家蚕二分浓核病毒在昆虫细胞中的拯救.pdf

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1、家蚕二分浓核病毒在昆虫细胞中的拯救RescuingBombyxmoribidensovirusininsectcells专姓2014年4月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：弘眵若为I

2、侔钥丁日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密

3、i。学位论文作者签名：苏莎毒矽；辞年占月f日将教师躲别L韧驯≯年参月夕日江苏大学硕士学位论文摘要家蚕二分浓核病毒(Bombyxmoribidensovirus，BmBDV)是首例拥有自身编码DNA聚合酶的ssDNA的无脊椎动物病毒，其基因组由两种ssDNA(VDl和VD2)所组成。该病毒专一性识别的宿主细胞为家蚕中肠组织的柱状上皮细胞，是致使家蚕慢性浓核病症的致病原，其复制机制尚不清楚。本课题主要在BraN和sj9的昆虫细胞中进行，首次采用线性化共转染的方式，将该病毒的两种全长基因组片段VDl和VD2转染这两种

4、昆虫细胞，并将转染后的昆虫细胞添食回感易感品系的家蚕幼虫，分别从病毒基因转录水平和表达水平，来检测转染后的昆虫细胞中能否通过这种方式产生具有感染性的病毒粒子。由此为该病毒基因组的各个基因的功能和遗传特性的研究奠定基础，并对该病毒的复制机制进行推测。1、对线性化共转染后Bran细胞感染性的检测和培养方式的探索通过酶切该病毒基因组全长的克隆质粒p11-VDl和pUC-VD2，利用酒精沉淀法收集带有特异性酶切位点的基因组片段VDl和VD2，线性化共转染BraN细胞，采用传代培养和持续培养两种方式，各培养20天。(1)

5、以收集的细胞团和上清培养基为模板，进行PCR检测，在持续培养和传代培养的细胞团中扩增到病毒基因的条带。(2)提取细胞团和细胞培养上清的总蛋白进行WesternbloRmg检测，在传代培养的细胞团中可杂交到与病毒蛋白相关的条带。(3)将转染后传代培养的BraN细胞吹下，进行间接免疫荧光检测，阳性反应定位于细胞核内。结果说明，线性化共转染的病毒基因组的DNA片段对BraN细胞具有感染性，在线性化共转染后采取传代培养的方式更有利于对BmN细胞感染性的研究。2、转染后的BmN细胞中拯救病毒的回感检测将收集的传代培养的B

6、mN细胞团和细胞培养上清分别添食易感品系的家蚕306的二龄起蚕幼虫，饲养至五龄第四天。(1)抽提家蚕中肠组织的基因组，以及家蚕蚕粪的稀释液为模板，通过PCR检测，在添食BraN细胞团的基因组中均可扩增到病毒基因的条带。(2)提取家蚕中肠的总蛋白，通过WesternbloRmg检测，只在添食细胞团的总蛋白中可杂交到与病毒基因表达有关的条带。结果说明，线性化共转染后的BraN细胞中产生了具有感染性的病毒粒子，可以使家蚕306幼虫发病。T家蚕二分浓核病毒在昆虫细胞中的拯救3、对线性化共转染后sj9和BraN细胞感染性

7、的检测将酶切后收集的基因组片段VDl和VD2，线性化共转染BraN和sj9细胞，传代培养20天。(1)抽提转染后细胞的基因组，经去甲基化处理后，进行PCR检测，仅在BraN细胞的基因组中可扩增到病毒基因的条带，而在sj9细胞的基因组中并未扩增到目的条带。(2)提取转染后细胞的总蛋白，通过Westernblotting检测，只在BraN细胞的总蛋白中可杂交到与病毒蛋白有关的条带，而在sj9细胞团的总蛋白中并未杂交到目的条带。结果说明线性化共转染的病毒基因组的DNA片段对sj9细胞没有感染性，对BraN细胞则有感染

8、性。4、对转染后的sj'9和BmN细胞中拯救病毒的回感检测将转染后收集的BraN和sJ9的细胞，分别添食易感品系家蚕菁松的二龄起蚕幼虫，饲养至五龄第四天。(1)抽提中肠组织的基因组，通过PCR检测，仅在添食BraN细胞组中可扩增到病毒基因的条带，而在添食sj9的细胞组中并未扩增到目的条带。(2)提取家蚕中肠组织的总蛋白，通过Westernblotting检测，只在添食BraN细胞团的总