重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞生长、侵袭和转移的影响

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1、南方医科大学硕士学位论文重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞生长、侵袭和转移的影响姓名：张鹏海申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：罗荣城20080415硕士学镶论文重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞生长、侵袭和转移的影响硕士研究生：张鹏海指导教师：罗荣城教授摘要研究背景及目的肝癌(Hepatacellularcarcinoma，HCC)，是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡排序中居第三位，在部分地区的农村则占第二位。我园每年死于肝癌约ll万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。近年来，由于肝癌早麓诊断和治疗手段的进步，使得肝癌的5年生存率有所提高。但目前各种肝癌

2、治疗手段的效果仍不够满意。其中门静脉癌栓的形成、肝肉及远处的侵袭转移是肝癌治疗效果差、病情进展快的重要原因。因此，进一步对肝癌进行研究，并寻求肝癌新的治疗方法和药物显得非常有必要。血管内皮抑素(Endostatin)是细胞外基质胶原XⅦ羧基末端片断，最初是从鼠成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种内源性糖礞白，能够特异性地作用于新生蛊管的内皮细胞，直接抑制内皮细胞的增殖、转移并诱导其凋亡而发挥抗血管生成作用。Endostatin通过抑制煎管杰皮细跑达到抗肿瘤作用的机制已被广泛证实。近来Endostatin直接抑制某些肿瘤纲胞生长和侵袭转移的研究也有了初步的报道，但国

3、内外尚未见Endostatin对肝癌细胞有直接作用的研究报道。美国Entremed公司采用酵母作为表达体系生产的Endostatin先后进行了I期和Il期的临床实验，但由于其体外不稳定性和生产成本高等原因，在临床上未得到继续应用。我国江苏先声药业生产自行研制的新型Endostatin制荆一重组入血管内皮抑素(rh-Endostatin，endostal喇，恩度喇)，解决了国外Endos{撕n制蠢

4、j的多个难题。在多项动物实验中均显示其能有效抑制内皮细胞增殖、盘管生成中文摘要和肿瘤生长，在临床应用于肺癌的治疗中也取得令人鼓舞的疗效。本课题拟将rh—Endostatin为

5、主要实验试剂，研究其体外对人肝癌细胞株HepG2Ft毛l高侵袭潜能人肝癌细胞株HCCLM6的增殖、细胞周期、细胞凋亡以及细胞侵袭转移能力的影响，并试图探讨其作用机制。以完善rh．Endostatin抗肿瘤机制，了解rh．Endostatin在肝癌治疗中的应用可能，为其临床应用提供进一步的理论依据。第一章重组人血管内皮抑素体外对肝癌细胞增殖、周期与凋亡的影响一、材料与方法1．将贴壁培养的HCCLM6及HepG2细胞消化收集计数后，分别加入整合素a5131抗体和FITC一羊抗小鼠lgG二抗，同时设阴性对照组；采用免疫荧光法，用流式细胞仪定量检测两细胞株表面整合素a5131

6、的表达率。2．分别将HCCLM6及HepG2细胞接种于共聚焦测试平皿中，待细胞完全贴壁后，4％多聚甲醛固定，加入整合素a5131抗体和FITC一羊抗小鼠IgGZ．抗，并加入Hochest33258染液进行细胞核负染；于激光共聚焦荧光显微镜下拍照观察，检测rh．Endostatin作用受体整合素a5131在两种细胞的定性定位表达。3．分别将rh—Endostatin或BSA包被96孔酶标板中，实验设单纯包被BSA组、单纯包被rh．Endostatin组和包被rh．Endostatin+Anti．a5131干扰组，分别将无血清DMEM悬浮的HCCLM6及HepG2细胞接种

7、到每孔，继续培养4h，去除未粘着的细胞后，MTT法、酶标仪检测粘着细胞的OD值，进行分析比较，检测两种细胞是否通过整合素a5131介导与rh．Endostatin间结合及其程度。4．分别以终浓度为0、50、100、200和400I_tg／mlrh．Endostatin处理HCCLM6及HepG2细胞，MTT法检测处理24、48及72h后吸光值OD值，检测并分析rh．Endostatin对两细胞增殖的影响及差别。5．实验分组同前。流式细胞仪分别检测rh．Endostatin处理HCCLM6及HepG2细胞24h后对周期的分布，并分析其差别。6．细胞分组同前。培养72h后

8、收集细胞，采用凋亡荧光双染试剂AnnexinV．FITC及PI染液、流式细胞仪分别检测rh．Endostatin处理HCCLM6及HepG2硕士学位论文细胞72h后对细胞凋亡的影响，并分析其差别。二、统计方法实验数据均采用SPSS11．5软件进行统计处理，定量资料数据以i圭s表示，多组比较采用One．WayANOVA分析(方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Tamhane法)；经过不同药物浓度、处理不同时闻的细胞增殪资料采用析因分析；尹≤◇．05为统计学意义。三、结果1．流式细胞仪检测整合素a5Dl在HCCLM6细胞上表达率为85．3％，在HepG2