一株猪流行性腹泻病毒（PEDV)的鉴定及分离培养.doc

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1、一株猪流行性腹泻病毒（PEDV）的鉴定及分离培养摘要猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一类急性、高度接触性传染病，主要临床症状为呕吐、腹泻、脱水性下痢。因PED对新生仔猪的高致死率，所以每次爆发都会对养猪业造成严重经济损失。我国是主要发病国之一，自2010年起该病的发病率明显升高，且规模更大。由于近年来猪流行性腹泻的频繁爆发，使其成为世界范围的猪传染病。2013年美国首次报道猪流行性腹泻案例，并且短时间内迅速扩散蔓延。同年,QiChen等成功分离岀美国传播的一株PEDV流行毒株

2、。本实验室近些年来致力于PEDV减毒活疫苗的研究工作，已经取得了一定进展，相继得到了不同类型的重组PEDV,但尚未进行过PEDV流行毒株的分离培养。本实验尝试以Vero细胞分离出PEDV-GJL野毒株，为今后通过RNA定向重组构建PEDV重组病毒提供各大的研发空间。PEDV的主要致病蛋白是纤突蛋白（S蛋白），且编码纤突蛋白的S基因突变率较高，所以根据S基因的遗传变异关系可以一定程度上反应PEDV流行毒株的爆发时间与地区性。本研究首先进行临床样本中PEDV野毒株S基因全序列的扩增测序，然后借鉴QiChen

3、等的培养方案，在病毒维持液中添加TPB、酵母粉、5pg/ML胰酶，延长培养周期等，以期在Vero细胞上分离出PEDV-GJL野毒株。分离得到的毒株在Ve「o细胞上的CPE并非常见流行毒株的合胞体状态，而是类似DR13的病变形态。进一步做对比实验发现病毒的增殖不依赖外界胰酶的存在，初步怀疑是否是DR13毒株。经RT-PCR检测ORF3序列，发现分离到的是PEDV-GJL和DR13减毒疫苗株的混合毒株，并且病毒增殖传至第四代时野毒株PEDV-GJL丢失。取第二代病毒进行两次空斑纯化实验，分别挑取大、小不同蚀

4、斑后得到的病毒经鉴定都是弱毒DR13疫苗株。由分离纯化结果分析，猪场免疫过弱毒DR13疫苗，采集临床粪便样品时携带有疫苗毒株。样品RT-PCR检测时未发现疫苗株的存在，但随后分离过程中在Vero细胞上大量增殖。病毒接种后维持液中添加TPB和酵母粉是为了维持营养，但根据本实验结果可能这套体系对疫苗株的分离更加有利，这个假设还需要后续进一步验证。PEDV同源病毒的构建是基于本实验室已建立的反向遗传学操作系统，以携带荧光标记的重组质粒载体PEDVwt-DR13-dORF3/RLUC为模板转录出病毒基因组RNA

5、,通过电击转染方法将RNA导入感染重组病毒mPEDV的LR7细胞中，经病毒的重新装配得到能在Vero细胞内增殖的重组PEDV病毒。关键词:猪流行性腹泻病毒(PEDV);RT-PCR;S基因；分离培养；同源重组IdentificationandseparationofaPorineEpidemicDiarrheaVirusstrainABSTRACTKEYWORDS:PEDV;RT-PCR;Real-timePCR;NeautralizationPorcineepidemicdiarrhea(PED)is

6、akindofhighlycontacttransmitteddiseasethatischaracterizedbyacuteenteritis,whichcausingvomit,diarrheaanddehydration.ThecausativeagentofPEDisPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).Everytimeoftheoutbreakwillcauseseriouseconomiclossbecauseofthehighlethalitytonew

7、bornpiglets.Chinaisoneofthemajiordiseaseareas,andsince2010theincidenceofPEDincreasedsignificantlywithlargerscale.Inrecentyears,thefrequentoutbreakofPED,makingitapiginfectiousdiseseworldwide.PEDwasfirstreportedinUSAatMay2013andspreadingrapidlywithashortti

8、me.Inthesameyear,QichenetsuccessfullyisolatedtwostrainsofPEDVthatpropagatinginUS.OurlaboratorycommittedtotheresearchofattenuatedlivevaccineofPEDVinrecentyears,andhasmadesomeachievements.Wehasobtainedsomedifferenttypesofrec