家蚕转基因载体pBacA3EG、pBacA4R在昆虫培养细胞中的表达研究

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1、中文摘要摘要转基冈动物研究是目前生物科学的研究热点之一。家蚕是重要的经济昆虫，更是经典遗传学研究的模式生物之一。进行转基因蚕研究具有重要的理论意义和实用价值。转基因家蚕是指用实验导入的方法使外源基因在染色体基因组内稳定整合，并能遗传给下一代。转基因家蚕的研究建立在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA重组技术的基础之上。最近完成的家蚕全基因组测序工作(Xia等，2004)，将促进家蚕的基础研究，并使家蚕作为模式昆虫对昆虫学科的发展起到积极的推动作用。在家蚕的全基因组框架图完成之后．目前的主要1：作是对家蚕

2、基因组计划所获得的大量基因进行研究，以探索其具体的生物学功能。由于转基因技术可以实现家蚕功能基因的过量表达或者基因功能的缺失，因此将成为研究家蚕基因功能的重要方法之一。同时，转基因技术也是利用功能基因开发新的蚕品种的关键，甚至还是实现利用家蚕台成有用蛋白质、开发家蚕生物反应器的技术关键。本论文主要由转基因载体构建、载体表达、细胞培养和筛选三个部分组成。其主要研究工作包括以下几个方面：1．根据已报道的家蚕肌动蛋白A3基因的启动子序列设计了引物，克隆A3启动子。通过对蚕肌动蛋白A4基因的分析，设计了3对引物：A4

3、-l，A4-2，A4-3，最终将A4．2克隆到转基因载体中，能够成功启动基因的表达。2．以家蚕Bombyxmori肌动蛋白(actin3，A3)启动子、增强性绿色荧光蛋白基因EGFP及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件，经多次克隆，将其插入到piggyBac转座载体中。经PCR、酶切鉴定及测序表明各元件已按正确的方式插入到piggyBac载体中。将构建好的piggyBac表达载体通过细胞转染进入家蚕BME细胞中，48小时后观察到发红色荧光的培养细胞，通过分子水平检测，能在转染细胞cDNA中阔增到EGFP片段，

4、结果表明该载体构建正确且能在细胞中进行表达。3．以家蚕BombyxmoriA4启动子、红色荧光蛋白基因ⅫP及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件，经多次克隆，将其插入到piggyBac转座载体中。经PCR、酶切鉴定及测序表明各元件已按正确的方式插入到piggyBac载体中。将构建好的piggyBac表达载体通过细胞转染进入SF21细胞中，48小时后观察到发红色荧光的培养细胞，在48～72小时发红色荧光细胞数达到最大。通过分子水平检测，能在转染细胞cDNA中阔增到dsRed片段，结果表明该载体构建正确且能在细胞中

5、进行表达。4．细胞转染条件优化：脂质体的量在1～4ul时，转染效率逐渐增高．在4ul时最大，进’步加大N8u1．细胞死亡严重，效果较差；DNA的量在08-12ug时转染效果较好，0,4ug时转染效率较低，DNA量增加到l6-2．0ug．对转染效率影响不大。综合脂质体和D咐A的用量．当脂质1西南大学硕士学位论文体为4u1．DNA在O．8-I．2ug时，转染效率达到最高．此条件为最优。5．家蚕pBacA4Rfp转基因载体稳定表达：家蚕pBacA4Rfp转基因载体稳定表达较瞬时表达不同，是在转染细胞时加入了转座酶A

6、3H．期望piggyBac能定向的把目的基因转座到细胞基因组中，通过复制分裂，使基因在下一代中也能表达。实验证明，pBacA4Rfp转基因载体在转座酶A3H的作用下，将外源DNA]E确的插入到细胞基因组中，表达蛋白并且能够稳定的传给下一代。经过长时问的观察记录(转染后6个月)，确定细胞一直能够稳定地表达红色荧光蛋白，说明细胞能持续发光并能传代。至本论文完稿，转基因细胞一直在做继代培养，且能检测到红色荧光。简而言之，本实验通过载体构建，并利用脂质体介导法转染家蚕胚胎细胞(BME)和草地贪夜峨卵巢细胞(Sf21)

7、，成功的建立了一套快速检测外源基因表达和家蚕转基因载体的筛选体系．为分析家蚕转基因载体的表达特征、家蚕转基因细胞系的建立以及转基因蚕的养成奠定了基础。关键词：家蚕转基因载体绿色荧光红色荧光细胞转染表达IITheexpressionofSiIkwormtransgeniOvectorpBacA3EG、pBaoA4RininsectoeAbstractInrecentyears，thetransgenicresearchonanimalshasbeenbecomingoneofthebesthot—pointsi

8、nGeneticsandBiologySilkworm(Bombyxmori)，isnotonlyanimportanteconomicinsect，butalsoanimportantorganismsforresearchclassicalgeneticsStudiesontransgenicsilkwormpossesstheoreticalsignificanceandpracticalva