细胞培养相关细要

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1、细胞培养相关细要2005.9以本人所养3T3细胞为例1.所需玻璃器皿的准备用自来水充分洗刷瓶内壁残留的液体―>烘干―放进酸缸中浸泡过夜―>用自来水冲洗至少十遍将残余酸液完全冲尽―>用一蒸水冲洗三遍—>烘干—>121°C,20min湿热灭菌—》烘干冷却2.所需试剂及配制培养基（以Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium为例）a.每一袋为17.7克粉末，加入少于1L的三蒸水溶解粉末，并用水冲袋子三次;b.摇动溶解所有粉末（此时液体呈深黄色）；c.加入3.024克NaHCO3至以上溶液中，摇动溶解（溶液立即变为红色），添加青链霉

2、素，终浓度分别为青霉素100单位/ml,链霉素100

3、ig/ml；d.用量筒定容至1L,在紫外照射过的超净台前用0.2

4、im滤膜过滤，用50ml注射器打在已灭菌的玻璃细口瓶中；e.按体积比10%加入胎牛血清（根据买來的血清决定是否需要灭菌，本实验使用的是已灭活的血清）。D-Hanks液配方如下：试剂NaClKC1Na2HPO4•H2OKH2PO4NaHCO3质量g8.000.400.060.060.35a.溶于IL超纯水中，在胶塞上倒插一个注射器针头，121°C,灭菌20min；b.待灭菌完毕后，将针头拔出，用一块蘸了70%酒精的脱脂棉盖在缝上。

5、冷至室温以后放4°C保存。0.25%胰酶用已配好的D-Hanks液配制成250ml,0.25%的胰酶，0.2pm滤膜过滤。（试剂配好之后，最好用小瓶分装出几十毫升用，以免污染。）3・复苏细胞a.从液氮屮取出一瓶3T3细胞，迅速用银子置38.6°C摇晃至化；b・将管口用酒精棉擦拭后，倒入含5ml培养基的离心筒中，2000-2500rpm,离心lOmin,温度不要太低（为防止污染，管口用封口膜封住）；a.倒掉上清，加入5ml培养基并用枪吹打儿次；b.用枪转移至底而积约15cn?培养瓶中，在显微镜下观察，有较多小而圆的细胞悬浮，3TC,5%C02条件下

6、培养（可以将口拧开一些）；继续培养a.一般第二天要换液一次将大部分死亡细胞倒出，换液时先用2ml培养基冲一下，再补加5ml培养基；b.如果培养基由红变黄，表明代谢物过多，培养基变酸，需要及时更换；c.大约5〜6天细胞长满瓶底，可以传代，传代的前一天最好再换液一次。4.传代培养a.在细胞达到对数生长期（约贴壁80%）时，准备消化；b.倒掉原来的培养基，用枪吸3mlD-Hanks液冲洗瓶内壁两次，倒掉；c.加入500（11K酶消化，左右晃几次，侧拍几下。可以拿到显微镜下观察，见到细胞变圆即将脱离瓶底时，即可停止；d.加入5ml培养基中止消化，用弯头吸

7、管吹吸瓶底几次，注意吹打力度均匀并尽量不要出现泡沫；（玻璃弯管用之前要全身在火上烧一次，并待冷却后再吸细胞。）e.仍用弯管将小瓶屮的液体吸入大瓶中，再向大瓶另倒入15ml培养基，37°C,5%C02条件下培养；f.小瓶中也可添加5ml培养基继续培养。在显微镜下观察，细胞变圆，悬浮。备选方案：将加入胰酶后的培养液及细胞全部倒入离心筒中，离心后倒掉上清，然后用培养基悬浮已消化的细胞，再转移。细胞约三天长满，如果冻存，建议前一天换液一次。4.冻存细胞首先消化，加入胰酶2ml,步骤同上4a〜d。a.向瓶内倒入几毫升培养基屮止消化，封口，2000~2500

8、rpm,离心lOmin；b.倒掉上清，在桌面轻磕底部击散沉淀；c.用枪加入2.8ml培养基，O.8ml胎牛血清，打匀；d.另取一个枪头，将尖部剪一下，吸0.4mltf油加入其中，抽吸儿次混匀；（廿油较粘，注意轻吸慢打）培养基：血清：甘油=7：2：1e.取四个冻存管打开盖子放好，分别加入1ml液，每次加之前再吹吸几次，拧紧盖子并作标记；f.冻存顺序为：4°C,2h―>-20°C,过夜―>-80°C,2h―>液氮。6•注意事项：a.实验前均需将实验台和待用仪器紫外照射约30min〜lh,紫外照射的灭菌程度是与时间成正比的；b.培养瓶及离心筒打开以后和

9、盖上之前，瓶口和盖子均需在火上烧一下；c.打开盖的瓶口要冲着火焰的方向放，并尽量靠近火焰；d.操作过程屮，手臂尽量不要在打开口的瓶子上放经过。