细胞生物学实验（吉林大学）石蜡切片

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1、一.实验目的：1.熟悉动物石蜡切片的制作过程。2.掌握HE染色的基本原理和染色方法。3.掌握番红■固绿对染法的基本原理和具体方法。二.实验原理：1.动物实验原理：石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全血观察组织构造,而R适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。2.植物实验原理：

2、石蜡切片法也是在研究动植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，乂可以切成连续薄片，切片经染色，观察效杲甚好。番红-固绿对染法，为植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为碱性染料,能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色;固绿为酸性染料,能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。（由于植物石蜡切片制作过程耗时较长，工作量较大，因此本次实验只做了动物石蜡切片的制作）三.实验仪器及药品：1.实验器材：切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀

3、，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养1111,吸管，蹑子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，水浴锅。2.实验药品：卡诺氏固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，郝普特氏粘片剂，3.实验材料：鼠肝、肾、心肌、脾四.操作流程：取材一固定一洗涤一脱水一透明一浸蜡一包埋一切片一粘片一脱蜡一染色一脱水一透明一封片五.实验步骤：1.取林颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取壮组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂

4、穿透，通常以5mmX5mmX2mm或10mmX10mmX2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2〜3mm厚。2.固定:将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50mim3.洗涤：材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%〜70%乙醇冲洗。4.脫水：80%>90%各级乙醇溶液脱水各40min,放入95%、10

5、0%各两次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织屮含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。5.透明：纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇乂能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态6.透蜡：放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡I、石蜡II透蜡各20〜3()分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗透到组

6、织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡吋I'可根据组织的薄厚、大小来进行。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60°C左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5ho1.包埋：将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水屮，使其立刻降温凝固成蜡块。用于包埋的石蜡的熔点在50~60°C之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56°C,植物材料用的石蜡熔点为54~58°C。2.修蜡和切片：①切片Z前要把包埋好的蜡快修成梯形

7、，然后将已修好的石蜡固定在台木上装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4〜1()微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40〜50r/min。⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的

8、一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。3.贴片：①取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央,然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。②滴1〜2滴的