菌株选育调节

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1、第三章菌株选育调节优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。理想的工业发酵菌种应符合以下要求：(1)遗传性状稳定；(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；(4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；(7)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；(8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。菌种选育包括根据菌种自然变异而进行的自然选育，以

2、及根据遗传学基础理论和方法，人为引起的菌种遗传变异或基因重组,如诱变育种、杂交育种、原生质体融合和基因工程等技术。后一类方法在微生物的菌种选育工作中占踞主导地位，其中通过分子生物学手段，定向构建基因工程菌是微生物育种的重要发展趋势。当然，菌种选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种。3.1  从自然界中获得新菌种    自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所。微生物种类大大超过所有动植物之和。随着微生物学研究工作的不断深入，微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，

3、因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。3.1.1  采样    采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境和目标物。1.采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。土壤：细菌和放线菌为主；果园树根土层：酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层：较多的霉菌；豆科植物根系土：根瘤菌；河流湖泊的淤泥：产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层：分解石油微生物。各种水体：具有光合作用能力的微生物及兼性或专性厌氧微生物；污染源附近的土壤、水体、污泥、污水往往是对各类污染物具降解或转化能力的细菌、放线菌或真菌等微

4、生物理想的采样地点。2.采土样方法：用小铲子去除表土，取离地面5～15cm处的土样几克，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标明时间、地点和环境等情况，以备查考3.1.2增殖在采集的样品中，一般待分离的菌种在数量上并不占优势，为提高分离的效率，在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质，使所需菌种的数量相对增加，这种方法称为增殖培养或富集培养。其实质是使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，便于将它们从样品中分离。培养方法可采用分批式富集培养（摇瓶培养）和恒化富集培养（连续培养）。分批式富集培养分批式富集培养是将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复转种几

5、次后，再取此富集培养物接种到固体培养基上，以获得单菌落。恒化富集培养是通过改变限制性基质的浓度，来控制不同菌株的比生长速率。3.1.3菌株的分离1.施加选择性压力分离法：分离的效率取决于培养基养分，pH，加入选择性抑制剂。大多数放线菌培养基pH在6.7~7.5，嗜酸菌pH在4.5~5.0。在分离放线菌和细菌时，可加抗真菌抗生素；分离真菌时，加抗细菌抗生素。从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50％乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中，加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革

6、兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无作用。分离厌氧菌时可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电位下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品中的比例提高，从中便于分离到所需的菌株。分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10％的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30~50U/ml，以及丙酸钠10mg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉

7、菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。马丁氏(martin)培养基就是专门用于分离土壤中真菌的选择性培养基。其配方是：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，琼脂2%，孟加拉红(或称虎红)1/3万，链霉素30mg/ml，金霉素2mg/ml。此处的孟加拉红、链霉素和金霉素等的作用是抑制细菌生长，从而富集土壤中的真菌。2.随机分离筛选法一些微