IL-10诱导猪同种异体组织工程化软骨移植耐受的实验研究

《IL-10诱导猪同种异体组织工程化软骨移植耐受的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海第二医科大学2000级顾IjI叶究生毕业论文IL．10诱导猪同釉舅体组织工程化软骨移檬裂受的实验磷究中文摘要曩的：本职究卷探讨缝织王程化软嚣在同静异体猪体内麴尘长状提释免疫排斥梳理瓣基础上，究隆猪m．10基戳，构建其真核表达载体，躐察箕转柒琢代软骨细胞效率及目的纂困的表达，测定莺组IL一10蛋白的生物活性和诱导免疫耐受的作用，为基因转染的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨组织及其临床应用提供理论依据。方法：I)分离制各小型猪软骨缎脆，经体外培葵扩壤屠与垒锈树料Pluronic混合，构建缀绞工耧他软骨组绒，接种j二两种拜体猪皮下，分荆在移植接种后的

2、第1周、2周、3周和5周各时间段取出组织工程化的软骨，组织固定，石蜡包埋，通过组织病理和免疫组化的方法，观察、检测同种异体软骨组织的生长和兔疫搀斥情况。2)使用pGEM-T快速克隆载体，遁过RT—PCR驰方法竞隆小型猪IL—lO基因，然选、鉴定蜃经测彦涯实。经双酶甥嚣受克臻摹《冀核表达矮鞍pcDNA3。I，构建真核表达载体。3)使稍EGFP作为报告基函，通道FuGENE6转染试剂转染猪原代软骨细胞，利用荧光湿微镜和FACS观察转染效率和绿色荧光蛋白的表达。进褫将IL一10基因转染猪原代软骨细胞，遴过RT—PeR翱ELISA的方法，定性謦Ⅱ定量检测重组

3、猿IL-IO基段在软骨细胞中的表达。掇撂IL-IO戆挪铡经丝裂原刺激瀵栊熬PBMC分泌IFN-Y翡熬力，测定转基因较学缨魏分泌嚣羹维{卜iO的生物学活住，FACS检溯转IL-IO萋戳歉筲细胞在IFN—Y诱导下表达瞄cH类分予的情况，混合淋巴细胞一软骨细胞反应(札ChR)梭溯转IL-IO基因软骨细臌对闹种异体淋巴细胞的刺激强度。t结果：I)分离零譬到的供体软嚣缨腿，体夕}壤棼7天鬃，生长款蹙，乓Pluronic渥会居注射至受体猪残下，I爝居帮霹鼹察瑟缩节状较骨缝鳜形成。镜下躐察较骨结节照典蓬的软臀组织形态，软臂结节周围有萌露韵爨僚细胞漫润。免痰组化表明

4、组织工程化软骨可合成并分泌软骨组织特异性的1I型胶原，但同时第l周时MHCII类分予即有表达，至第3周时MHCII类分子表达坚强阳性。移植后5周移l上海第二医科大学2000级硕士研究生毕业论文植物消失。2)经双酶切和测序鉴定，成功地克隆了小型猪IL-10基因，并构建了pcDNA3．I真核表达载体。3)使用FuGENE6转染试剂，将含EGFP的真核表达载体pcDNA3．1转染猪原代软骨细胞，荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达，可持续8天以上，FACS测定转染效率为5．13％。进而将IL-10基因转染软骨细胞，RT．PCR检测到IL—10mRNA的转录，

5、ELISA法测定转染软骨细胞培养上清中的IL-10蛋白含量，72小时时表达量最高，为2953．4pg／ml。透明质酸酶可提高转染效率。FACS检测表明转IL-10基因的软骨细胞可拮抗IFN—Y诱导的MHCII类分子表达，其细胞培养上清具有抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN—Y的生物学功能。混合淋巴细胞一软骨细胞反应发现，IL一10基因转染可明显抑制IFN—Y诱导的软骨细胞刺激同种异体PBMc的增殖。结论：猪同种异体软骨细胞经组织工程化可在组织不相容的受体体内形成软骨组织，但新生软骨组织诱导机体发生免疫排斥反应，移植物在同种异体体内仅能存活五周。成功克

6、隆猪IL-10基因质，将IL-10基因转染软骨细胞表达，转基因软骨细胞免疫原性降低，分泌的重组IL一10蛋白具有抑制活化T细胞分泌IFN—Y的生物学功能，提示IL-10具有有利于延长移植物存活期、抑制免疫排斥的作用。本实验为进一步使用转基因软骨细胞构建组织工程化软骨，并移植到同种异体体内提供实验和理论依据。关键词：小型猪；软骨细胞；同种异体移植；组织工程；基因转染：IL一10；免疫耐受2上海第二医辩大学2000缀硕士研究生毕韭论文ExperimentalStudyonIL-·10-—inducedImmuneToleranceinTissue-Eng

7、ineeredAllogeneicSwineCartilageTransplantationABST歉ACTobjective：Onthebasisoftheresearchonthegrowthoftissue-engineeredallogeneicswinecartilageandthemechanismsofrejection，tiffsstudywasundertakentoclonetheswineIL一10gene，constructedtheIL-IOeukaryoticexpressionvector,andtransfectedt

8、heprimaryswinechondrocytes。Transfectionefficiencywasme