窖蛋白1在肝细胞增殖及肝再生中的作用研究

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1、摘要胞膜窖(caveolae)是细胞质膜表面直径为50～100nm的烧瓶状内陷微区。作为质膜上的独立结构，胞膜窖参与多种细胞活动，如胆固醇转运、细胞内吞(endocytosis)、细胞膜组装、信号转导、肿瘤生成等。窖蛋白．1(caveolin．1，Cav．1)是组成胞膜窖的主要功能蛋白，它与窖蛋白．2形成稳定的异源寡聚体，在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞等分化细胞中含量丰富。肝脏是人体代谢的中心站，含有极其丰富的磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)。在哺乳动物肝脏中，除了CDP．胆碱通路(Kennedy通路)外，还存在一条特有的PC合成通

2、路，即磷脂酰乙醇胺N一甲基转移酶(phosphatidylethanolamineN．methyltransferase，PEMT)催化磷脂酰乙醇胺甲基化生成PC的PEMT通路。研究发现，肝病时合成PC的PEMT活性降低。本实验室曾在大鼠肝癌细胞CBRH．7919中过表达PEMT2，发现其生长被显著抑制，并被诱发细胞凋亡。提示，肝脏中脂质代谢与肝细胞增殖的调控密切相关。事实上，窖蛋白．1对细胞增殖和脂肪形成都具有调节作用。～方面，在包括乳腺癌在内的多种癌细胞内，Cav．1表达下调；窖蛋白．1可以通过其N端的脚手架区(caveolinscaffoldingdomain，CS

3、D)寡聚Erkl／2的上游蛋白，抑制Erkl／2的活化，从而抑制细胞增殖和肿瘤转移。因此，窖蛋白．1通常被认为是候选的肿瘤抑制基因。但在个别癌症如膀胱癌、食道癌、甲状腺癌及前列腺癌中，Cav．1表达上调，提示Cav．1可能在这些癌症中起促肿瘤生成作用。另一方面，甘油三酯为肝再生提供能量并为新生细胞膜形成提供不饱和脂肪酸，甘油三酯的聚集是肝再生活动中的重要事件。最新的研究表明，窖蛋白．1通过促进甘油三酯的储存和利用而对肝再生起重要的调控作用。因此可以说，窖蛋白．1同时具有抑制细胞增殖和促进肝再生的双重作用，但目前Cav．1在正常肝细胞增殖和转化中的作用及机制尚不十分清楚。为

4、探讨窖蛋白．1对正常肝实质细胞增殖所起的作用，本文构建了窖蛋白．1特异性的短发夹RNA表达载体psiRNA—CAV3、psiRNA-CAV6和psiRNA-CAV7；其中，psiRNA-CAV7被转染至人张氏肝细胞系，并使用抗生素Zeocin筛选，得到Cav．1表达稳定下调的细胞株CAV7，而载体psiRNA．CAV3和psiRNA-CAV6做瞬时转染。MTT法检测CAV7细胞增殖的变化，WesternBlot检测Erkl／2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化。探讨体外下调张氏肝细胞内窖蛋白．1的表达对人肝细胞增殖的影响，以及产生影响的可能分子机制。同时，本文

5、还检测大鼠肝再生过程细胞内Cav．1及Erkl／2表达的变化，试图探讨窖蛋白．1在肝再生中所起作用及可能的信号转导机制。实验得到的结果包括：(1)正常张氏肝细胞有高水平的Cav．1表达，稳定转染psiRNA．CAVl后，Cav．1表达减少约70％；Cav．1表达下调后，肝细胞的增殖先变快(24和72小时，P<0．05；96小时，P

6、s．Erkl／2通路具有抑制作用。(4)无论瞬时还是稳定转染组，Cav．1下调后肝细胞内SAPK／JNK蛋白活性始终受抑制，而c．myc表达持续升高。(5)肝再生过程中，细胞内caveolin．1的表达在肝切除手术后24小时达到最高，并在96小时仍维持一定的高水平，提示其在肝再生中可能发挥作用；同时，Erkl／2的表达增加，并在术后96小时达到最高。综合已有的研究，本文得到以下结论：(1)窖蛋白．1可能通过参与跨膜信号转导影响Akt、Erk、JNK、c．myc等多个相关信号分子活性，从而调控正常肝实质细胞增殖。(2)窖蛋白．1可能通过调控肝细胞内甘油三酯代谢而在肝再生中起

7、重要作用。关键词：窖蛋白．1；短发夹状RNA；信号转导；肝再生AbstractCaveolaearedefinedaspitsof50-一100-amdiameterintheplasmamembraneandhaveacharacteristicfaskshape．Asdistinctdomainsoftheplasmamembrane，caveolaeparticipateinmanycellularprocessessuchascholesteroltrafficking，endocytosis，membranesort