[医学]chapter5聚合酶链式反应体外扩增dna

《[医学]chapter5聚合酶链式反应体外扩增dna》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Chapter5聚合酶链式反应体外扩增DNA美国Mullis教授开汽车时的联想Chapter5聚合酶链式反应体外扩增DNA聚合酶链式反应示意图PCR仪PCR反应体系示意图Chapter5聚合酶链式反应体外扩增DNAChapter5聚合酶链式反应体外扩增DNA聚合酶链式反应制备克隆用PCR产物的纯化克隆化的PCR产物连入T载体通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入酶切位点应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR）克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定长距离PCR反向PCR实时荧光定量PCR1.聚合酶链式反应PCR反应的基本成分：一种热稳定DNA聚合酶一对

2、引导DNA合成的寡核苷酸引物脱氧核苷三磷酸二价阳离子，通常是Mg2+维持pH值的缓冲液一价阳离子（缓冲液中含50mmol/LKCl）模板DNA（1）DNA聚合酶1.大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段，不耐热，每次循环需重加酶。2.Taq酶（1988年）：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性DNA聚合酶，其活性需要Mg2+。但Taq-DNA聚合酶有一定错配率（无3’→5’外切酶活性，有5’→3’外切酶活性），为0.1%-0.25%（30次cycle）；若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用。3.Tth、Pfu、Vent聚合酶：具有校

3、读功能。（2）寡核苷酸引物1.长度：16-30bp，一对引物。过短—非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增，从而降低扩增的灵敏性；过长—易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延伸温度超过Taq酶的最适温度，同时还使检测成本增加。2.G+C含量：占40-60%，Tm值在55℃以上。3.碱基的随机分布：不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。（2）寡核苷酸引物4.引物自身不存在互补碱基（连续互补至少小于3bp)，防止二聚体的形成。5.一对引物间不应互补（连续互补至少小于4bp），尤其是它们的3’端不应互补。6.引物的纯度要高。7.引物与非特异靶区之间的同源性不

4、要超过70%或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。（2）寡核苷酸引物8.引物的3’端一定要与模板配对（引物的特异性，引发延伸的点），以引物3’端A影响最大；末端最佳选择为G和C；引物3’端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第三位的简并性而影响扩增特异性。9.引物的5’端可以修饰：包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入酶切位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。10.引物的设计最好以电脑软件进行指导。（3）脱氧核苷三磷酸四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸：即dATP、dTTP、dCTP、dGTP一般浓度在200-

5、250μmol/L。高浓度dNTP对扩增反应起抑制作用，可能因为dNTP与Mg2+螯合引起的效应。若扩增片段在约1kb，每种dNTP浓度控制在20μmol/L至0.5-1.0pmol/L，效果较好。（4）二价阳离子热稳定的DNA聚合酶要求有二价阳离子激活，通常是Mg2+。由于dNTP与寡核苷酸结合Mg2+，阳离子的摩尔浓度必须超过dNTP与引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。一般在0.5-5.0mmol/L。（5）维持pH值的缓冲液一般用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的pH调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液中Tris-Cl浓度在10mmol/L。在

6、72℃温育时（即PCR延伸阶段的温度），反应体系的pH值会下降一个单位，导致缓冲液的pH接近7.2。（6）一价阳离子标准PCR缓冲液中含50mmol/LKCl，它对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的。提高KCl浓度到70-100mmol/L范围内，对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。（7）模板DNA可以单链或双链形式加入到PCR反应液中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA分子。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但是使用高分子量的DNA（10kb以上）作模板时，如果用限制性内切酶先消化，则扩增效果更好。聚合酶链式反应的设计包

7、括三个步骤，即变性、退火、延伸。1.变性：一般在94-95℃30s，根据G+C含量。2.退火（复性）：温度太高，难以复性，扩增效率降低；温度过低，非特异性复性，扩增出非特异性片段。通常比理论计算的引物和模板的熔接温度降低3-5℃，一般30s。计算公式：Tm=2（A+T）+4（G+C）Tm=81.5+16.6(lg[K+])+0.41(%[G+C])-(675/n)3.延伸：与DNA聚合酶的活性有关。一般TaqDNA聚合酶的最适温度为72-78℃，延伸时间由扩增产物的长度决定，一般1kb用1分钟来保证充足的时间。4.循环数：由反应体系中起始的模板拷贝数以及

8、引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至