单链莫奈林基因表达载体的构建及其在毕赤氏酵母中的表达

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1、江西农业大学硕士学位论文单链莫奈林基因表达载体的构建及其在毕赤氏酵母中的表达姓名：艾华水申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：黄路生;袁汉英2002.10.1江西农业大学硕士学位论文摘要天然的莫奈林是从西非植物Dioscoreophyllumcummin．s'ii的浆果中分离出的，甜度非常高的一种蛋白质，它由两条彼此分离的多肽链(A链和B链)通过氢键和疏水作用力结合在一起，A链含有45个氨基酸残基，B链含有50个氨基酸残基。在等摩尔质量下，双链莫奈林的甜度约为蔗糖的100，000倍，约为二肽甜昧剂aspa

2、rtame的300倍。由于双链莫奈林在高温下不稳定，且pH的耐受性不强，易失去甜味，单链莫奈林(Single．Chainmonellin，SCM)通过基因工程改造应运而生，它是在不改变其拓扑结构和甜味活性的前提下，两条多肽链被融合在一起。单链莫奈林具有更高的耐热和耐酸性，更加稳定。根据甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，选择毕赤氏酵母偏爱的密码子，用化学合成法合成单链莫奈林基因片段，并拼接成完整基因。克隆后序列分析表明，合成的单链莫奈林基因与设计的保持一致。将单链莫奈林基因装载到大肠杆菌质粒pUCl18、pBSKS+年I]毕赤氏

3、酵母整合型质粒pPIC9K，构建了毕赤氏酵母单链莫奈林基因表达载体pPIC9K／SCM。利用BglII酶酶切构建好的表达载体pPIC9K／SCM，形成线性化的表达单元，经电转化、RDB缺陷培养和G418抗性平板筛选后，获得了其表达单元整合在酵母基因组中的转化重组子(即重组菌株)，其中有3个抗G418的水平达到4mg／ml；转化重组子得到PCR的验证。通过表达测试，得到一个表达水平较高的重组子。经诱导表达，SDS—PAGE显示在约11～12KD处有一条明显的蛋白条带。表达产物纯化后，SDS．PAGE检测发现有两条带，且分

4、子量较大的约为较小的两倍：这个结果提示，表达产物在某些溶剂中可能以两种形式——单体和二聚体存在。通过摇瓶诱导发酵，表达产物的含量占发酵上清液总蛋白的46．9％，其浓度为2．12mg／ml，产量为11．07mg／g湿菌。经等电薄层凝胶电泳检测，表达产物的pI约为9．4。关键词：单链莫奈林，毕赤氏酵母，分泌表达单链莫奈林基因表达载体的构建及其在毕赤氏酵母中的分泌表达AbstractThesweetprotein，monellin，wasoriginallyisolatedfromtheberriesofthewestAfr

5、icanplantDioscoreophyllumcurnminsiiNativemonellinconsistsoftwoseparatepolypeptidechains，a45一residueA—chainanda50-residueB‘chainThetwochainsarepackedcloselybybothintermolecularhydrogenbondsandhydrophobicinteractions．Two—chainmonelliniS～100．000timessweeterthansucr

6、oseand-300timessweeterthanthedipeptidesweeteraspartameonamolarbasis．Two·chainmonellinisunstableathightemperatures，andlosessweetness．Anengineeredsingle-chainmonellin(SCM)，constructedbyfusingthetwochainswithoutdisruptingitstopologyandsweetactivity，hasbeenprovenmor

7、estableandsweetthanthetwo—chainmonellinunderbothhightemperatureandacidicconditions．Accordingtotheaminoacidsequenceofthesweetproteinmonellin，asingle-chainmonellin(SCM)geneissynthesizedusingPichiaPastorisbiasedcodonsbythechemicalsynthesismethodofoligonucleotidefra

8、gment．ItshowsthatthesynthesizedSCMgeneisaccordantwiththeexpecteddesignthroughtheresultofsequenceanalysis．TheSCMgoneisligatedintotheEcoilvectorsofpUCl18，pBSKS+andthePi