猪流行性腹泻病毒地方株LJB03株分离鉴定

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1、摘要采用传代细胞(非洲绿候肾细胞)从猪腹泻粪便中分离出1株猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，命名为PEDVLJB／03株。该病毒接种Vcro细胞时，在其维持液中加入3p∥ml胰酶，通过稳定的细胞病变、病毒的TCID50测定、RT-PCR扩增试验、间接免疫荧光试验、间接ELISA试验等方法对该分离毒进行了鉴定。实验结果表明：病毒盲传20代，未出现明显的病变，第2l代48h出现可见CPE，72h收获病毒液。随着传代代数的增加，出现CPE的时间缩短，细胞病变程度亦随之加剧。该毒株传到40代时。接种病毒的细胞产生规律性病变，病毒培养24h，细胞肿胀

2、变圆，折光性增强，颗粒物质增多；培养36h，细胞大量脱落崩解，细胞间隙变大：培养48h，细胞脱落达到80％，细胞拉成网状，而对照细胞直到培养48h还保持致密的单层，呈长梭形，轮廓清晰，细胞脱落极少。为进一步证明这种病变是由PEDV所引起以及病毒在细胞中得以繁殖，本实验以每隔10个代次采用RT-PCR技术扩增PEDVM基因，对第l、10、20、30和40不同代次的细胞培养物进行的RT-PCR检测，结果均为阳性。间接免疫荧光实验结果表明，经PEDV感染40h后的Vero细胞，在细胞中检测到病毒抗原的存在，可见绿色荧光，而未被PEDV感染的Vero细胞中，看不见任何绿色荧光。间接ELISA检测，P／

3、N平均比值为7．6，判断此细胞培养毒为阳性。对第40代病毒测定TCID∞结果为lO{一／0．1mL。由以上的试验可以证明从粪便里分离出的这株病毒为猪流行性腹泻病毒，且此病毒能在含有胰酶维持液的Vero细胞培养物上生长繁殖。关键词：猪流行性腹泻病毒；分离；鉴定研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l逵!麴遗直墓丝重要挂型主明的：奎拦互窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡

4、献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：专长缸l'b-日期：Ⅷ眸。占月／多日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：弓次备L{1，导师签名：j参一f罨=，日期：阳91年衫月，多日引言limnq●1引言猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiahorreaVirus，PEDV)

5、是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原(殷震，1997；B．E．斯特劳，2000)，不同年龄和不同品种的猪均易感，但对哺乳仔猪的危害最为严重(TimoneyJ．F．etal，1988)，死亡率最高可达10096。自从1971年英国首次报道猪流行性腹泻(PED)以来(PensaertMB，1978)，相继在比利时、德国、加拿大、日本、瑞士等多个国家报道了本病的发生(DeBouckP，1980；DucatelleR，1981；TakahashiK，1983)，我国从1976年开始就陆续有PED的报道(蔡宝祥，1982；倪艳秀，2001)。本病己成为重要的猪病毒性腹泻病之一，1

6、991年国际病毒分类委员会(ICTV)第五次报告将PED列为冠状病毒属的可能成员，1995年第六次报告将其列为冠状病毒属的正式成员(MurhyFA。1995)。由于PEDV适应细胞培养难度高，自70年代初发现以来，曾用各种方法试图把病毒适应于细胞培养，进行体外扩增，先后以多种细胞进行培养实验，但是一直没有获得成功，成为病毒学上的一道难题。直到1988年瑞典Hoffinan等首次在VeTo传代细胞的培养液中加入胰酶，病毒培养获得成功，连续传5代出现细胞病变(Hofinann,Met也1998)，其次日本和韩国也相继报道PEDV在VeTo细胞上的培养特性(DS，Song,2003；WZhangct

7、al，1996)。针对PEDV适应细胞培养难度高的特点，本研究通过在VeTo传代细胞培养液中加入胰酶的方法，从猪腹泻粪便中分离出1株猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，并命名为LJB／03。通过稳定的细胞病变、病毒的TCID50测定、RT-PCR扩增试验、间接免疫荧光试验、间接竞争ELISA试验等方法对该分离毒进行鉴定。试验表明：此分离株为猪流行