糖原合成酶激酶3β参与并促进5FU诱导的细胞凋亡

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1、上海第二医科大学硕士学位论文糖原合成酶激酶-3β参与并促进5-FU诱导的细胞凋亡姓名：焦志军申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：沈霞2003.5.29中文详绑摘爱糖原合成酶激酶-3B参与并促进5--FU诱导的细胞凋亡中文详细摘要糖原合成酶激酶一3B(GlycogenSynthaseKinase--3B，GSK一3§)作为一种丝／苏氨酸蛋白激酶，其生物学作用已远远超过了最初认为的糖代谢调节酶的功能，广泛参与了细胞基本功能的调节，如细胞周期、基因表达和细胞骨架的稳定等。这些功能大多源自其对众多参与这些过程的关键蛋白的磷酸化作用，如cyclinD1、c—myc、HSF—l、Ta

2、u和B—catenin等。近几年来的研究发现GSK一3B是一些凋亡信号途径的重要组成部分，其作用方式多与不同的细胞系统和凋亡诱导剂有关，GSK一3B参与细胞凋亡的确切机制目前尚不清楚。本研究选择结直肠癌细胞colo320为研究对象，用5一氟尿嘧啶(5一FU)为凋亡诱导剂，观察GSK一3B在凋亡中变化规律，同时分析了转录因子NF—KB表达，以期发现其是否参与了GSK一3B对细胞凋亡的调节过程，初步讨论凋亡中GSK一3B的作用机制。同时，试图能够发现其在结直肠癌发生中的作用特性。第一部分5一Fu诱导col0320细胞凋亡实验研究以5一FU诱导col0320细胞凋亡，应用两种方法分析细胞凋

3、亡，分别为：AnnexinV-FITC／PI双标记流式细胞分析及Hoechst33342染色荧光显微镜形态学观察。选择5--FU浓度梯度：20、40、80、160ug／ml及作用时间：2、4、6、8、12小时，应用棋盘方式处理，发现col0320细胞凋亡比例随5--FU作用剂量增加和时间延长显著提高，说明其促凋亡作用呈时间和剂量依赖，并确定促凋亡实验条件为80ug／ml5--Fu作用8小时。所建立的Annexin—FITC／PI双标记流式细胞术可用于检测早期的细胞凋亡事件，可以准确地反映凋亡过程，第二部分WesternBlotting分析凋亡细胞GSK--3B、NF—KB表达本实验采

4、用化学发光(ECL--plus)免疫印迹法，是一种灵敏的非放射性标记的鉴别和定量蛋白质的方法。将经不同浓度5--FU处理的col0320细胞及对照组细胞裂解，提取总蛋白，经sDs—PAGE电泳、电转移，与针对2上海第二医科大学硕士毕业论文中史弹g#捅蛰GSK--3B的单抗及HRP标记的二抗反应，结果发现，与对照组相比，GSK-3S黪总俸表达承平在猫亡过程中未凳粥显改变。应蠲试裁盒分离疆敬5--FU处理及未处避细胞的细胞核、细胞浆蛋白，以Ⅱ--tubulin及histone分别为细胞核、细胞浆蛋白内参照，同样利用上进WesternBlotting方法分析这两个组中GSK一38、NF-K

5、B(P65)水平。结果发现，对照组GSK一3B、NF—KB主要分布在盱融浆，应用凋亡诱导剂后，细胞核中的GSK一30水平显著秀麓，瑟缨鼹浆中窳平下辫，帮发生了浆／菝豹移霞，谶织GsK～3§可是通过这种移位参与了细胞凋亡过程，而NF—KB表达及分布朱见改变。第三部分应用GSK一3§豹祷菇搽锈裁LiCI捧锈GSK-3S活浚，分褥细胞凋亡状态及_GSK一3B、NF—KB(P65)表达水平键离子赫前巴被作为公认的研究GSK-3§的一种工其。实验发现单独应用LiCl与col0320细臌作用，不能诱导col0320发生凋亡，但鬻意义的是LiCl与col0320细胞共同孵商后，W以显藩抑制随偌加入

6、的5一FU诱导的细胞摘亡。进一步说明GSK-38不仅参与藤且促送了5-FU涛导豹缀蕤溺亡。弹esternBlotting结果显示，加入LiCl抑甫r]GSK一3B活性后，核中NF-KB(P65)水平嚣麓，说臻GSK一3§褥棼$'jNF-KB(P65)囱核蠹迁移，使嚣者不憝发挥侄生存作用，所以GSK-38参与并促进5-FU诱导的细胞凋亡可能就是通过对NF-xB静捧翎。努夕}，氯纯键虽可选择。隆稚帛犯SK一3§，_轰嚣并不§￡抑制其浆／核移位，说明镪离子对GSK-3B的抑制并不是抑制其迁移，而是锂离子谯细胞浆中灭活了GSK一3§，然后GSK一3§以～种无活性的形式转移到胞核，因而无法怒到

7、对德应转录聪予磷酸他作用，或锂在缨照核孛发挥箨制终题。综上所述，GSK一3B通过细胞浆到细胞核的移位，参与了5一Fu诱导的coi0320缨藏麓亡。GSK-3璺戆选捧悭季辔利裁LiCl鼹著搀裂5一F毯诱导熬col0320细胞凋亡，说明GSK一3B发挥了促谶作用，同时能使核中NF-KB求平舞离，嚣魏推断箕掘裁可筢在于对键生存转录困子NF_x器的稚涮。进一步研究其具体的机制可为肿瘤的促凋亡治疗提供一个新的思路。关键词糖原合成酶激酶-3B5-FUNF—KB细胞凋亡