifiedthatthespectrumofsuchpathogensincludesprotista,bacteria,rickettsia,helminthesandvirus.Amongthemajortick-bornediseasestransmittedbyI.persulcatustransmittingpathogens,thereareborreliosis,ehrlichiosis,babesiosis,rickettsiosisandtick-borneencephalitis,whichareconsideredtobeconsiderablydangeroustohumanbeingsanddomesticanimalsinChina.VariousformsoftickbornediseasesareconcurringinwidespreadareaswhereI.persulcatusdistribute.Inthisstudy,weinvestigatedthedistribution,populationdynamicschange,seasonalsuccessionandthehostparasitismofI.persulcatusinErgunaNationalNatureReserveoftheInnerMongoliaborderareasbetweenChinaandRussia.Thestudyshowedthattheixodidticksmultipliedmainlyintheshrubsandmeadowsintheforestzoneofthereserve.AdultsofI.persulcatusbegantolookforhostsandfeedonbloodinearlyApril,whichshowedapeakinlateMayandstoppedinAugust.Theactivestageoflarvaewassimilartothatofnymphs,bothbeginninginMay,disappearinginSeptember,andshowingpeaksseveraltimesinthedurationofJune,JulyandAugust.AdultsofI.persulcatusmainlyattackedtheneckandthebodyofgoats,andtheattackedsignswerealsofoundontheear,faceandthebaseofhornsofgoats.Therewasnoevidencethatrodentswereattackedbytheadults.Ontheotherhand,III larvaeandnymphsprimarilyattackedtheneckandfaceofrodents.AfterSeptember,noparasitismsofadultsforoverwinteringwerefoundingoats,norwereadultscapturedbydraggingunderfieldconditions.Moreover,accordingtoexperiments,I.persulcatus’sbiologicalcharacteristicsinvariousgrowthstageswerealsoinvestigatedunderlaboratoryconditions.Weresearchedtheactivityoflarvae,nymphsandadults’bloodfeedinginrabbitsandtheirlivingstatusundercontrollablelaboratoryconditionsduringthenon-parasiticstage,observingandrecordingtheparametersoftheirlifecycleindifferentgrowthstages.Theresultsofthisstudysuggestedthatforlarvae,theearlystageofbloodfeeding,thebloodfeedingstageandtheecdysisstageaddedupto25.6days;fornymphs,theearlystageofbloodfeeding,thebloodfeedingstageandtheecdysisstageaddedupto29.3days;forfemaleI.persulcatus,theearlystageofbloodfeeding,thebloodfeedingstage,theearlystageofspawningandthespawningstageaddedupto36.6days,withthehatchingperiodlastingfor31.7days.Therefore,theaveragelifecyclewas123.2days(withinarangeof93to149days).Furthermore,therewasasignificantcorrelationbetweentheengorgedbodyweightoffemalesandtheiregglayingmass(r=0.716,p<0.001).Thefemalereproductiveefficiencyindex(REI)was4.35,withanaveragehatchabilityof88.5%.224ticksofI.persulcatuscollectedintheInnerMongoliaborderareasbetweenChinaandRussiawerestudiedbymeansofthePCRmoleculardetectiontoexploretheinfectionwiththetick-bornepathogens.TheresultshowedthattheseticksofI.persulcatuscarriedLymediseasespirochaete,Babesiasis,andSpottedfevergrouprickettsiae,andtheinfectionrateswere4.02%,4.91%and0.89%respectively,whichshowedthatErgunaNationalNatureReserveisthenaturalinfectiousfocusoftheabove-mentiondedthreetick-bornepathogeneses.Meanwhile,noEhrlichiachaffeensisandAnaplasmaphagocytophilumweredetected,norwastheevidencefoundthatseveralspeciesofpathogenswereconinfected.KeyWords:Ixodespersulcatus,seasonalabundance,lifecycle,tick-bornepathogens,Lymedisease，tick-borneencephalitis，spottedfeverIV 目录摘要.................................................................................................................................IAbstract............................................................................................................................III目录.................................................................................................................................I引言................................................................................................................................11.蜱与人兽共患病...............................................................................................12.蜱类生态学.......................................................................................................22.1气候因素....................................................................................................22.2生境特征因素............................................................................................42.3宿主因素....................................................................................................53.蜱传病原体生态学...........................................................................................73.1气候因素....................................................................................................73.2生境特征因素............................................................................................83.3宿主因素....................................................................................................94.宿主-蜱-病原体动态变化关系.......................................................................114.1生境破碎化..............................................................................................114.2城市化......................................................................................................124.3土地利用..................................................................................................144.4家畜..........................................................................................................154.5人类行为..................................................................................................165.全球变化和蜱传疾病的传播.........................................................................185.1气候变化..................................................................................................185.2旅行和贸易..............................................................................................196.结语.................................................................................................................20第一章全沟硬蜱种群分布和季节动态......................................................................211.1材料与方法..................................................................................................221.1.1研究地点...............................................................................................221.1.2羊体寄生情况.......................................................................................23 1.1.3啮齿类动物寄生情况...........................................................................241.1.4自然环境中的全沟硬蜱.......................................................................241.1.5数据统计...............................................................................................251.2结果..............................................................................................................251.2.1全沟硬蜱羊体寄生季节发生数量及动态...........................................251.2.2全沟硬蜱羊体寄生位点.......................................................................261.2.3全沟硬蜱幼蜱和若蜱在啮齿类动物寄生数量及动态.......................261.2.4自然环境中全沟硬蜱季节发生动态...................................................281.2.5可控自然环境全沟硬蜱宿主找寻行为及吸血特性...........................301.3讨论..............................................................................................................30第二章全沟硬蜱生活史..............................................................................................332.1材料与方法..................................................................................................332.1.1蜱的采集和饲养方法...........................................................................332.1.2全沟硬蜱成蜱生物学特性...................................................................332.1.3全沟硬蜱幼蜱和若蜱生物学特性.......................................................342.1.4统计分析...............................................................................................342.2结果..............................................................................................................342.2.1实验室条件下全沟硬蜱生活史...........................................................342.2.2全沟硬蜱吸血特点及体重变化...........................................................342.2.3全沟硬蜱产卵特性...............................................................................352.3讨论..............................................................................................................37第三章全沟硬蜱病原体感染研究..............................................................................393.1材料与方法..................................................................................................393.1.1全沟硬蜱的采集..........................................................................................393.1.2实验仪器与试剂..........................................................................................393.1.3实验方法......................................................................................................403.1.3.1DNA提取...................................................................................................403.1.3.2病原体基因特异性引物合成...................................................................403.1.3.3PCR扩增病原体基因................................................................................41 3.2实验结果......................................................................................................423.3讨论..............................................................................................................44第四章结论与展望......................................................................................................46参考文献..........................................................................................................................48致谢..............................................................................................................................62攻读学位期间发表论文..................................................................................................63 引言蜱是一种吸血的节肢动物，隶属于动物界节肢动物门，蛛形纲蜱螨亚纲寄螨总目蜱目，到目前为止全世界已经发现18个属，总计896种，而中国已证实存在10个属，117[1,2]种，其中100种硬蜱、和10余种软蜱。蜱是人类最早确定的可以携带病原体的节肢[2,3]动物，并且同蚊子一起被认为是人类和家畜动物最重要的媒介生物。蜱可携带和传播病毒、细菌、立克次体、螺旋体、原虫、衣原体、支原体、巴通体、线虫等多种病原[4,5][6-8]体而导致疾病，而且通过蜱传播的疾病在全球范围内正日益增多。人们对蜱与蜱传疾病越来越重视，有关蜱类生态学和蜱传疾病研究的著作也越来越多，但是其中大部分数据资料往往比较单一和简单，而要想充分的掌握蜱传疾病的流行，就必须全面了解蜱、宿主、环境和蜱传病原体之间复杂的交互关系，并且在较长的时间跨度下，才可能[9]梳理出蜱传疾病出现的变化规律。这种研究需要多学科共同协作，因为全球气候变化、生境变化、土地利用、城镇化建设、家畜、宠物和人类行为均会增加或减少人类与蜱接触的几率，从而影响蜱类生态学和蜱传疾病的传播。1.蜱与人兽共患病世界上蜱比其他任何吸血节肢动物传播的病原体种类都多，它可以感染人类、野生动物、家畜、人类宠物，几乎所有的蜱传疾病都是人畜共患病，但是象蚊子传播的疟疾，是由恶性疟原虫和间日疟原虫引起的人类患病，却并没有演变为人畜共患疾病。蜱传播[10,11]的人畜共患病在十九世纪下半叶就已被大家所了解，现在其中一些疾病已经成为传播最快的节肢动物媒介传播疾病，比如蜱传脑炎、落矶山斑点热、莱姆病。不仅蜱传疾病数量在增加，新病例报告数也在增加。在美国，莱姆病报告数量从1992年到2006年，[12]14年期间增加了101%。在欧洲，过去的20年中，新出现的蜱传脑炎疫源地和不断增加的新病例遍布整个欧洲大陆。即使在奥地利，蜱传脑炎疫苗接种率很高，发病率已经下降了90%的情况下，现在一个未接种疫苗的人感染脑炎的风险也比30年前还要高[13]。蜱的生态、生理和行为特征直接影响其作为病原体媒介和宿主接触的可能性，以及[14]蜱生存和传播病原体的能力。蜱在很多方面不同于其它的节肢动物，例如蜱的活动范围很小、活动能力很低，迫使它们对气候变化变得更加敏感，通常情况下它们会隐藏在植被下面或寄生在宿主的巢穴中。与能够飞行的昆虫相比，蜱消耗更少的能量去找寻宿1 [15]主，并且能够充分利用自身的能量，生存比较长的时间。蜱是专性吸血性动物，比其[16]它节肢动物吸更多的血，从而获得更多的能量，这就提高了蜱作为媒介的潜力。蜱在各个生活史阶段，比如蜕皮和产卵之前只吸一次血，然后雌蜱在血餐后开始产卵，但吸[17]血期会比较长，有些硬蜱甚至达14天之久，而其它节肢动物通常会吸很多次血。媒介昆虫通常在一代生活史中，经历很多不同的宿主，而大部分的软蜱只需要较少的宿主，[15]硬蜱在一代中最多只需要三个宿主。蜱如果要成为某种病原体的媒介,这种病原体必须能够在经历蜱的生命周期变化时生存下来，从一个生活史阶段进入下一个阶段，甚至少部分病原体可以经卵传播，从雌蜱到卵存活。因此，在蜱的发育过程中，病原体必须保证自己存活在蜱体内，存在的时间持续几个月到几年，然后传播到新的宿主。这也就意味着一种病原体的传播，严重的[14]依赖媒介蜱的发育、生长和繁殖效率，以及和蜱与宿主的关系。即使在某些地区，蜱和宿主已经形成了稳定的生态种群，但是由于蜱的这种特殊的生存方式和生活史，不利于病原体的传播，从而限制蜱传病原体在地理上的分布。2.蜱类生态学[18]蜱传疾病，比如莱姆病，只会发生在蜱、病原体和宿主同时存在的重叠环境中，并且人体也要暴露在蜱传病原体的情况下。反过来说，蜱传疾病只会发生在这样的地理[19,20]环境中。因此生态学因素对蜱类来说关系重大，对于蜱传病原体存在和传播都适宜的栖息地，必须满足蜱和宿主的基本生存要求。2.1气候因素小气候是由特定区域内微尺度气候条件组成的，例如近地面区域，包括温度、风速、饱和差和土壤湿度。小气候内这些气候条件的变化，在很多方面会影响蜱的生存、发育速度、季节消长，从而造成蜱种群变化，行为改变，增强或减弱对病原体的易感性，病[21]原体在蜱体内潜伏期变化，最终影响病原体的传播。[22]硬蜱和软蜱都显示出在非常狭窄的温度和水汽饱和差范围内生存、活动和发育。利用水汽饱和差，通过测量水含量以及空气的干燥程度，可以很好的预测蜱的生存和生存时间。许多研究还使用相对湿度，当达到一定的阈值时，提示蜱需要补充水分。例如，篦子硬蜱Ixodesricinus、变异革蜱Dermacentorvariabilis和卡宴花蜱Amblyommacajennense，只有在小气候相对湿度长期高于80%条件下，才能生存，当平均湿度低于[23]80%时，这些物种的寿命将大大缩短。不同的种类、发育阶段、性别、年龄和生理状2 态等，蜱对于温度和干燥的耐受限度也有不同。血红扇头蜱Rhipicephalussanguineus幼蜱，即使暴露在50°C的高温、相对湿度97%的环境下也能够存活1小时，表现出较强[24]的抗热性，而肩突硬蜱Ixodesscapulari则是一种适合高湿度和较低温度的蜱，在30°C温度下死亡率明显上升。在不同的温度和湿度条件下，比较两种非洲成蜱，镰形扇头蜱Rhipicephalushaemaphysaloides相比具尾扇头蜱Rhipicephalusappendiculatus存活率要高，在较高温度和较低的相对湿度的极端条件下，更具有适应炎热和干燥气候的能力。蜱周围的环境温度，尤其是在生命发育发生变化的重要时期，比如产卵前期、孵化前期、蜕皮前期，过低、过高的温度和湿度，都会可以增加蜱的死亡率，从而影响蜱孵[25-27]化和发育的成功。对于篦子硬蜱来说，气候条件扮演着一个重要的角色，限制了蜱[27]在向北方地区的分布。极低温度的破坏性影响是可以累积的，特别是处于吸血后滞育的幼蜱和若蜱来说，增加了冬季的死亡率。此外，蜕皮期的蜱在低温条件下非常脆弱，这意味着如果在冬季来临之前，夏天的温度如果不利于蜱发育，它们是不可能存活到温[28]和霜冻期。高温和湿度所导致的不适宜的环境条件决定了篦子硬蜱向南分布的范围[29]。温度越低，肩突硬蜱发育时期越长,生活史也就越长，在能够繁殖前蜱的死亡率也就[30]越大。在一项美国伊利诺伊州持续8年肩突硬蜱种群的研究显示，一年中如果发生干旱，将会造成幼蜱在植被或者啮齿动物宿主中的种群密度降低。相反的情况，降雨量增[31]加，幼蜱密度也会随之增加。蜱的找寻行为往往使自己暴露在多变干燥的气候条件中，这样的环境下通常是不利于蜱保持湿度的,会导致蜱失水。为了防止过分干燥、补充水分,研究发现蜱虽然偶尔离开它们的找寻地，但是最终会返回到落叶层，因为在落叶层中相对湿度比较大，蜱可以恢复体内水分。对于篦子硬蜱来说，持续的找寻行为是非常不利于蜱保持湿度，这也就[32]意味在炎热干燥环境下，蜱通常会减少找寻行为。美洲花蜱Amblyommaamericanum和肩突硬蜱在美国有着相似的栖息地，但是对小气候适应不同，在一天中不同的时间，它们有着各自不同的行为。肩突硬蜱主要是在早上和傍晚，当温度较低和湿度较高时活动,而美洲花蜱通常在上午和刚过中午，温度和湿度都更[33]高的时候活动。两个物种都传播人畜共患病给人类，但这些疾病有不同。美洲花蜱携带查菲埃立克体Ehrlichiachaffeensis、伊氏埃立克体Ehrlichiaewingii、土拉杆菌[34]Francisellatularensis以及各种立克次氏体rickettsia。肩突硬蜱是北美地区伯氏疏螺旋3 体B.burgdorferisensustricto最重要的传播媒介，也传播嗜吞噬细胞无形体Anaplasma[35]phagocytophilum、巴贝西虫Babesiamicroti。因此,人类的活动,无论是在早晨、晚上或中午,都可能感染这些病原体。大多数蜱活动呈现季节性变化,这体现在不同物种之间和同一个物种不同的发育阶段。太平洋硬蜱Ixodespacificus的若蜱会因为不同生境的类型与和气候因素，显示不同的季节性活动变化模式。在干燥和温暖的条件下,太平洋硬蜱的若蜱往往比在寒冷高湿[36]的环境下，更早的开始找寻行为并且活动会呈现短时的高峰。类似的情况也出现在欧洲的篦子硬蜱身上。在中欧,英格兰北部和苏格兰的篦子硬蜱的若蜱、成蜱显示双峰模式,活动高峰出现在春季和秋季,而爱尔兰和英格兰南部发现篦子硬蜱，只有在春天或初夏出[37]现一个活动高峰。这和墨西哥湾流提供给爱尔兰和英格兰南部温和的气候有关。在瑞士的一项研究指出,温和的温度允许篦子硬蜱在每年的早些时候活动,而找寻行为延迟是[38]因为较低的温度，而寒冷的气候也是诱发延迟发育的原因。这种发育变化导致蜱的季[28]节性活动变化，也使得使蜱类种群表现为不同程度的滞育。科学家们研究英格兰篦子硬蜱的种群动态,通过分析气候、生境条件，为预测篦子硬蜱在其他地区的分布变化提供一种模型。2.2生境特征因素硬蜱吸血后会脱离宿主，其生活史中绝大部分的时间都是离开宿主生活。除了少数[15]一两种蜱之外，通常情况下，大部分的蜱都不能生存能够生存在干旱恶劣的环境中。[39]蜱虫和宿主的栖息地非常依赖上面论述的小气候特点。例如，植被可以为蜱遮挡阳光和降雨，改变植物下面和周围的小气候，影响土壤中的水分存留。相比于没有遮挡的小块空地，有遮挡的小块空地，在比较温暖的日子里往往有较低的温度，在比较冷的日子里往往有较高温度。这些都是因为植物能够遮光的结果。又因为植物叶片的拦截，吸收[40]的降雨量也会较少。土壤温度本身对土壤蒸发量有一个影响，随着土壤温度的升高，蒸发的速度也会增快。因此，更多受保护栖息地，具有永久的枯枝落叶层，提供一个更稳定的小气候，利于蜱的生长和蜱类种群的建立。水汽饱和度和相对湿度也依赖于土壤中的水分和土壤空隙的大小，土壤空隙的大小也会能够影响蜱在沙漠中躲避阳光直射的[41,42]能力。树林和灌木的遮挡，会给篦子硬蜱提供了一个适宜的温度，较高的湿度，因此在阔[43]叶林中发现的蜱比在针叶林中发现的多。瑞典科学家研究了不同植被类型对篦子硬蜱4 密度的影响，发现森林中若虫的密度明显高于开放的地域，而且密度最高的地域是在山[44]毛榉树林中，每100平方米达到40只。西班牙的一项研究显示，温暖的地中海气候，[45]有次生植物生长的栖息地，比如在混交针叶林和落叶林中篦子硬蜱密度更高。这是因为森林中的灌木丛和落叶为蜱创造了更适宜的小气候条件。在美国的威斯康星洲一项对肩突硬蜱的研究显示，即使宿主的种群数量足够，但蜱的密度，在不同的栖息地里也会[46]有所不同，同时，蜱的密度与阔叶林生境呈正相关，与草原生境呈负相关，这种关系[47]和其它种类蜱情况也相同。利用化学或物理的方法来改变小气候，从而改变适合蜱虫生长的栖息地，通过这种[48]方法减少蜱的种群数量并影响它们的发育。人们通过实验证实了这个结论。通过检测改变小气候的温度和湿度条件、控制动物和喷洒药物三种不同的方法，来控制美洲花蜱数量，最终发现在这些方法中，只有改变栖息地小气候条件的方法，才能成功地减少若蜱和叮咬牛的成蜱数量，而其它方法效果不明显。2.3宿主因素2.3.1宿主适应性[49,50]能够叮咬宿主和宿主的种群密度是蜱生存和发育的关键。对于一些蜱，如篦子硬蜱，会出现在爬行动物、鸟类、哺乳动物等数百种不同宿主上，而这些潜在宿主可能存在于绝大多数的栖息地上，然而其他的类型的蜱可能只存在于一种或几种宿主上，例[51]如紫色硬蜱Ixodeslividus只寄生在沙燕上。因此这些以一种或几种生物为宿主的蜱，生存严重依赖于现存的这些宿主，如果它们的宿主迅速减少，它们的生存可能会受到严[52]重威胁，如果他们的宿主濒临灭绝，这些蜱也很可能随着一起灭亡。[53]宿主行为是蜱传播和分布的一个很重要的因素，因为蜱独立活动能力非常有限。[54]宿主在大自然田野自由的活动，将促进蜱的传播，包括蜱进入到一个新的地区。高密度和多样性的种群宿主会增加蜱叮咬的机会，而这可能是把幼蜱、若蜱和小型哺乳动物[55]显著联系起来的原因，特别是这些哺乳动物为不成熟阶段的蜱提供了合适吸血的有利[41,55]条件，而大型哺乳动物提供大量的血餐，从而成为成蜱的主要宿主，并有力地影响[54,56,57]蜱的分布。[58]狍是欧洲常见的动物，也是研究较成熟的物种，这些动物经常被篦子硬蜱、边缘[58]革蜱Dermacentormarginatus和边缘璃眼蜱Hyalommamarginatum寄生。狍与人类密[59]切相关且广泛分布于欧洲，作为蜱的宿主起着突出的作用。蜱数量必然与狍数量多有5 [60][94]关，因此，狍密度大的地区被认为是具有高风险的地区。美国北部地区最重要的鹿[60][61]种是白尾鹿，而这种鹿是肩突硬蜱的最佳宿主。在过去的一个世纪，美国北方的鹿数量明显增加。除了受益于这些宿主种群的高密度，蜱也可以从它们的活动中得到益处：成年狍是在春天和夏天是领土的捍卫者，占统治地位的雄性，会驱赶那些未成年的狍或者是弱势雄狍，为蜱远距离传播提供了有效、快速的传播条件。狍以超过100公里的移居而闻名，[59]即使是几千里也是很常见的，这扩大了寄生蜱的分布范围。鸟类可以迁徙，因此流动性很大，它们可以长途跋涉，在较短的时间内就能够将蜱[62-64]带到非常远的地方去，这样鸟类在蜱和蜱传疾病的传播上起到了了重要作用。据估[65]计，每年春天候鸟会携带50-175万只肩突硬蜱横跨加拿大大陆，候鸟与蜱的分布范围就有着非常重要的联系。一旦被引入一个新的适宜的生态系统，蜱会寻找合适的本地动物宿主，甚至会通过进化，主动适应新的宿主。在新喀里多尼亚岛上的牛蜱种群，就在同一个地区内的两种宿主上，进化为两种不同的基因型，牛是原始宿主，鹿是一个新的宿主。这种发生在同[66]一区域的遗传隔离现象，还未超过244代，发生的时期还非常短。2.3.2宿主获得性免疫应答蜱被病原体感染，感染后病原体在蜱体内繁殖，会受到蜱和宿主动物双重影响，这[67]种影响不仅受到种属特异性分子调节，也受到宿主个体的年龄、性别和免疫状态现状[68]的影响。宿主的免疫系统在蜱叮咬和蜱传病原体感染的刺激下会被激活，启动固有性和获得[69][70]性免疫应答来抵抗侵袭。体液免疫、细胞免疫和免疫效应分子相继产生，蜱的吸血诱导了这一系列复杂的免疫反应，宿主的免疫调节和效应机制会激活体内抗原呈递细胞、细胞因子、免疫球蛋白、补体和T淋巴细胞等。趋化宿主的嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞聚集到蜱叮咬的部位，进入蜱口器的真皮和表皮周围，并且嗜碱性粒细胞和肥大[71]细胞脱颗粒，释放白三烯、组胺、前列腺素等炎性介质，诱导蜱产生免疫性排斥反应。[72]炎性介质会使蜱叮咬部位的血管通透性增强，造成局部水肿，同时组胺会抑制蜱流涎[73]和吸血。朗汉氏细胞作为专性淋巴细胞的抗原呈递细胞，会诱导唾液抗原迁移至淋巴[74]结，诱导蜱产生特异性抗体和补体的产生，导致了宿主产生获得性性免疫应答。虽然蜱已经进化具有抑制宿主免疫应答的能力，并能够摄取血液，但是宿主的免疫6 反应和蜱抵御宿主免疫防御的能力之间的平衡，对于蜱的生存和病原体的传播一个重要[69]影响因素。堤岸田鼠虽然是篦子硬蜱的天然宿主，但也发展产生了对蜱的获得性免疫[75]力，可以减少蜱的叮咬、减轻饱血蜱的大小和重量,但是黄喉姬鼠并没有形成对篦子[76]硬蜱的免疫力，虽然它也是这种蜱的天然宿主。获得性免疫力和免疫反应强度和宿主[77]种类和蜱寄生率有关。另外一个复杂因素宿主的激素水平，也会影响免疫力的发展，研究表明睾酮影响篦子硬蜱的获得性免疫力，高睾酮水平减弱宿主对蜱和蜱传病原体的[75]固有性和获得性免疫应答能力。3.蜱传病原体生态学研究病原体是否能够通过蜱叮咬传播给宿主，或者通过宿主传播给蜱。需要将两只蜱在同一个宿主上喂养，但并不一定要在同一时间。其中一只感染蜱去叮咬宿主，并且能够得宿主被感染，而另一个蜱则是通过宿主传播被感染的。一般来说，蜱和寄生虫有一个相同的特点，它们在一个宿主种群或者一个独立的宿主身上寄生，都会表现为聚合[78]或过度分散的形式。这有利于蜱在共同喂养过程中宿主不被感染，但当感染的蜱和一[79]个未受感染的蜱一起喂养时，未受感染的蜱可以通过感染蜱的唾液来摄取病原体。这样即使宿主本身没被感染，病原体也可以通过蜱在生活史不同阶段完成传播。例如，宿主感染伯氏疏螺旋体可以持续存活数周和数月，而感染森林脑炎病毒会引起病毒血症宿主很快就会死亡，所以蜱传脑炎病毒不像是伯氏疏螺旋体，病毒能够长期寄生在宿主体[80]内，伴随宿主整个生命周期。蜱传脑炎病毒的传播通常是通过共吸血方式完成，受感[79]染的若蜱和未感染的幼蜱吸食了同一宿主的血液。因此，森林脑炎的传播主要的原因是大量的未感染的幼蜱，吸食了在受感染若虫叮咬的啮齿目动物的血液。3.1气候因素病原体和蜱之间的紧密关系，使得病原体非常容易受到气候等非生物因素的影响。例如血红扇头蜱是康氏立克次氏体Rickettsiaconorii（可引起地中海斑点热）和立氏立克次体Rickettsiarickettsii（可引起落矶山斑疹热）的媒介，这种蜱不仅叮咬狗，而且也会叮咬人，在温暖的夏季这种叮咬现象会明显增加。这是因为温暖的气温会加快血红扇[81,82]头蜱寻求宿主的活动，从而导致了更高的感染立克次体病原的风险。[83]气候临界温度会影响了蜱传病原体的传播。在美国东北部莱姆病的发生与月降水[84]量、干旱程度和温度密切相关，春末夏初降水是最重要的气候因素，影响疾病的发生。如果一年中篦子硬蜱活动开始的比较早或者冬天也活动，那么病原体的传播就在一7 [85]段的时间内持续增加。然而，除了气候条件以外，传播也依赖于海拔高度。瑞士的一项研究指出，若蜱莱姆病螺旋体感染率与海拔高度呈负相关，也就是说在高海拔地区莱[38]姆病螺旋体不易传播。如果所占地域局部温暖干燥也会减少篦子硬蜱的种群密度，以[85]及在宿主身上共同吸血的幼虫和若虫蜱的比例，从而降低病原体的传输效率。寄生在若蜱体内的伯氏疏螺旋体，在27℃或者更低的温度下，可存活6个月，而在30℃时只有10%的若蜱被检测到螺旋体的感染，37℃时没有若蜱可检测到螺旋体的感[86]染，如果若蜱在高于27℃下孵化2周，若蜱将不能再感染啮齿动物宿主。有研究者通过目前有限的文献资料，分析温度对病原体疾病传播的直接作用，提出蜱的应激反应、找寻行为和病原体传播是相互关联的。蜱应激反应被温度变化激发，从[87]而抑制病原体感染，影响蜱的寿命。3.2生境特征因素蜱通常被动的停留在植物上或者待在宿主的巢穴中找寻它们的宿主，有时候也会积[88]极的爬向较远的地方主动寻找宿主。微观和宏观的气候因素都会影响蜱的这种行为，[89]因此气候变化也会影响感染人类感染蜱传疾病的风险。由于蜱在这种被动找寻行为，所以并不是每个栖息地都适用于蜱类种群的建立，蜱传疾病也不可能在这样的地区发生。其它更多的环境变化，如栖息地的连贯性也会影响[90]建立稳定的蜱类种群，所以适宜的蜱栖息地才有可能发生蜱传疾病。篦子硬蜱生存需要特定温度和湿度条件，这为蜱传森林脑炎病毒的传播提供了良好的栖息地和气候条件，这种气候条件基本要求是年平均温度约8℃，较高的相对湿度和≥92%的土壤湿度。感染蜱经常被发现在靠近森林边缘有多种植被覆盖的地区，比如草地、林中空地、河边的草地、沼泽地，有着浓密的树丛和灌木的人工种植林，以及落叶[91]林与针叶林之间的狭窄交接区。人工林可能会提高篦子硬蜱种群密度并且增强蜱传病原体传播的风险，因为森林生态系统作为缓冲区，可防止极端气候的出现和小气候的快速变化，但是人工林缺乏森林[44]生态系统的这种作用。土地覆盖物的不同，蜱传疾病的发生率也会不同，特别是在欧洲和美国北部蜱栖息地，对比耕地和荒废的土地之后，发现农业土地抑制了蜱传森林脑炎的发病率，研究还显示土地覆盖物的植物多样性和成片的森林，对于媒介和和宿主都是非常好的栖息地，这些地区蜱传森林脑炎的发病率相对就高，然而蜱传森林脑炎发病率低，不仅仅是因为8 [92]存在大面积的耕地，更因为那里的森林被很多的农业用地所围绕，森林被分割。3.3宿主因素[93]虽然宿主和蜱都可以寄生大量病毒、细菌以及原虫的病原体，但媒介传播病原体[16]的潜力主要受蜱和宿主接触频率和蜱的吸血的影响。此外，宿主储存病原体能力取决[94]于宿主本身复杂的敏感性或抗性。病原体能否在宿主体内寄生，关键因素是宿主补体[64,95]系统，它会杀死病原体。对于某些特殊病原体，可能由于适应了宿主的补体系统,[96,97]某些病原体能够利用宿主分子,保护自身免于补体替代途径的消灭。相反，当蜱叮[95]咬宿主后，那些不适应宿主的病原体，很快就会被宿主补体系统溶解杀死。3.3.1储存宿主蜱感染率强烈地依赖于蜱重要宿主的种群密度、易感性，还有宿主的感染率、感染持续时间和宿主免疫状态，因此主要的宿主携带病原体的状况，感染的强度，对于病原[98-100]体在一个区域的持久性存在是非常重要的。[49,以莱姆病为例，几十种脊椎动物已被确定为莱姆病螺旋体家族病原体的储存宿主100,101]。在疫源地发现许多蜱种、各种螺旋体菌株和大量的脊椎动物宿主存在复杂的互动关系，这种关系使得疾病在疫源地不会消失。这种特殊的关系已经在啮齿类动物和阿[96]弗西尼疏螺旋B.afzelii和伯氏疏螺旋体得到证实，鸟类和伽氏疏螺旋体B.garinii和法[49]雷斯疏螺旋体B.valaisiana之间也得到证实。在欧洲小型啮齿类动物被证实是莱姆病[98,102-104]流行的关键宿主，不仅是因为这些宿主的易感性，而且这些宿主对篦子硬蜱和[85]边缘革蜱具有偏好，尤其是在它们不成熟的发育阶段。某地区存在易感宿主，就为病原体传播提供了条件。圣路易斯脑炎病毒，可能是在[105]过去的几个世纪里，通过鸟类的迁徙，从非洲来到了美国北部。人们调查了向北迁徙的鸟类与莱姆病向北扩展之间的关系，发现寄生在鸟上的蜱携带着不同基因型的疏螺旋体，其中包括那些众所周知能够导致莱姆病的基因，然而这些基因型美国东北部非常[65]罕见。通过调查斯堪纳维亚岛上迁徙的鸟类，检测这些鸟类身上寄生蜱携带的螺旋体，发现了五种不同的蜱携带有多种莱姆病螺旋体。春天从南方或东南迁徙过来的鸟身上寄生的蜱，伽氏疏螺旋体是最普遍的类型，而从西南方向迁徙过来的鸟寄生蜱携带的螺旋[62]体基因型更为多样化。由此推断莱姆病基因型在欧洲和美国北部的多样性分布部分的原因是鸟类的迁徙造成的。[106]欧洲刺猬携带各种各样的不同的病原体，它也是篦子硬蜱和六角硬蜱Ixodes9 hexagonus的宿主，虽然六角硬蜱是一种巢居的物种，但重要寄生于刺猬身上，从刺猬[107]身上感染了病原体成为病原媒介。这也增加了篦子硬蜱在同一宿主身上吸血被感染[70]的概率，因此病原体能跨越物种传播的障碍，甚至传染给人类。通常情况某种宿主都[108]会被两种甚至两种以上的蜱叮咬，在不同蜱种会发现相同的病原体。3.3.2稀释宿主有些宿主会降低疾病传播的风险，因为这些宿主不太容易将病原体传播给吸血的[109]蜱，它们减弱了病原体主要储存宿主的作用。一些反刍动物对蜱传病原体来说就是稀释宿主，特别是针对莱姆病螺旋体。虽然病原体被认为是通过蜱吸血来传播的，但是[110]绵羊不易患莱姆病。研究发现在草丛中捕获的蜱大约有25%感染了莱姆病螺旋体，但在牛和山羊的身上的饱血蜱并没有莱姆病螺旋体的感染，因此似乎是未成熟的幼蜱和若蜱，从啮齿类动物身上获得了对反刍动物的预防能力，使得莱姆病发生风险降低。这些结论并不能解释其它的疏螺旋体，如米亚摩托疏螺旋体Borreliamiyamotoi,有些没有[97]动物预防能力的反刍动物，可以检测到感染了相应的病原体。稀释效应降低了蜱媒介[111]的感染率，但它不一定减少蜱的种群密度。[55]在自然界中,这种稀释效应最有可能的原因是生物多样性的增加。物种越丰富种类越多样，就会降低疾病风险。在捕食等发生宿主交换时，稀释效应明显的影响群落中优势地位的储存宿主。也有另外的可能,这些物种希望成为蜱传病原体的终末或稀释宿[68]主，但同时也为吸血蜱非系统性病原体的传播提供了机会。这可能就解释了，虽然对[59]于人和狍来说，都不是莱姆病螺旋体适应的宿主，但是在人莱姆病发病率和狍种群密度之间存在着密切的联系。稀释效应理论也受到其它研究的挑战，这些研究显示在某些生态群落中，生物多样[112]性的消失会导致疾病发生率的下降。这是因为病原体在多个物种间比在两个物种间[113]传播的更广泛，特别是当病原体适宜的宿主在密度和分布上都是优势种群的时候。最近稀释宿主的概念受到广泛的质疑，有科学家认为稀释宿主理论只适用于特定、有限[114]的范围。生物多样性和动物疫源性疾病之间的关系还非常复杂，不是简单的对应关系，这就意味着我们研究疾病生态学变化是非常重要的，由此可以来预测动物疫源性疾[115]病的发生风险。3.3.3获得性病原体免疫力虽然一些病原体通过蜱抑制宿主免疫防御机制中获益，但宿主血液中的补体成分已10 [64]被证明是特异性的有效成分，可以有效的杀灭相应的病原体。蜱叮咬可让BALB/c小鼠产生对病原体的免疫力，在一个研究中，对照组小鼠被感染了莱姆病螺旋体的肩突硬蜱的若蜱叮咬，结果所有的小鼠检测后发现都感染了莱姆病螺旋体。实验组小鼠首先是被未感染的蜱叮咬，让后再被感染的蜱叮咬，结果发现只有16.7%的小鼠被病原体蜱感染。小鼠体内对蜱产生的抵抗力，也导致了对病原菌抵抗，发生这种结果原因，可能是[70]由于蜱的叮咬，激活了小鼠宿主体内免疫系统。人们检测了获得性免疫力对蜱侵扰的免疫效果。利用两头欧洲牛做实验，用小亚璃[67]眼蜱Hyalommaanatolicum的若蜱叮咬这两只牛，另一头牛对照，不让蜱叮咬，然后所有的牛被人工接种环形泰勒虫，这种虫子可以引起牛患泰勒虫病。然后若蜱在牛身饱血后被取下来检查，那些事先被小亚璃眼蜱叮咬过牛身上的若蜱，产生了明显的抵抗力，比对照组泰勒虫感染率明显降低。这表明宿主对蜱的免疫力，影响了蜱作为病原体媒介[64,116]的能力，对蜱产生的抗体，决定了病原体是否能够存活和传播的可能性。4.宿主-蜱-病原体动态变化关系生境破碎化、城市化、再生林和人工林这些主要的人类活动和其它土地利用改变、[18,气候变化因素，加上自然环境的动态变化，都影响着宿主-蜱-病原体三者之间的关系117]。这些因素的研究涉及到广泛的学科，包括自然和人文地理、气象学、社会学、兽医、人类医学以及生态学等。尽管目前在某些区域已做了深入研究，但有些重要的内容还很不清楚。4.1生境破碎化生境破碎化是指一片大面积连续的生境，变成了很多面积较小的斑块，斑块之间被[118][119]公路或建筑隔离。生境破碎化对生活在这个地区的生物群落影响非常巨大。生境破碎化的结果是过去大片的栖息地被分割成小的栖息地，因此栖息地边缘地带比过去增加了很多，而且在边缘地带的物种多样性也增加了，这对在栖息地生存蜱的宿主非常有[120]利，但是因为生境破碎化，造成栖息地分割、迁徙走廊改变、捕食增多和蜱类寄生[121][122]也会对野生动物也会产生不利的影响。某一种宿主数量会根据环境变化，像鹿这样的大型草食动物会从边缘地带丰富多样的植被中获利，同时也可以食用附近的农作物，从而减少了到城市或郊区附近栖息地被狩猎的可能，在冬天还可以将景观植物作为[59,75]食物和隐蔽物。复杂景观栖息地中蜱的密度要高于均匀的森林景观栖息地，这可能是因为复杂景观11 [56]下生活有大量供成蜱吸血的宿主。在美国东部高度破碎化的景观生境中，肩突硬蜱若蜱密度和感染伯氏疏螺旋体若蜱的密度与栖息地面积呈负相关，这导致栖息地越小宿主[123]和人类感染莱姆病的风险越大。虽然森林破碎化会导致栖息地中许多脊椎动物的灭亡，但是美国东部的白足鼠Peromyscusleucopus，并没有因为森林破碎化并减少数量。白足鼠是若蜱典型的宿主，可携带多种病原体，它在小面积栖息地比在大面积栖息地中的数量还多，这也导致受感染的若蜱增多。另外由于缺少其他脊椎动物的捕食和竞争，[123]也导致了白足鼠绝对密度增高，也会潜在的影响感染的若蜱数量。人们分析影响土耳其克里米亚-刚果出血热分布的环境因素，发现既不是单一的气候因素，也不是植被的变化，实际上与任何单独的季节性因素都无关，而与栖息地生境[124]破碎化密切相关。4.2城市化从二十世纪的下半叶,人类的人口已经增加了一倍多，这种扩张还将未来几十年里持[125]续下去，到2070年左右预计达到100亿。随着社会和经济的变化，人口数量的快速[126]增长，会有越来越多的人迁移到城市中生活。城市的快速扩张，将大自然迅速变成了人工景观、建筑、工业厂区，这些环境的变化造成的后果就是动植物的种类和数量产生巨大变化，自然栖息地消失，小气候和气候变化,产生城市热岛效应。强烈的景观变化导致了复杂的马赛克状的异质性景观，在市区和郊区的栖息地往往不在适合有些生物的生存，野生动物多样性和数量都会减少，因此，蜱传病原体的传染源也就会减少。然而，有一些物种能够适应新的环境，在市区环境中生存。这些动物宿[127]主在市区和郊区的种群密度远远高于原住地密度。它们利用城市中人类倾倒的垃圾或者得益于人们故意的喂养，在城市中大量的繁殖，也大大增加了与人类接触的机会[128]。在发达国家，城市化通常是有序进行的，发展过程中会建设大量的绿地，而在发展中国家，由于城市扩张太快，无序化的建设通常会造成城市基础设施不完善、居民住房[129]条件很差、高密度的人口、贫困的郊区和高污染的城市中心。无论哪一种发展模式，[130]都给蜱和宿主建造了适宜的生存空间，同时也为蜱传疾病创造了条件。发达国家城市中的绿地，公园、森林和花园，提高了公民的生活水平。在城市的绿[131]地中，篦子硬蜱等蜱类也找到了适宜生存的小气候条件，还有丰富的宿主。欧洲刺12 [100]猬是一种常见的，适合城市生态系统的物种，在它们身上经常发现篦子硬蜱和六角硬蜱，这两种蜱都携带有多种病原体，可引起多种人畜共患病原病，包括蜱传森林脑炎[132]病毒、无形体和多种基因型的莱姆病螺旋体。这些病原体是从来自柏林（德国），布达佩斯（匈牙利）和汉堡（德国）的刺猬身上检测到的，它们参与到了蜱传疾病的城市[133]循环中来。在美国北部地区，白足鼠在分散的地区往往最多，特别是在城市中小的、[134]孤立的林地中间，这为未成熟蜱吸血和保持病原体提供了基础条件。另一个促进城市中蜱完成整个生命周期的要素是中型和大型的动物宿主。鹿作为篦[133]子硬蜱成蜱阶段的主要宿主，通常不会在城市的中心活动，此时，刺猬可能就成了篦子硬蜱成蜱的代理宿主，当重要寄生宿主发生转变时会导致城市中的病原体种类和感染率发生变化，这种情况在德国慕尼黑的研究中得到证实，发现城市花园中螺旋体感染[135]率不同寻常的高。在某些情况下，蜱传病原体可以改变原有的传播方向，转向传染给适应城市的蜱，这会引起疾病分布的变化。落基山斑疹热是一种在美国长期存在由立克次体体引起的蜱传疾病，最初发现于美国西北部和北部中心地区的各州，通常由安氏革蜱Dermacentor[136]andersoni传播，但是后来疾病分布发生了改变，转移到了美国的南部中心地区、南[137]部和东部地区，这种改变是因为这些地区的变异革蜱是一种城市蜱。当变异革蜱落成为基山斑疹热立克次体的主要媒介后，就增加了人感染的风险。不仅是城市景观，而且在城市中气温也会不同于周边地区，平均气温通常会高出1℃[138]至6.5℃，如果是在温暖的季节，气温会更高。这种城市热岛效应可能是由于城市建筑深色表面吸收了大量的热能，然后通过红外辐射的方式释放出去造成的，植被缺乏也[139]是城市热岛效应形成的因素之一。这种温度变化模式可能会影响蜱在城市中的生存、繁殖和分布产生一定的影响，而且也会对蜱从不同发育阶段的活动产生影响，从而影响病原体的感染率。伯氏疏螺旋体就显示了能够在苛刻的温湿度条件中寄生在篦子硬蜱体[140]内，这将导致城市中被感染蜱数量增加，蜱传播疾病体的风险加大，但是非常遗憾，[141]我们对这方面的研究还很少。工业化和使用大量汽车产生大量重金属，这会给蜱栖息地环境造成污染，这些污染[142]物可以导致蜱的外骨骼发育异常。蜱角质层出现异常后更容易感染多种蜱传病原体，现在发现蜱会出现多重病原体复合感染的现象，这也反映出蜱行为已经发生了改变，活[143]动性变得更强，增加了人类感染疾病的风险。13 随着城市的扩大，大量人口扩张进入农村、城市郊区，这些地方过去都是森林或农业用地等自然、半自然的环境。城市扩张的结果是野生动物与人和家畜接触的机会增多，[144]而人类被蜱叮咬，感染蜱传病原疾病的机会也大大增加。尽管城市化减少了野生动物寄生虫的数量和和种类，然而在能够适应城市环境的宿主种群中病原体的传播会增多[141][145]，结果而导致人畜共患病和蜱传病原体周期性的出现在城市中。在美国东北部的大量研究已经证实了人类活动会增加感染的风险，在城市郊区的居民区中莱姆病螺旋体[111]感染率明显增高。人为景观和自然景观相互交错的群落，建立起一种特别重要的生态环境。在相对狭小的空间中，聚合在一起重叠分布的媒介生物和宿主，非常有利于莱[45]姆病的传输。这种人类扩张模式和与蜱传病原体感染的之间的联系，在世界其他地区的研究中也得到证实。印度萨加尔-萨拉伯尔地区是夸塞纳森林病流行的中心，疾病的流行被认为是人类在森林地区定居造成的结果。生态交错带为距刺血蜱Haemaphysalisspinigera和它们的宿主野生猴子提高了良好的栖息地，会增强动物疫源性疾病在该地区建立稳定的[146]传播周期。4.3土地利用景观的自然平衡被人为打乱，这种影响最早可追溯到史前时期，从那时候开始人类在土地上耕作、开垦森林和进行土地灌溉，随着人口数量的急剧增多，这种对土地的利[147]用状况也不断在加剧。即使是人类对自然生态系统一个小的有限影响，也可能为动物和植物产生一个新栖息地。在欧洲主要在德国中部和南部地区的北面，以前是广阔的[148]牧场为嗜热物种提供了重要的栖息地，许多冰河期之前的物种得以保存到现在。现在植树造林和生境破碎化，可能会导致适宜蜱生存的栖息地增加，从而引起蜱传[124]病原体传播上升。在欧洲，为了获取更多的农田和居住的空地，从七世纪开始进行了第一次大规模的森林砍伐，接着因为人口数量的增加，对商品需求的不断增长导致了第二次大规模的森林砍伐。在北美，许多地区的森林退化呈现复杂的由东向西的梯度变[149]化，这样的变化是因为十七和十八世纪欧洲人，不断移民到美洲造成的。世界上许[150]多国家曾经为了发展农业，倡导绿色革命，大规模的砍伐森林，在20世纪，又转为发展农业集约化和退耕还林。为了森林资源的可持续发展，采取垦荒和退耕还林的策略，[74]为肩突硬蜱和篦子硬蜱建立了适宜生存的栖息地，成为蜱传疾病流行的关键因素。一般情况，土地利用会改变一个地区的小气候和蜱潜在的宿主种类。蜱要适应这种14 改变后单一的耕地环境和恶劣的小气候条件，实际上，农业土地根本不适合篦子硬蜱的[151]生存。然而，植树造林和退耕还林有可能开辟了一个新的栖息地，拥有适宜的小气候条件和蜱类宿主，这也为蜱类种群的建立和和蜱传疾病的流行创造了条件。4.4家畜自古以来，畜牧业就增加了人类感染人畜共患传染病的机会。各种各样的脊椎动物[2,152]都是人畜共患病的宿主，宠物和家畜是这些病原体最大的传染源。在发展中国家，人口稠密的城市和城郊贫民区往往含有饲养大量的家禽和家畜，这些动物被饲养在小规模的家庭农场中，成为人们的食物或者家庭的收入来源。家畜们与人密切的生活在一起。这种情况为蜱提供了足够多的宿主，也为蜱提供了极好的生存条件，另外，由于家畜与人类的密切接触也增加了蜱传疾病的发生。农民和一些特殊的职业群体与牲畜的接触比较多，所以人们并不奇怪，在世界范围内地方病流行的农村地区，从事农业生产的工人和部分的农民是克里米亚-刚果出血热[153]感染的最高风险者，同时这些地区璃眼蜱也非常丰富。在南非的一个农村社区，从当地农民体内检测到高感染率的克里米亚-刚果出血热抗体，并且已证实与他们处理过[154]羊羔有关。在与动物密切接触的情况下，暴露给蜱传病原体，软蜱发挥着特殊的作用，如毛白[155]钝缘蜱Ornithodorosmoubata，发现与人密切接触并且可以在人类住所中发现。这种蜱还有其它种属的蜱能够传播蜱传回归热，至少有15种不同基因型的螺旋体能够引起[156]此病。在坦桑尼亚中部，蜱传回归热螺旋体利用鸡、猪等家畜作为储存宿主，钝缘[157]蜱口作为一个动物和人之间的桥梁媒介在这一地区传播。山羊和牛可以消除蜱传螺[97]旋体的感染，从而降低了人感染莱姆病螺旋体的风险。除了家畜，宠物也能改变人感染蜱传病原体的风险，这些动物是一些病原体的潜在的宿主，因此增加了人类暴露于蜱传病原体的风险，宠物可以携带莱姆病、埃立克体病、[158]落基山斑疹热、蜱传脑炎病毒，但是人类是否能够感染疾病还要取决于这些病原体[158]的传播周期，还有蜱的行为特征。有人定义了三种不同的流行病学特征，用以描述不同的蜱传病原体传播方式。第一种情况，某种病原体通过蜱传播，比如篦子硬蜱，这[91]些蜱具有广泛的宿主，在这种情形下，宠物只是充当了人类感染疾病哨兵的角色。第二种情况，病原体的传播只有在蜱内容物暴露的情况下才能发生，通常是由于宿主动物的抓挠或者人为不适当操作造成蜱损伤，蜱内容物得以暴露。如贝氏柯克斯体Coxiella15 burnetii，可引起Q热。这种疾病频繁的出现在剪羊毛工人身上，这些工人在剪羊毛的[159]时候，往往会切开蜱或者接触到蜱的粪便。第三种情况被认为是最重要的形式，也最有可能传播人畜共患疾病，这种方式宠物是媒介蜱的宿主。狗蜱Rhipicephalussanguineus与狗密切生活在一起，在狗窝和动物收容所聚集，甚至通过狗进入到人的家[160]中。另外非常重要的是在最佳条件下，这种蜱每年可以繁殖四代，而且雄蜱可以在[24]不同的狗身上多次吸血，这就增加了病原体传播的潜在风险。在这种情况下，狗明显增加了人和蜱的接触机会，从而导致康氏立克次体和立氏立克次体等人畜共患病传播的[6,24]风险加大。世界各个国家的人都养猫，猫是最普遍的伴侣动物，尤其是在发达国家。猫和它们[161]的主人生活的非常紧密，所以猫也成了除狗之外另一个重要的疾病传染源。猫已被[162]证实携带有螺旋体、巴尔通体、埃立克体、立克次体等多种蜱传病原体。甚至在发[163]现莱姆病是由蜱传疾病之前，人们就已经发现接触猫能够增加患莱姆病的风险。汉[164]氏巴尔通体Bartonellahenselae可引起猫抓病，原来以为是经由跳蚤传播，最近发现[165]篦子硬蜱叮咬猫也可传播此病。另外携带有汉氏巴尔通体的硬蜱，被发现可以与伯[166]氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体复合感染。4.5人类行为除了蜱的种群密度和感染率等因素，在某个特定的地区，蜱传疾病是否能够流行，[167]还取决于感染蜱是否能够接触到人这种社会因素。因此，人在环境中的活动方式也[168]是被蜱叮咬感染疾病的重要因素。如果在蜱出没的栖息地工作，将会增加感染蜱传病原体的风险，尤其是那些定期、频繁地进入栖息地的人员。护林员、猎人和伐木工人的工作地点是森林，因此他们最容[169,170]易感染蜱传疾病。导致在这些工人中各种蜱传疾病高发的原因，最重要的因素是他们与植被的密切接触，尤其是在蜱活动的栖息地区域内，最容易发生蜱虫叮咬。一项来自奥地利的研究表明，与其他群体相比，猎人似乎特别容易感染蜱传病原体，因为莱[169]姆病螺旋体、埃立克体、土拉菌在猎人中被检测出相对高滴度水平的血清抗体。这个结果与另外一个研究结果相同，通过比较几组户外工作人员的莱姆病螺旋体的血清抗体，发现血清抗体阳性率最高的人群也是猎人。猎人会长时间停留在蜱栖息地，接触大[171]量蜱宿主的尸体并且经常进入到灌丛中，与蜱接触的风险很大。除了伐木工人、猎人等因为工作关系进入到蜱栖息地的行为，其他人类的活动中也16 可能偶然遇到蜱出没的栖息地，如遛狗或收集在蜱栖息地的柴火的行为被是增加了暴露的风险。在印度卡纳塔克邦的村民，会因为经常到居住地附近的森林里收集木柴，而容[146]易受到距刺血蜱的叮咬感染夸塞纳森林病。钓鱼、慢跑、徒步登山等休息活动，这也被确定为感染的危险因素之一，因为这些[172]活动通常是在户外自然环境中进行的，这些环境往往也是蜱良好的栖息地。通过调查进行户外活动的人群，发现每周花在户外活动的时间越长，莱姆病血清阳性率越高，但是如果比较风险率，休闲活动对人类感染疾病来说还是低风险的。因为毕竟人们进行这些休闲活动不是非常频繁，而且徒步或者登山的时候，人们总是在道路上行走，不进入到灌丛和灌木林，而这些地方才是蜱类经常活动的区域。世界各地的城市都在快速增长，生活在大量建筑群中的人口大量增加，人们也越来越喜欢走到户外，除了运动和娱乐外，人们也可以因此获得健康。户外活动通常发生在自然和半自然生境，如森林或公园。在城市中绿地人们会经常举行烧烤、野餐、日光浴[173]或游戏等娱乐活动。虽然在这些城市绿地环境缺少蜱的大型动物宿主，但是蜱在适当的环境条件下仍能在城市内建立稳定的种群，蜱传病原体感染率也可以达到很高的水[135]平。战争、社会的瓦解和冲突，连同它们造成的环境后果是人类行为变化的主要因素，[11]也被认为是导致过去刚果克里米亚出血热爆发流行的重要原因之一。在第二次世界大战期间，当苏联军队开始占领克里米亚草原，人们因为战斗而不能耕种土地，从而闲置了大片的耕地。结果，在这些荒废的土地上，出现了大量携带亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum的野兔，野兔和亚洲璃眼蜱是刚果克里米亚出血热的宿主和媒介，这造成了刚果克里米亚出血热在当时的军队中流行，尤其是信号员和侦察兵，因为他们经常在浓密[11]的树丛和灌木丛中行动。后来，苏联领导的结束，社会经济的转变，人们的活动也发生了改变。无论是大量的失业和贫穷还是财富和娱乐的增长，都转变了人们的工作和休闲方式。这些社会因素影响着疾病的流行，在许多东欧和中欧的国家，在20世纪90年代早期开始，蜱传疾病发病率从2倍增长到了30倍明显的增长，就与人们的生活方式、[174]行为转变有关。此外，人们为了发展,逐渐开始个体经营，饲养了更多的绵羊和山羊，[175]这些动物通常在蜱活动的森林边缘地区放养。蜱传森林脑炎病毒感染的家畜生产的奶制品，被人食用后可引起人类发生蜱传森林脑炎，但是这是一种特殊的情况，也是非[176]常罕见的，但是也有流行病学的证据证明，在斯洛伐克和其他的东欧国家，森林脑17 [175]炎的发生是因为食用了污染食物。其他原因，也许更重要，上世纪90年代，东欧大部分区域发生巨变，人们为了增进彼此的交往和发展经济，户外活动大大增多，比如去采集野果和蘑菇，参加这些活动，人们会经常的进入蜱活动的栖息地。随着对蜱传疾病认识，自我保护意识的提高，人们更加积极的避免自己和伴宠物进入到蜱的栖息地。有越来越多的证据表明，当面临潜在的致命病原体时，人们会改变自[177]己的行为从而减少患病的风险。这种行为改变与一些研究观察到的结果是一致的，研究表明在易感人群中发病的风险，会随着人们行为转变和有效接种疫苗而明显降低[178]。苏联解体后，在波罗的海周边的国家，观察到蜱传疾病感染的病例数明显减少，这[179]是因为大部分人都进行过免疫接种。而在失业和低收入人群中发现的蜱传疾病相对高的患病率，事实上是这些人没有接种疫苗。人类为了规避疾病风险而采取转变行为方式，是驱动森林脑炎发病减少的原因。发展中国家的公共卫生状况比欧美发达国家要差，尽管也采取了一些规避行为，但公众为自己和他人的健康所做出的努力是极低的。坦桑尼亚中心地区的农村，有些人喜欢在炎热的季节在户外睡觉，这是为了避免被住所中的软蜱叮咬，这些钝缘蜱携带有回[179]归热螺旋体。5.全球变化和蜱传疾病的传播5.1气候变化[180]气候变化如何影响蜱传疾病的流行还是一个有争论的话题。正如我们所观察到的，蜱传疾病对气候和小气候条件变化非常敏感。在过去的一个世纪，在世界范围内降[181]水量增加了大约1%，最高温度增加了0.88℃，最低温度提高了1.86℃，显示出降水量、温度条件等是在系统性的变化中。有研究显示北美、欧洲蜱和蜱传病原体的分布都在增加。这与气候变化有关，最主[182]要的原因是较高的年平均温度，更温暖的冬天和春天方便了蜱的发育。暖冬、全球[183]变暖对北方冬季影响是明显的，可能会减少蜱宿主的死亡率并延迟蜱活动期。篦子硬蜱已经明显的蔓延到了瑞典高纬度地区，扩大了蜱传森林脑炎的传播分布，从而增加了这些地区感染的风险，但是，这些研究还很有限，发生的变化也可能是其它因素引起[183,184]的，比如狍种群数量的增加或者是人类活动的增加造成的。18 捷克共和国1993年-2001年与1984年–1992相比，蜱传森林脑炎发病率增加了两倍。发病率的提高不仅发生在已知地区，而且一些过去没有发病的地区，或者只见偶发[185]病例的地区也出现的增长。此外，在高海拔地区观察到篦子硬蜱分布增加，并扩展到波希米亚山区。这种变化与提高的月平均温度有关，特别是在篦子硬蜱最活跃的时期[186]。类似情况也出现在瑞典，蜱传森林脑炎发病率与在波西米亚的暖冬相关，在暖冬小型哺乳动物死亡率下降，导致幼蜱相对容易的找到一个合适的宿主，此外，人类户外[187]活动也依赖于天气的变化，这使得分析疾病流行又增加了一个可能的因素。在美国，[188]安氏革蜱是几种人类病原体传播媒介，包括土拉菌病、立克次体、科罗拉多蜱热病毒。[189]基于美国科罗拉多州的气候变化，气候变暖导致了安氏革蜱分布和数量的剧烈变化，从而扩大了病原体传播的风险地区。尽管气候变化通过一种或几种方式影响媒介蜱和病原体的分布，例如促进形成新的[189][19]媒介蜱栖息地，改变了蜱传病原体传播的高峰期，延迟了高峰期的持续时间，但是因为缺少长期观察数据，很难评估这些变化是怎样发挥作用的。造成这种情况的原因是多方面的,首先很难以区分气候变化和气候规律性的变异，因为每次的气候变化信号都[190]叠加在气候变异噪音背景之上；其次蜱传病原体和气候变化之间的联系很难做出判断，因为目前数据报告非常有限，而且报告来源于各个不同的国家；最后蜱传疾病是个[88,非常复杂的系统问题，对蜱类种群和蜱传病原体分布，气候因素不是唯一的影响因素191]。这种复杂性使得气候变化对蜱传疾病的影响，不像是线性的关系，反而会因为对气候变化的格外关注可能导致了对社会现象作用的忽视，这些社会现象更能影响人类的行[192]为，从而减少蜱传疾病的发生。5.2旅行和贸易今天，世界公民行动的总里程之和大约为23亿公里/年，预计到2050年将达到105[193][194]亿公里/年，这个结果将会增强媒介蜱和病原体在世界范围内的传播。蜱和蜱传病原体成功入侵的前提条件是拥有足够大的蜱类种群数量，蜱类能够适应新的环境条件，而且还要有易感宿主存在。至今还没有报道，在没有宿主的情况下，有感染蜱入侵到某个地区并引起疾病。这似乎说明人为因素导致的宿主动物长距离转运，才是引起蜱入侵[6]到新的地区的原因。牲畜大量转运已经被证实会导致蜱和相关的病原体进入新的地区，彩饰花蜱Amblyommavariegatum最早分布在非洲，也是非常最重要的蜱，可以传播非[195]洲蜱咬热和克里米亚-刚果出血热病原体。现在它广泛的分布在30多个国家，加勒比19 地区的入侵开始于十九世纪，随着感染的牛从非洲进入到瓜德罗普岛和邻近岛屿，然后20世纪50年代蜱传遍了整个加勒比海地区。发生这种情况的原因，可能是由于牛背鹭的数量增加造成的结果，牛背鹭这种鸟通常作为未成熟彩饰花蜱的宿主，它们能够促进[196,197]蜱的传播。不仅彩饰花蜱，其它几个非洲蜱种也可能会以这种方式传播，如果气候发生变化而且存在适应的蜱类栖息地，就为蜱的传播奠定了基础。增加流动性的另一个的原因是旅游。国际旅行者进入到疾病流行的地区具有潜在的[198][315]风险，因为他们往往不了解相关的知识，所以很容易暴露于有蜱活动的栖息地，并且由于医生缺乏蜱传疾病治疗经验，被漏诊或者误诊，旅行者将蜱传疾病带回家乡[199]。6.结语气候变化和生物多样性在减少蜱传疾病中的起到的作用都是真实存在的，而现有的气候变化数据还不能肯定是全球变暖的原因，导致了蜱的分布和数量变化。现在大部分的数据是短期和局部的研究结果，但是设计真正容易理解的野外研究并且充分的分析这些数据是非常困难的事。另外人们已经知道有超过三分之一的蜱能够在人体上吸血，并且大部分都能够传播病原体，但是对宿主-蜱-病原体系统的研究来自篦子硬蜱和肩突硬[200]蜱为主的几个蜱种。因此研究范围还需要扩大到其它的蜱类，否则对其它宿主-蜱-病原体系统的复杂变化会产生误解。蜱传疾病的流行是一个复杂动态变化的系统，其中涉及媒介蜱、宿主、非生物和生物环境的特性。要全面充分理解这一系统，需要足够长的时间来评估现有的和以后出现的变化，将大、小尺度不同的研究结合起，来分析对蜱传疾病分布的影响。所以研究需要跨学科的团队来进行，不仅了解蜱生态学知识、具备蜱传病原体分子检测的能力，而且需要自然地理、人文地理、气象学、社会学、兽医学、临床医学以及公共卫生管理学科的知识和经验。这个系统的复杂性以及对人类和动物健康的重大影响，使得蜱与蜱传疾病研究成为一项交叉性研究，需要整合不同领域的专业知识，同时也是整体化研究的一个模型。20 第一章全沟硬蜱种群分布和季节动态全沟硬蜱Ixodespersulcatus在全球分布广泛，范围横跨欧亚大陆，从波罗地海到太平洋，不仅包括前苏联的大部分土地，而且有一些分布在波兰和中国北方，蒙古、韩国[201]以及北海道岛和日本附近的几个小的岛屿。上世纪九十年代以前，全沟硬蜱分布在[202]我国黑龙江、吉林、辽宁、甘肃、山西、新疆、西藏地区(图1.1)。随着全球气候变暖、城市扩张、土地利用、人类户外行为等多种原因，导致蜱类种群分布面积扩大，蜱[203][204]传病原体增多。近些年的研究表明全沟硬蜱在内蒙古、河北、宁夏、天津、北京[205][206]已经有分布，甚至河南也有发现，提示种群分布范围有扩大的趋势。全沟硬蜱是我国北方地区的优势种,在针阔混交林（海拔700～1000米）出现的最多。自然环境中，成蜱活动期会持续3至6个月，一般从冬季雪开始融化的4月和5月开始，延续到当年[207]的7月至9月，季节发生往往取决于特定区域的小气候条件。幼蜱和若蜱季节发生与成蜱相对应，尽管可能会长于成蜱。蜱的季节发生往往与个别蜱的生活史并不吻合。全沟硬蜱可寄生在近300种不同的脊椎动物（约100种哺乳动物，超过175种鸟类和一些爬行动物）。幼蜱主要寄生在哺乳动物（啮齿类和食虫动物），若蜱寄生在中型哺乳[201]动物和鸟类（啮齿类动物、兔、一些食肉动物），成蜱寄生在大型哺乳动物。成蜱极易叮咬人，是人类感染不同病原体的主要来源，包括森林脑炎病毒、莱姆病螺旋体、[201]无形体、埃立克体等。对于全沟硬蜱的研究大多数是来源于原苏联的资料和实验室[208]条件下的研究，我国境内全沟硬蜱的种群分布、栖息地选择、季节发生动态及宿主选择等生态学特性方面的研究还比较少。因此本研究选取内蒙古额尔古纳国家级自然保护区，对自然条件下全沟硬蜱季节发生动态、地理分布、生活史各阶段寄生情况进行系统调查，以期为深入了解全沟硬蜱和蜱传播疾病的流行规律，为蜱与蜱传疾病的防控提供数据依据。21 图1.1全沟硬蜱在中国的地理分布(图中红色标记为研究地点)Fig.1.1DistributionofI.persulcatusinChina.Thestudysiteisindicatedbytheredlyshadedcircular.1.1材料与方法1.1.1研究地点本研究选择在内蒙古额尔古纳国家级自然保护区(120°00′26″～120°58′02″E,51°29′25″～52°06′00″N，)作为研究地点(图1.1图中红色圆点部分)，自然保护区位于内蒙古中俄边境地区，与俄罗斯只有一江之隔。研究时间为2012年4月至2014年3月。保护区冬季最低温度可达-44.5℃，夏季温度最高温度可达29.8℃，年平均气温6.4℃。在保护区内建立可控自然环境(120°03'15"E,51°36'27"N,海拔468m)。可控自然环境为200cm×200cm样方，用于观察全沟硬蜱的生物学特性。样方外周建造10cm×10cm水槽，起到隔离外界蜱进入，防止里面的蜱逃脱的作用，而且可控环境外周建有150cm高的木制栅栏，防止其它大型动物进入破坏样方。样方内部人工覆盖8cm厚度，从周围采集来的落叶，而且长有披碱草Elymusdahuricus,兴安老鹳草Geraniummaximowiczii,腺毛委陵菜Potentillalongifolia,藜Chenopodiumalbum,蒙古蒿Artemisiamongolica22 和大麻Cannabissativa等植物，使得可控环境与周围自然生境保持一致。采购新西兰纯种白兔多只，作为蜱吸血宿主，饲养在兔笼内(30cm×40cm×50cm)。实验过程中取其中一只兔子置于样方内，作为蜱吸血的动物宿主。采集保护区野外自由生活的全沟硬蜱，投放到样方内，观察蜱的宿主找寻行为和季节发生动态。选择另外的兔子，放置在可控样方周围，将蜱人工饲养在兔子耳朵上面，观察自然条件下全沟硬蜱各个阶段的生物学特性和生活史周期。兔子处于自然光照和气候条件下，采用玉米和草喂养并随机给水。温湿度数据记录仪(购于河北省邯郸市清胜电子科技有限公司)放在样方内，距离地面50cm高度，每2h记录一次空气温湿度，并统计月最低、最高及平均温度及相对湿度(图1.2和图1.3)。30TmeanTmin20Tmax10))℃0℃-10温度(-20Temperature(-30-40-50AprMayJunJulAugSepOctNovDecJanFebMarAprMayJunJulAugSepOctNovDecJanFebMar月份Month图1.2内蒙古额尔古纳国家级自然保护区2012年4月至2014年3月最高、月最低及月平均温度图Fig.1.2Mean(Tmean),maximum(Tmax)andminimum(Tmin)airtemperature(◦C)fromApril2012toMarch2014，inEergunaNationalNaturalConservationArea,InnerMongolia,China.1.1.2羊体寄生情况在蜱分布的栖息地自由放养的山羊汇总，随机选择10只作为实验观察对象。于2012年4月至2014年3月间，每周在羊体上采集寄生的蜱，并且记录采集的部位、蜱的数量和发育阶段。将羊体划分为五个寄生部位，耳部、面部、犄角根部、颈部和躯干部，调查时间选择在下午16:00～18:00之间。在调查期间，自由放养的羊，都没有接受过杀蜱处理。23 RHminRHmean100RHmax908070605040相对湿度(%)30RelativeHumidity(%)20100AprMayJunJulAugSepOctNovDecJanFebMarAprMayJunJulAugSepOctNovDecJanFebMar月份Month图1.3内蒙古额尔古纳国家自然保护区2012年4月至2014年3月最高、月最低及月平均相对湿度图Fig.1.3Mean(RHmean),maximum(RHmax)andminimum(RHmin)relativehumidity(%)fromApril2012toMarch2014，inEergunaNationalNaturalConservationArea,InnerMongolia,China.1.1.3啮齿类动物寄生情况在灌丛、草地等能够利用拖旗法收集到蜱的生境中，选择夹夜法捕捉啮齿类动物。在2012年6月至9月期间，每周进行一次捕捉，在三条线路上面放置捕鼠笼(25×15×212cm)，每间隔8～10m放置一只捕鼠笼，一共放置200只，总共覆盖大约6000m的地区。每次选择在晚上5～7点放置捕鼠笼，次日早上7点检查捕捉情况，一般以玉米为饵料，连续捕捉两晚。捕捉到的啮齿类动物先用乙醚麻醉，检查啮齿动物体表，收集[202]寄生蜱，随后释放存活的啮齿动物。在显微镜下依据中国经济昆虫志对蜱进行分类[209]鉴定，并根据动物志对啮齿动物进行鉴定。1.1.4自然环境中的全沟硬蜱采取拖旗法调查自然环境中全沟硬蜱数量，拖旗时间一般选择在上午10:00～12:00和下午15:00～17:00，每周拖旗一次。在额尔古纳自然保护区选取阔叶林、针叶林、灌2丛,海拔470m)及草地四种生境各1000m作为调查样方。用1.5m×1.0m白色棉布制做的布旗，旗子一端有木棍把手，方便拖旗。大约10m/min速度拖动布旗，每移动20m检查一次布旗，仔细观察布旗上面微小的蜱类，将蜱收集到采集瓶中，同时记录采集的数量、地点、生境和蜱的发育阶段。24 1.1.5数据统计使用SPSS（StatisticalProductandServiceSolutions）软件进行数据统计。利用用方差分析和卡方检验来统计全沟硬蜱生境分布、寄生期及非寄生期季节发生动态、幼蜱和若蜱的宿主类型、寄生强度的差异性。本项研究涉及到的概念，宿主感染率是指感染的宿主动物数量除以捕捉到的该物种宿主动物总量。寄生强度是指每种宿主动物体寄生全[210]沟硬蜱的数量除以感染的宿主数量。1.2结果1.2.1全沟硬蜱羊体寄生季节发生数量及动态整个调查过程中共从羊体采集到410头寄生的全沟硬蜱，绝大部分是成蜱。统计数据表明从每年的4月初，全沟硬蜱开始出现，此时野外自然环境的积雪已经融化，然后逐步下降，至5月下旬达到高峰，至7月中旬成蜱全部消失。整个调查期间，未发现有全沟硬蜱幼蜱寄生于羊体，在羊体上虽然发现若蜱，但是数量非常少，只有2只。2012年和2013年两年数据比较，成蜱出现的数量和时期相似。全沟硬蜱成蜱在羊体的寄生动态见图1.4。图1.42012年3月至2013年8月自羊体收集全沟硬蜱数量动态Fig.1.4NumberofI.persulcatuscollectedondomesticgoatinthepasturefromMarch2012toAugust201325 1.2.2全沟硬蜱羊体寄生位点根据全沟硬蜱主要寄生部位，将羊体划分为五个寄生位点，分别是耳部、犄角根部、面部、颈部和躯干部。统计全沟硬蜱在这些寄生位点的数量和比例，耳部46只，所占比例为11%；犄角根部13只，所占比例为3%；面部4只，所占比例为1%；颈部为210只，所占比例为50%；躯干部147只，所占比例为35%(图1.5)。发现全沟硬蜱成蜱主要寄生在羊体的颈部和躯干部，其他部位寄生的数量比较少。在整个调查期间，仅发现少量全沟硬蜱若蜱寄生在羊体上（n<10）。统计结果显示，在羊体寄生的全沟硬蜱成蜱，雌雄性比约为0.9:1。图1.5为全沟硬蜱在羊体的不同寄生部位及比例。图1.5全沟硬蜱成蜱羊体吸血偏嗜位点Fig.1.5PercentageofcollectedI.persulcatusfromperattachmentsiteondomesticgoat1.2.3全沟硬蜱幼蜱和若蜱在啮齿类动物寄生数量及动态2012年4月至9月期间，共捕捉到啮齿类动物217只，分属于3个种类，大林姬鼠Apodemusspeciosus(啮齿目：鼠科),花鼠eutamiassibiricus(啮齿目：松鼠科)黑线姬鼠Apodemusagrarius(啮齿目：鼠科)。大林姬鼠数量最多。通过卡方检验表明，大林姬鼠、花鼠、黑线姬鼠幼蜱和若蜱的感染率都无显著性差异(p>0.05)；通过方差分析幼蜱寄生强度有显著性差异(p<0.05)，黑线姬鼠幼蜱寄生强度最强，大于大林姬鼠和花鼠(p<0.05))，但大林姬鼠和花鼠的幼蜱寄生强度无显著性差异(p>0.05)；若蜱寄生强度无显26 著性差异(p>0.05)。调查期间捕捉到的黑线姬鼠数量最少，但幼蜱和若蜱的宿主感染率和寄生强度都是最高。全沟硬蜱幼蜱和若蜱的宿主感染率和寄生强度见表1.1。表1.1全沟硬蜱幼蜱和若蜱不同啮齿动物宿主感染率和寄生强度卡方检验和方差分析Table1.1Comparsionofprevalenceandmeanintensityofimmatureticksondifferentrodents2capturedinthefiledusingXanalysiswithBonferroniadjustmentandANOVA宿主幼蜱若蜱种类数量感染率数量寄生强度感染率数量寄生强度大林姬鼠15782.83232.649.2911.4A.speciosus花鼠4875.01052.955.6331.7E．sibiricus黑线姬鼠∗1283.3424.260.081.3A.agraius共计217-470--132-Total∗注：表示数据统计差异显著(p<0.05)。Note:Datasharingthedifferentsuperscriptarestatisticaldifferent(p<0.05).自2012年4月至9月，在啮齿类动物身上，共采集到全沟硬蜱602只，其中幼蜱470只，若蜱132只。没有在啮齿类动物身上发现全沟硬蜱的成蜱。幼蜱主要在4月至7月活动，5月中旬出现第一次活动高峰，随后数量下降，6月下旬出现第二次活动高峰，两次活动高峰基本相似，后到7月中旬逐渐消失。若蜱和幼蜱活动时间相似，只在5月下旬出现一次较高的活动高峰，其它时间数量变化不大，在7月下旬活动消失。冬季调查期间未发现全沟硬蜱幼蜱和若蜱活动。图1.6为全沟硬蜱幼蜱和若蜱季节发生动态。27 图1.6全沟硬蜱幼蜱和若蜱在啮齿类动物寄生动态Fig.1.6Totalnumberoftickscollectedontherodentsineachweekcapture1.2.4自然环境中全沟硬蜱季节发生动态自2012年4月至9月间，从灌丛收集到自由生活全沟硬678只，包括227只幼蜱，157只若蜱和294只成蜱，从草地共收集到245只蜱，包括127只幼蜱，21只若蜱和97只成蜱。自2013年4月至9月间，从灌丛收集到自由生活全沟硬822只，包括276只幼蜱，186只若蜱和360只成蜱，从草地共收集到408只蜱，包括220只幼蜱，64只若蜱和124只成蜱。在针叶林和阔叶林中发现的全沟硬蜱数量很少(n<10)。统计数据显示，灌丛和草地中蜱的分布数量与针叶林和阔叶林相比具有极显著性差异(p<0.001)。在调查中发现，内蒙古额尔古纳自然保护区，野外生活的全沟硬蜱成蜱每年在4月上旬出现，5月下旬出现活动高峰，至8月上旬停止活动。这与全沟硬蜱在羊体的寄生情况动态具有高度相关性(r=0.886)。幼蜱和若蜱活动期相似，在5月开始出现，较成蜱活动滞后1个多月，直到9月上旬消失，活动高峰在6、7、8月份出现多次。全沟硬蜱在灌丛和草地两种生境中的活动周期具有相似性。10月份后，在灌丛和草地生境中就没有发现自由活动的蜱。全沟硬蜱在灌丛、草地各发育阶段季节发生动态见图1.7、图1.8、图1.9。28 图1.7灌丛和草地自由生活全沟硬蜱成蜱2012年3月至2013年8月季节发生动态Fig.1.7Captureoffree-livingticksofIxodespersulcatuscollectedintheshrubsandmeadowfromMarch2012toAugust2013图1.8灌丛和草地自由生活幼蜱2012年5月至2013年9月季节发生动态Fig.1.8Captureoffree-livingLarvaeintheshrubsandmeadowfromMay2012toSeptember201329 图1.9灌丛和草地自由生活若蜱2012年5月至2013年9月季节发生动态Fig.1.9Captureoffree-livingNymphsintheshrubsandmeadowfromMay2012toSeptember20131.2.5可控自然环境全沟硬蜱宿主找寻行为及吸血特性自然环境中刚孵化或者刚蜕皮的全沟硬蜱幼蜱和若蜱活动能力比较差，活动范围限制在直径50cm以内，当感知到周围有宿主时，可主动向宿主动物方向爬去。自孵化或者蜕皮开始，幼蜱大约需要5～7天，若蜱大约需要3～6天才会叮咬宿主。如果没有宿主，或者没有发现宿主，幼蜱和若蜱一般会选择在没有阳光直射的区域躲藏，通常是植物或者石头的底部。即使时在植被的尖端等待宿主，也会选择避免阳光的直射。当叮咬宿主时，全沟硬蜱幼蜱和若蜱会选择叮咬兔子的眼睑和鼻部，啮齿类动物的耳部、面部和腋下的位置，背部虽然也会被叮咬，但数量较少。全沟硬蜱的幼蜱和若蜱吸血能力不强，叮咬成功后开始的几天内，吸血速度缓慢，最后两天吸血速度加快，饱血后迅速脱落。通过情况下成蜱需要短暂吸血期后，才开始交配，但也观察到没有经过交配就直接快速吸血的蜱，这可能的原因是从野外自然环境中采集到的蜱，已经发生过交配。雌蜱饱血离开宿主后，雄蜱大部分会停留在宿主身上，但不再吸血。一天之中，成蜱的活跃期一般在下午的12:00～14:00和晚上的18:00～20:00。当夜间或气温变冷时，成蜱活动较少。1.3讨论全沟硬蜱为典型的三宿主蜱，既往的实验研究，已经证实在实验室条件下，蜱在兔30 子身上可以完成完整的三个生活史发育过程。在自然环境中，全沟硬蜱的成蜱主要侵袭牛、羊、马、狍、鹿等大型哺乳动物，而幼蜱和若蜱主要寄生在啮齿类等小型哺乳动物[202]身上。本研究确认了全沟硬蜱的宿主类型，发现全沟硬蜱成蜱主要寄生在羊等大型哺乳动物体上，有少量若蜱会寄生在羊体，但是在整个调查过程中，没有在羊体上面发现全沟硬蜱的幼蜱寄生。调查啮齿类动物，证实全沟硬蜱的幼蜱和若蜱会侵袭保护区内的大林姬鼠、花鼠、黑姬线鼠。统计数据显示大林姬鼠、花鼠、黑姬线鼠都是全沟硬蜱幼蜱和若蜱的主要宿主，其中黑姬线鼠的寄生强度最强。幼蜱和若蜱在这三种啮齿类动物的寄生期相似。在2012年5月至9月中旬期间，没有在自然保护区内鸟类体表发现蜱寄生。野外自然条件下全沟硬蜱季节发生动态和羊体寄生情况的数据显示，自然条件下，全沟硬蜱一年时间内不能完成一个完整的生活史周期，一个生活史周期最少需要两年时间。在一年中，全沟硬蜱各个生活史活跃阶段具有交叉性，这造成一年中出现多次活动周期的高峰，尤其是幼蜱和若蜱表现的更为明显，这是因为当年孵化的不成熟蜱与过冬的不成熟蜱相互交叉到一起造成的。冬季在草间上面和灌丛上未发现活动的全沟硬蜱。各个发育阶段饱血蜱和饥饿的成蜱和若蜱可以通过适应性的滞育行为，度过寒冷的冬季，在次年相继苏醒，继续进行下一阶段的生活史周期。不同月份饱血的全沟硬蜱，因为其产卵和孵化的时间不同，而且全沟硬蜱成蜱、饱血的幼蜱和饱血的若蜱都能够过冬，使得在一年总全沟硬蜱各发育阶段存在重叠现象。成蜱主要在4月到8月活动，活动高峰出现在5月下旬（图1.7），8月至第二年3月发现的成蜱无吸血行为发生。幼蜱和若蜱出现的时间大体相似，在5月下旬至9月上旬，在6、7、8月份会出现活动高峰，最高峰出现在7月下旬(图1.8和图1.9)。综上所述，可以看出全沟硬蜱的越冬能力很强，对自然环境的适应形成了多个发育阶段都能够过冬的能力，显示出强度生物适应性。本研究发现自然环境中的全沟硬蜱，在保护区不同生境的分布具有极显著性差异(p<0.001)，约91%的全沟硬蜱分布在灌丛和草地，针叶林和阔叶林中分布数量较少，全[211,212]沟硬蜱对生境的选择是由温度、湿度及宿主等多种环境及生态因子决定。在保护区，灌丛和草地生境，为全沟硬蜱提供适宜的小气候条件，而且在这些地方生活着大量的啮齿类动物，花鼠虽然大部分时间在针叶林和阔叶林中的树上活动，但也经常会到灌丛和草地中觅食，这就为幼蜱和若蜱提供了叮咬的机会。全沟硬蜱种群分布、季节动态及宿主、生境选择等生态学知识，为国家进行动物生31 态保护，制定有效的人兽共患病防控措施，提供了基础理论依据。在不能消灭啮齿类动物宿主，从而减少幼蜱和若蜱数量的时候，如果采取减少牛、羊进入保护区或者对牛、羊定期进行消毒，施放杀蜱类药物等措施，将有利于降低全沟硬蜱成蜱数量，从而也会降低由其繁殖的幼蜱和若蜱数量，最终会导致来年全沟硬蜱的种群数量的减少。32 第二章全沟硬蜱生活史全沟硬蜱Ixodespersulcatus是专性吸血的体外寄生动物，也是非常重要的人兽共患疾病传播的媒介生物，能够传播森林脑炎病毒、埃立克体、无形体、莱姆病螺旋体、斑[213]点热立克次体、巴贝斯原虫等在内的多种病原体。上世纪九十年代以前，全沟硬蜱[202]分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、甘肃、山西、新疆、西藏地区(图1.1)。随着全球气候变暖、城市扩张、土地利用、人类户外行为等多种原因，导致蜱类种群分布面积扩[203][204]大，蜱传病原体增多。近些年的研究表明全沟硬蜱在内蒙古、河北、宁夏、天津、[205][206]北京已经有分布，甚至河南也有发现，提示种群分布范围有扩大的趋势。既往文献中对全沟硬蜱繁殖规律、生活习性等生物学特性描述的不是很多，为了准确的掌握全沟硬蜱的生活史，建立实验室条件下的饲养方法，获得足够数量用于全沟硬蜱的研究，我们开展了本项实验，以期为深入了解全沟硬提供理论和实验依据。2.1材料与方法2.1.1蜱的采集和饲养方法全沟硬蜱的成蜱采集自中国内蒙古额尔古纳国家级自然保护区(120°00′26″～120°58′02″E,51°29′25″～52°06′00″N)。蜱被饲养在家兔耳朵上，并且保存在河北师范大学动物实验中心(38°03´N,114°2630´E)，实验室温度为23～25℃，相对湿度（RH）为80%，日常光照环境。饱血后的蜱（包括成蜱、幼蜱和若蜱）被收集在玻璃试管中，试管中放置一张吸水用的折叠滤纸条，试管用脱脂棉堵口，保存在25～27℃，相对湿度85%，日常光照的气候培养箱中。2.1.2全沟硬蜱成蜱生物学特性观察记录成蜱的吸血前期、吸血期、产卵前期、产卵期。60只从野外采集的全沟硬蜱的饥饿成蜱(30只雌蜱，30只雄蜱)单独称重后放置在家兔耳上吸血。为防治逃脱和方便收集饱血后雌蜱，兔子耳朵用白色棉布套包裹，一端用医用胶带在兔耳基部固定，另一端用医用胶带封口，当放入和取出蜱时，解带封口端胶带。每天观察蜱在兔耳吸血状态。收集饱血脱落的雌蜱，对每只蜱称重后记录后，放入玻璃管(1.5cm×10cm)，用棉塞封住管口，置于人工气候箱中，每天观察卵的孵化情况，记录产卵前期、产卵期，每天产下的卵被小心收集后计数。为方便计算产卵量，可以先称量100粒卵，知道100粒卵的重量后，雌蜱产卵的重量除以100粒卵的重量，再乘以100就换算出该蜱所产卵的数33 量。收集计数500只卵，每日观察孵化情况，记录孵化期。孵化期是指雌蜱将卵产出到卵开始孵化的时间。当孵化结束后成为幼蜱时，计算孵化效率和蜱的生殖效率指数(REI)，[214]生殖效率指数是每只蜱产卵的数量除以雌蜱的饱血体重(mg为单位)。2.1.3全沟硬蜱幼蜱和若蜱生物学特性观察幼蜱和若蜱的吸血前期、吸血期、蜕皮期。选择刚刚孵化的100只幼蜱和刚刚蜕皮的若蜱60只，单独称重后放置于兔耳部，每天观察叮咬状态，观察蜱的吸血状况，记录吸血前期。另外100只幼蜱，60只若蜱，单独称重后，分别在7天和10天后，放置在兔耳上观察吸血情况，记录吸血期。收集饱血后脱落的的幼蜱和若蜱，记录数量单独称重后，放置到不同玻璃试管中，用棉塞封口，记录蜕皮期。幼蜱和若蜱不吸血时被保存在人工气候箱中。显微镜下观察记录蜱的性别。吸血前期定义为卵孵化成幼蜱或者幼蜱蜕皮成若蜱，开始叮咬宿主吸血的时间。2.1.4统计分析以上数据分析采用MicrosoftExcel2010和SPSSV19.0统计分析软件进行。2.2结果2.2.1实验室条件下全沟硬蜱生活史在实验室条件下全沟硬蜱完整生活史（从成蜱到成蜱）平均为123.2天（范围93～149天）。幼蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为25.6天；若蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为29.3天；雌蜱吸血前期、吸血期、产卵前期、产卵期合计为36.6天；卵孵化期为31.7天。整个发育阶段见表2.1。2.2.2全沟硬蜱吸血特点及体重变化幼蜱和成蜱蜱叮咬在兔耳后，开始的几天吸血缓慢，随后才快速饱血。雌蜱开始缓慢吸血，等待雄蜱交配，交配后快速饱血，但也有部分雌蜱叮咬兔耳后就直接快速吸血，这提示蜱从自然环境采集回来前，有部分雌蜱已经发生过交配行为。雄蜱通常会吸几次血，每次约为15～20分钟，吸血量不多。雌蜱饱血后会从兔耳上脱离，而雄蜱仍然会叮咬在兔耳上。表2.2描述了全沟硬蜱幼蜱、若蜱和成蜱吸血前后体重变化。34 表2.1实验室条件下全沟硬蜱不同发育阶段生活史长度Table2.1ThedurationsofvariousdevelopmentalstagesofI.persuleatusunderlaboratoryconditions发育阶段发育时期数量时间范围（天）均值±标准误卵孵化期100028-3531.7±2.6幼蜱吸血前期1001-21.4±0.4吸血期1003-54.0±0.9蜕皮期10013-2820.2±2.9若蜱吸血前期601-32.1±0.5吸血期604-64.8±0.6蜕皮期6016-3422.4±1.6雌蜱吸血前期182-32.6±0.3吸血期187-98.1±0.9产卵前期182-76.0±2.2产卵期1815-2719.9±0.62.2.3全沟硬蜱产卵特性产卵开始的几天，产卵量一般较少，在3～5天的时候会出现一个短暂的高峰，然后稍有下降，在9～11天的时候会出现一个产卵的高峰期，之后慢慢减少至产卵结束。(图2.1)产卵数据进行线性回归分析，结果表明雌蜱饱血体重与生殖力呈显著相关(r=0.716,p<0.001)(图2.2)，雌蜱的生殖效率（REI）（产卵量/饱血雌蜱体重）为4.35。卵的孵化率平均为88.5%。表2.2实验室条件下全沟硬蜱幼蜱、若蜱和成蜱吸血前后体重变化Table2.2Changesofbodyweightoflarvae,nymphsandadultsbeforeandafterfeedingunderlaboratoryconditions.饥饿体重(mg)饱血体重(mg)比率发育阶段测试数量(M±SEM)(M±SEM)(饱血/饥饿)幼蜱1000.04±0.000.45±0.0515.00若蜱1000.22±0.003.87±1.5917.59雌蜱301.56±0.00373.68±12.03239.53雄蜱301.50±0.001.79±0.351.1935 图2.1实验室条件下雌蜱饱血体重和产卵量的关系(统计数据基于35头雌蜱)Fig.2.1Relationshipbetweenengorgedweightandnumberofeggslaid(basedon30females)heldunderlaboratoryconditions.图2.2实验室条件下全沟硬蜱雌蜱日产卵量分析(统计数据基于28个雌蜱)Fig.2.2MeandailyovipositionoffemaleI.persuleatus(basedon28females)underlaboratoryconditions.Verticalbarsindicatestandarderrorofthemean36 2.3讨论全沟硬蜱为典型的体外寄生蜱，一个完整的生活史中至少经历三个宿主。在自然环境中，其生活史各个阶段都需要在宿主动物体上吸血，饱血后从宿主体脱落，进入到生活史下一阶段继续发育，并更换宿主动物。研究表明，全沟硬蜱成蜱通常会寄生在羊、[202]马、牛、鹿等大型家畜和野生动物，而幼蜱和若蜱会侵袭小型啮齿类动物和鸟类。在实验室条件饲养下，通常选择家兔和大鼠作为宿主动物。全沟硬蜱实验室条件下生活史研究表明，全沟硬蜱生活史各阶段均能正常饱血，饱血蜱在蜕皮或产卵之前从宿主身上脱落，进行下一阶段的发育。一般情况下全沟硬蜱需要3～4年才能完成一个完整的生活史，成蜱主要在4～6月找[202]寻宿主吸血，活动可持续到当年的10月份，6月和9月会出现两次活动高峰。由于蜱在各个发育阶段，遇到宿主并且吸血的时间月份不同，表现在其生活史上，时间长短会存在明显的差异。这种差异产生的原因，是由于蜱的发育受自然环境中的温度、湿度及[215-217]宿主等多种生态因子的影响，其中滞育可能是影响发育时间长度的主要因素。我们的研究，实验室条件下全沟硬蜱完成整个生活史平均需要123.2天，提示在一年内可以完成一个完成的生活史周期，比在自然条件下生活史周期显著缩短。行为滞育和形态滞育是蜱类等节肢动物发育进化中的适应性行为，在不利于繁殖和发育的条件下，由神经内分泌调控的低代谢活动状态，通过滞育来抵御恶劣的环境条件[218]，如果在夏季后期未成年蜱才完成饱血，将没有时间在秋季到来之前完成蜕皮，它们将进入到形态滞育，一直到下一年夏天才会开始蜕皮。饥饿的未成年蜱会发生冬眠，冬眠是一种行为滞育，直到第二年春季这些蜱才会开始活动。卵和饱血的成蜱不会冬眠[201]。各个发育阶段的蜱都可以过冬，只是过冬后存活率会有明显的不同，饱血幼蜱、若蜱、成蜱存活率分别为96.6%、93.3%、3.3%，饥饿幼蜱、若蜱、成蜱存活率分别为6.6%、[219]86%、90%。所以大多数情况下，全沟硬蜱的自然种群由不同发育阶段的蜱类组成。本研究中，实验室条件下，温度在23～25℃之间，全沟硬蜱幼蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为25.6天；若蜱吸血前期、吸血期和蜕皮期合计为29.3天；雌蜱吸血前期、吸血期、产卵前期、产卵期合计为36.6天；卵孵化期为31.7天。完整生活史平均[220]为123.2天（范围93～149天），这与在实验室环境中，温度相似情况下，钝刺血蜱109.6天，镰形扇头蜱Rhipicephalushaemaphysaloides86～120天,亚洲璃眼蜱Hyalomma[221]asiaticum104～147天,嗜群血蜱88～125天的生活史周期相似。比较硬蜱属其它种37 [222]类蜱产卵前期的时间,红色硬蜱是14天，六角硬蜱Ixodeshexagonus是8.4天，篦子[223]硬蜱Ixodesricinus是10天，全沟硬蜱产卵前期最短是6天。比较产卵期，全沟硬蜱的产卵期19.9天，在硬蜱属中也是相对短的，红色硬蜱39天，卵形硬蜱19.1天，篦子[224]硬蜱22天。分析全沟硬蜱产卵前期和产卵期较短的现象，可能是全沟硬蜱对低温的适应性进化表现，保证了蜱在寒冷地域下的生殖繁衍。实验室条件下全沟硬蜱生活史观察，虽然不能反映全沟硬蜱自然条件下季节发生行为，但也为全沟硬蜱的种群动态研究提供了一些参考，并且本研究建立了全沟硬蜱的实验室种群，为以后蜱类特异性效应分子和蜱传病原体方面的研究，提供了良好的基础。38 第三章全沟硬蜱病原体感染研究全沟硬蜱Ixodespersulcatus是一种专性吸血、可长期存活的三宿主寄生动物，可以[225,226]携带多种病原体并且传染给人和动物，造成多种人兽共患病。在我国已经被证实[227][228][229]经由全沟硬蜱传播的疾病包括森林脑炎、莱姆病、人埃立克体病，经病原体[230]检测证实我国全沟硬蜱还携带有斑点热群立克次体、查菲埃立克体Ehrlichia[231][231][232]chaffeensis、人粒细胞无形体、巴贝斯原虫,不仅如此全沟硬蜱还存在两种和两种以上病原体复合感染的情况，比如人粒细胞埃立克体与伯氏疏螺旋体复合感染、粒细[233]胞埃立克体与斑点热群立克次体复合感染、伯氏疏螺旋体与斑点热群立克次体的感[234][235]染、森林脑炎病毒、人粒细胞埃立克体和伯氏疏螺旋复合感染、森林脑炎病毒、[235]立克次体和伯氏疏螺旋复合感染。俄罗斯报道一只全沟硬蜱上最多有七种病原体（包[236]括亚型）共感染的情况。本研究是在对额尔古纳国家级自然保护区蜱类种群分布、季节消长和生活习性充分研究的基础上，对在保护区内采集到的全沟硬蜱进行病原体检测，通过此项调查更好的了解保护区内全沟硬蜱病原体的感染状态，以便更深入的研究全沟硬蜱种群生态与蜱传疾病之间的关系。3.1材料与方法3.1.1全沟硬蜱的采集在内蒙古额尔古纳国家级自然保护区(120°00′26″～120°58′02″N,51°29′25″～52°06′00″E)，利用布旗法和羊体采集自然条件下的全沟硬蜱，将蜱收集到装有湿润滤纸条的玻璃试管中，记号笔标记采集的位置、生境、日期。在保护区一共收集到1225只全沟硬蜱，本实验选择其中的224只进行了实验，其中灌丛150只、草地74只；雌蜱164只、雄蜱60只；饱血雌蜱112只，饥饿成蜱112只；2012年5月60只、6月52只、2013年5月112只。采集到的全沟硬蜱，在超净台中，用75%乙醇浸泡30分钟，然后双蒸馏水冲洗，在干净的滤纸上面晾干。将蜱分装在2mlEP管中，有记号笔标记号码，然后放置于-80℃冰箱中保存。3.1.2实验仪器与试剂全自动核酸提取仪（北京百泰克生物技术有限公司），PCR仪、电泳仪、伯乐凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司），纯水仪，水浴锅，高压锅，振荡器，制冰机，-80℃39 冰箱，-20℃冰箱，生物安全柜。组织微生物基因组DNA共提试剂盒（磁珠法），PCR反应试剂、DNAMarker、核酸染料均购自北京百泰克生物技术有限公司，蛋白酶K，溶菌酶。3.1.3实验方法3.1.3.1DNA提取-80℃冰箱中将蜱取出，将装有蜱的EP管置于冰上，使用消毒后的外科手术剪刀将蜱剪断，剪的越充分越好。剪碎的蜱放入组织微生物基因组DNA共提试剂盒中。在试剂盒第一列深孔板中加入20µl蛋白酶K（20mg/ml），50µl溶菌酶(50mg/mL)，将深孔板平稳放入自动核酸提取仪，然后将搅拌套插入到卡槽中。设置核酸提取仪的程序，具体程序见表3.1。裂解温度设为50℃，实验结束后，小心取出搅拌套和深孔板，将深孔板的第6列和第12列中的核酸溶液转移至EP管中。表3.1自动核酸提取程序设置Table3.1AutomaticnucleicacidsextractionprogramSettings等待时间混合时间磁吸时间混合容积步骤孔位名称（分钟）（分钟）（秒）速度（微升）11裂解转移0400慢50022转移磁珠0130慢30031磁珠吸附01060慢50043漂洗0330中50054漂洗0230中50065漂洗0230中50076洗脱31560慢20082弃磁珠000慢03.1.3.2病原体基因特异性引物合成根据文献报道，合成不同蜱传病原体PCR引物。所有引物由上海生工生物公司合成。合成见表3.2。40 表3.2引物序列及目的基因Table3.2Thesequenceofprimerandthetargetgenes病原体引物序列目的基因LD15'-ATGCACATCTGGTGTTAACTA-3'B.b.s.l./16SrRNALD25'-GACTTATCACCGGCAGTCTTA-3'VS461（r）5'-GCATGCAAGTCAAACGGA-3'B.a/16SrRNA莱姆病螺VS461（f）5'-ATATAGTTTCCAACATAGC-3'旋体BG-15'-GGGATGTAGCAATACATGT-3'B.g/16srRNABG-25'-ATATAGTTTCCAACATAGT-3'BB-15'-GGGATGTAGCAATACATTC-3'B.b.s.s./16SrRNABB-25'-ATATAGTTTCATAGG-3'查菲埃立HGE-1F5'-GGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3'HGE/16SRrna克体HGE-3R5'-TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTC-3'嗜吞噬细HME-1F5'-CAATTGCTTATAACCTTTTGGT-3'HME/16SrRNA胞无形体HME-3R5'-CCCTATTAGGAGGGATACGACCTT-3'BAB-15'-CTTAGTATAAGCTTTTATACAGC-3'5'-ATAGGTCAGAAACTTGAATGATACAB.microti/sp/nss-rDNA巴贝斯原BAB-4-3'虫PIRO-A5'-AATACCCAATCCTGACACAGGG-3'B.microti/odocoileisp/nssPIRO-B5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'-rDNA斑点热立OmpBf5'-GCATCTGCACTAGCACTTTC-3'OmpB克次体OmpBr5'-GGCAATTAATATCGCTGACGG-3'3.1.3.3PCR扩增病原体基因建立25µlPCR反应体系，5µl的10×buffer，0.1µlrTagE，2µldNTP，上下游引物各1µl，1µl模板，加入15µl水混匀。PCR反应条件：广义伯氏疏螺旋体Borreliaburgdorferisensulato：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，59℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。狭义伯氏疏螺旋体Borreliaburgdorferisensustricto：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，51℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。41 伽氏疏螺旋体B.garinii：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，50℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。阿弗西尼疏螺旋体B.afzelii：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，48℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。查菲埃立克体HGE：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，52℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。嗜吞噬细胞无形体：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，52℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。巴贝斯原虫：94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，60℃退火40s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。斑点热立克次体:94℃预变性2min，35个循环，每个循环在94℃变性30s，56℃退火30s，72℃聚合40s，72℃延伸3min。以上PCR扩增反应结束后，分别取8µl扩增产物与1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压为5v/cm，电压时间为30min。在凝胶成像系统中拍照分析条带结果。为避免交叉污染，核酸提取、PCR检测和随后的凝胶分析都分别在不同的实验室进行。3.2实验结果内蒙古额尔古纳国家自然保护区通过PCR特异性引物扩增病原体基因，在224只全沟硬蜱中检测到莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体三种病原体，未检测到查菲埃立克体和嗜吞噬细胞无形体，未发现病原体有共感染的情况。224只全沟硬蜱中发现9只感染莱姆病螺旋体、11只感染巴贝斯原虫、2只感染斑点热立克次体，感染率分别为4.02%、4.91%、0.89%。所发现的莱姆病螺旋体均为伽氏疏螺旋体，巴贝斯原虫为微小巴贝斯原虫。使用SPSS统计软件对病原体PCR检查结果进行分析。比较全沟硬蜱莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体感染率，在2012年和2013年的数据，显示感染率没有显著性差异，P=0.171、P=0.122、P=1.000，见表3.3。比较雌性和雄性全沟硬蜱莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体感染率，显示感染率没有性别的差异，P=0.108、P=0.075、P=0.071，见表表3.4。比较灌丛和草地两种生境下全沟硬蜱莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体感染率，显示感染率没有生境的差异，P=0.108、P=0.075、P=0.071，见表3.5。比较饱血成蜱和饥饿成蜱全沟硬蜱莱姆病螺旋体、斑点热立克次体感染率，显示感染率没有差异性，P=1.000、P=0.498，而巴贝斯42 原虫显示出有显著性差异P=0.030，见表3.6。表3.3不同年份全沟硬蜱病原体感染结果分析Table3.3ThePCRpositiveresultoftick-bornepathogensondifferentyears2012年2013年2病原体XP感染数量感染率感染数量感染率莱姆病螺旋体76.25%21.79%Fisher’s0.171巴贝斯原虫32.68%87.14%2.390.122斑点热立克次体00%21.79%Fisher’s1.000表3.4不同性别全沟硬蜱病原体感染结果分析Table3.4ThePCRpositiveresultoftick-bornepathogensondifferentgender雌雄2病原体XP感染数量感染率感染数量感染率莱姆病螺旋体43.58%58.33%2.5770.108巴贝斯原虫53.05%610%3.1790.075斑点热立克次体00%23.33%Fisher’s0.071表3.5不同生境下全沟硬蜱病原体感染结果分析Table3.5ThePCRpositiveresultoftick-bornepathogensondifferenthabit灌丛草地2病原体XP感染数量感染率感染数量感染率莱姆病螺旋体76.67%22.70%0.7190.397巴贝斯原虫65.71%56.76%0.0001.000斑点热立克次体21.90%00%Fisher’s0.512表3.6饱血雌蜱与饥饿成蜱感染病原体结果分析Table3.6ThePCRpositiveresultoftick-bornepathogensbetweenfedtickandunfedtick饱血雌蜱饥饿成蜱2病原体XP感染数量感染率感染数量感染率莱姆病螺旋体43.57%54.46%0.0001.000巴贝斯原虫98.04%21.79%4.6850.030斑点热立克次体00%21.79%Fisher’s0.49843 表3.7全沟硬蜱病原体PCR检测结果Table3.7ThePCRpositiveresultoftick-bornepathogens种类数量莱姆病螺旋体巴贝斯原虫斑点热立克次体人粒细胞无形体查菲埃立克体饱血雌蜱11249000饥饿成蜱11252200灌丛10576200草地7425000雌蜱16445000雄蜱60562002012-560520002012-652210002013-5112282003.3讨论本研究选择主要能够引起人患病的蜱传病原体进行检测，发现额尔古纳国家级自然保护区内的全沟硬蜱携带有莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体。说明保护区内全沟硬蜱如果叮咬人，可传播这三种病原体引起疾病。对比2012年和2013年病原体感染情况，这三种病原体两年感染率没有显著性差异，说明这这三种蜱传病原体没有在全沟硬蜱种群中增加。对比雌蜱和雄蜱病原体感染情况，这三种病原体没有显著性差异，说明不同性别的全沟硬蜱对这三种病原体感染率相同，没有性别差异。对比灌丛和草地两种不同生境下，全沟硬蜱感染这三种病原体情况，没有显著性差异，说明灌丛和草地中的全沟硬蜱感染这三种病原体情况相同，没有生境差异。对比饱血雌蜱和饥饿成蜱，莱姆病螺旋体和斑点热立克次感染率没有显著性差异，说明蜱吸血并没有增加这两种病原体感染，而在巴贝斯原虫感染率的比较中，我们发现饱血雌蜱感染率为8.04%，饥饿2成蜱为1.79%，X=4.685，P=0.03，结果显示蜱吸血后明显增加了巴贝斯原虫的感染率，出现这种情况的原因，分析说明全沟硬蜱通过叮咬啮齿类动物后吸血，增加了巴贝[237][238]斯原虫在蜱体内的传播。已有的研究表明，莱姆病病原体和斑点热立克次体可以通过蜱叮咬动物，在宿主动物中流转，也可以通过蜱经期传播至下一个生活史阶段，还可以经卵传播给子代。巴贝斯原虫能够通过蜱叮咬动物，但是否能够通过经期和经卵传播需要进一步的研究。在本研究中莱姆病螺旋体、巴贝斯原虫、斑点热立克次体虽然未44 [235,239][234]发现有病原体复合感染的情况出现，但是在中国黑龙江省、吉林省的全沟硬蜱病原体复合感染的情况很多，这种复杂的感染状况比单一病原体感染对人类的伤害更[235,240]大，而且不利于疾病的诊治。内蒙古额尔古纳国家级自然保护区位于中俄边境地区，与俄罗斯仅以一江之隔，通过宿主动物的迁移、中俄贸易的交往，货物和人员流动俄罗斯境内的蜱会越境进入到中国，俄罗斯境内蜱传病原体的感染率和复合感染情况又[236]远远高于中国，因此针对保护区内蜱和蜱传病原体的鉴定、分布与季节消长的研究，可以有效的监测和预防蜱传疾病的发生。45 第四章结论与展望我国对蜱与蜱传疾病的研究与北美和欧洲相比，研究的内容广度和深度都不够，尤其是自然条件下蜱与蜱传疾病生态学特性的研究更是严重滞后。本研究选择在内蒙古额尔古纳国家级自然保护区，在野外自然环境中模拟蜱类自由生活环境，详细调查了全沟硬蜱Ixodespersulcatus的种群分布和季节动态。在实验室条件下观察全沟硬蜱生活史各阶段发育参数。研究结果显示，野外自然条件下全沟硬蜱一年时间内，不能完成一个完整的生活史周期，幼蜱、若蜱和成蜱在一年中的活动期存在重叠现象。成蜱主要在每年5～6月进入活跃期，找寻宿主吸血。雌蜱产卵、卵的孵化、蜱吸血均明显受到小气候的影响，当气温降低蜱会进入行为或形态滞育。实验室条件下，全沟硬蜱比在自然条件下发育的要快很多，不到一年就可以完成一个世代。对自然条件下全沟硬蜱各发育阶段存活时间研究表明，饥饿幼蜱在7月到8月间可存活20～30天，饥饿若蜱在8月到9月大约存活38～50天。成蜱、饱血的幼蜱和若蜱可以度过寒冷的冬季，在下一个年度相应的季节开始活动，进入下一阶段的生活史周期。由于生活史周期在一年中不同步，所以在自然条件下，可以观察到全沟硬蜱的幼蜱、若蜱和成蜱在一年中不同的月份中同时存在，但是蜱生活史中各发育阶段的活动表现出明显的季节性。进一步研究自然环境下全沟硬蜱的季节发生和消长、宿主选择、栖息地的分布，了解到全沟硬蜱的幼蜱和若蜱，主要侵袭保护区内的小型啮齿类动物，成蜱主要侵袭羊、牛、鹿等大型哺乳动物。栖息地分布调查显示，在自然环境中全沟硬蜱在不同生境分布具有显著性差异(p<0.001)，绝大多数的全沟硬蜱分布在灌丛和草地，而在针叶林和阔叶林中分布的极少。通过在羊体寄生情况和野外全沟硬蜱季节动态的观察，自然环境中全沟硬蜱一年不能完成一个生活史周期，进入冬季蜱活动减少甚至不再活动。由于雌蜱开始饱血时间的先后不同，造成雌蜱种群产卵和孵化不同步，各个发育阶段的成蜱、幼蜱和若蜱的活动时间存在重叠，野外生活的全沟硬蜱成蜱每年在4月上旬出现，5月下旬出现活动高峰，至8月上旬停止活动。幼蜱和若蜱活动期相似，在5月开始出现，较成蜱活动滞后1个多月，直到9月上旬消失，活动高峰在6、7、8月份出现多次。10月份后，在灌丛和草地生境中就没有发现自由活动的蜱。若蜱在8月饱血后，进入植被落叶层大约2～5cm进行蜕皮，未见到蜕皮成功者，进入冬季后饱血后的若蜱进入到滞育状态。幼蜱和若蜱主要侵袭啮齿类动物，但是成蜱需要在大型哺乳动物身上吸血才能46 进行交配和产卵，所以可以利用5月初给羊体疏剪羊毛时，对羊体进行消毒杀蜱将会大大降低成蜱数量，从而减少蜱类种群数量，但是需要注意的是全沟硬蜱叮咬能力比森林革蜱、嗜群血蜱都强大很多，所以成蜱不仅在羊体的面部等皮肤薄弱处叮咬，而且也常会叮咬在羊体的躯干部和颈部。对于蜱类的研究，我们不仅仅关注蜱本身种群生态学和生物学特性，而且更重要的是我们希望在此基础上，能够更多的了解蜱传病原体，分析宿主-蜱-病原体系统，从而对蜱传疾病有更深入的了解，更好的预防和控制蜱传疾病的流行。全沟硬蜱是我国北方[227][228][229]是最主要的蜱传疾病传播者，可以传播森林脑炎、莱姆病、人埃立克体病，[230][231]而且还携带有斑点热群立克次体、查菲埃立克体Ehrlichiachaffeensis、人粒细胞[231][232]无形体、巴贝斯原虫。内蒙古额尔古纳国家级自然保护区，处于中俄边境地区，检测保护区内全沟硬蜱携带的病原体，对于监测莱姆病、森林脑炎、斑点热等重要的蜱传疾病具有重要的意义。全球气候变化、小气候条件、栖息地生境变化、生物多样性的减少、人为因素都影响着蜱和蜱传疾病的发生和流行，宿主-蜱-病原体之间存在着一个复杂的交互系统，人们对篦子硬蜱Ixodesricinus和肩突硬蜱Ixodesscapular研究的比较多，但是对其它的蜱研究的内容就少很多，这很可能对宿主-蜱-病原体系统产生错误的认识，而且这对蜱传疾病的认识来说也是很局限的，因为不同种类的蜱会感染不同的病原体，不同地区的蜱也会感染不同的病原体，同一只蜱还会感染多种病原体。当蜱叮咬人的时候，可以引起人患病，甚至同时感染多种疾病，这在临床上会表现出不典型的疾病特征，让临床医生难以判断，造成误诊和漏诊。较高的蜱感染率和较高的叮咬人几率，与较少的临床确诊病例数量之间存在着误差，这提示临床医生对蜱传疾病的诊断还缺少经验，充分的理解这点，将有助于我们更好的诊断蜱传疾病。现在看来对于蜱和蜱传疾病的研究来说，不仅需要有蜱生态学知识、还要具备病原体分子检测的能力，而且需要有地理学、气象学、社会学、兽医学、临床医学以及公共卫生管理学科的知识和经验，而且对此的研究还需要有长期数据的支持。47 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致谢在此我衷心地感谢我的导师刘敬泽教授，导师对生命科学渊博的学识，笃学不倦的精神，严谨治学的态度，以及对蜱类生态学长期细致的研究，令我叹服且不断影响着我，鼓励着我逐渐深入蜱类生态学的研究。同时导师高尚的品德、和蔼的话语使我感触万千、影响至深。四年的时间在不知不觉中度过，从中我重新思考自己的人生，重新思索自己未来的发展。研究中经历的喜悦与烦恼，都成为了我一生中最美好的回忆。非常感谢杨小龙博士、王辉博士、于志军老师、胡永红博士、王多老师、鲍红老师、高志华及其他老师在实验、学习和生活中给予我的诸多支持和帮助!特别感谢孟浩以及刘钊同学，我们一起在内蒙古大草原度过了艰苦而有收获的时光，感谢大草原上和我们共同居住的老李一家人，美丽的额尔古纳河会成为我们共同美好的记忆。感谢内蒙古国家自然保护区的各位工作人员对我们提供的热情帮助。感谢实验室已毕业的和仍在刻苦奋战的兄弟姐妹们，他们在学习和生活中给予了我极大地鼓励和支持。感谢我的同事和朋友所给予的支持和鼓励，你们的关心和惦念，伴我走过四年的求学生涯。最后，我要深深地感谢我的父母、姐姐和家人，是他们的支持，使我的人生充满光彩。感谢他们给予我深厚和无私的爱，使我的学业得以完成，并催我继续奋进和拼搏!祝福所有的人，你们健康快乐，幸福永远！许士奇2015年4月62 攻读学位期间发表论文11XuejieChen,ShiqiXu（共同第一）ZhijunYu,LidaGuo,ShujieYang,LimengLiu,XiaolongYang,JingzeLiu.2014.MultiplelinesofevidenceonthegeneticrelatednessoftheparthenogeneticandbisexualHaemaphysalislongicornis(Acari:Ixodidae).Infection,GeneticsandEvolution.21:308–314.(SCI,IF3.264)11HaoMeng,ShiqiXu（共同第一）ZhijunYu,ZhaoLiu,JiannanLiu,XiaolongYang,JingzeLiu.2014.ThelifecycleandoccurrenceofHaemaphysalisconcinna(Acari:Ixodidae)underfieldconditions.TicksTickBorneDisease.5:887–891.(SCI,IF2.878)11YuhongHu,ShiqiXu（共同第一）YonghongHu,ChaoGuo,HaoMeng,JingLi,JingzeLiuandHuiWang.2014.DiverseFamiliesofAntimicrobialPeptidesIsolatedfromSkinSecretionsofThreeSpeciesofEastAsianFrogs,Babinadaunchina,Babinaadenopleura,andRanaomeimontis(Ranidae).ZoologicalScience.31:438–444.(SCI,IF0.876)11HaoMeng,ShiqiXu（共同第一）ZhijunYu,NingxinLi,RongrongWang,XiaoheGao,XiaolongYang,JingzeLiu.AbundanceandseasonalactivityofHaemaphysalisconcinna(Acari:Ixodidae)attheborderbetweenChinaandRussiainnorthernInnerMongolia,China.TicksTickBorneDisease.(SCI,IF2.878)InpressXiaolongYang,YuhongHu,ShiqiXu,YonghongHu,HaoMeng,ChaoGuo,YuliangLiu,JingzeLiu,ZhijunYu,HuiWang.2013.Identificationofmultipleantimicrobialpeptidesfromtheskinoffine-spinedfrog,Hylaranaspinulosa(Ranidae).Biochimie.95:2429–2436.(SCI,IF2.654)YuhongHu,ZhijunYu,ShiqiXu,YonghongHu,ChaoGuo,FengjiaoLi,JingLi,JingzeLiuandHuiWang.2014.PeptidomicAnalysisofAntimicrobialPeptidesinSkinSecretionsofAmolopsmantzorum.ZoologicalScience.31:143–151.(SCI,IF0.876)63