参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控（论文资料）

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1、第三章参与DNA复制的酶类及DNA复制的调控第一节参与DNA复制的酶类DNA复制过程非常复杂，至少有20多种酶与蛋白质参与。一、DNA聚合酶(DNApolymerase)(一)作用机理DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸合成DNA，即催化前一个脱氧核苷酸3’－OH与后一个脱氧核苷酸5’－P之间形成3’,5’-磷酸二酯键的反应，从而延长DNA链，链延伸方向为5’3’，添加脱氧核苷酸的种类按碱基互补原则由模板DNA决定。DNA聚合酶需要互补于DNA模板上的一小段RNA作引物，由引物提供DNA合成时需要的第一个3’－OH。因此DNA聚合酶需要的条件包括4种dNTP底物、Mg

2、2＋、模板DNA和引物（图3-1）。图3-1DNA聚合酶的催化作用DNA聚合酶与3’－OH端周围的单链DNA模板结合，若进入的脱氧核苷酸的碱基与模板配对，该底物则结合到酶的三磷酸结合部位上。在聚合酶催化下，引物链的3’－OH对底物的5’－P进行亲核攻击，释出焦磷酸根，形成磷酸二酯键，新生链由此延长一个核苷酸，酶沿着模板链向前移动一个核苷酸距离。如此重复，直至酶到达模板终点。在体内释放的焦磷酸被焦磷酸酶水解，使反应平衡趋向DNA合成.2005年12月《Science》报道了DNA聚合酶高保真机理的新发现。高保真聚合酶除具有广为人知的校正功能外,最近实验进一步表明,由

3、不能及时校正或难于纠正的错配碱基引发“关闭”DNA聚合反应的效应,同样保证了DNA聚合反应终产物纯度。高保真聚合酶这一“关闭”DNA聚合反应的能力,促成其与耐外切酶消化3’末端敏感区碱基特异性引物共同构成一个SNP敏感性纳米级复合分子“开/关”，高保真聚合酶分子中相距三纳米聚合中心和3’端敏感区→5’端敏感区外切酶酶解中心则既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能:对配对的引物，则直接在该酶聚合中心进行聚合反应，即“开”的效应；而对于3’末端敏感区错配的引物，则从该酶聚合中心转移至3’末端敏感区→5’末端敏感区外切酶酶解中心，由于引物修饰了3’末端敏

4、感区耐外切酶的特点，继而出现了一种长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶聚合中心空转而“关”闭DNA聚合反应，即“关”的效应。这一新的复合分子“开/关”在很大程度上满足了后基因时代对SNP分析的要求。该SNP分子开关的应用,使基因诊断提高到单碱基水平。同时,利用该方法通过SNP对基因组扫描,在单基因遗传病病因研究及法医学鉴定上具有很强的理论和实用价值。2006年7月《Nature》报道新发现突变相关的DNA聚合酶(Pol)可能导致DNA复制保真度下降而参与突变形成。　　除人细胞中已知的5种Pol，Polα、β、γ、δ、ε，Polα、β的复制保真度很低。可能在遗传不

5、稳定形成中有作用。近两年来，据原核和低等真核细胞复制后修复(PRR)途径的研究成果，在人细胞中克隆了5个新的Pol:Polζ、η、θ、ι和Rev1编码蛋白。　　大肠杆菌SOS反应中的非定标性突变的发生与dinB基因有关。DinB蛋白有Pol活性(PolⅣ)，无3’→5’校读功能。高表达时可导致非定标性突变明显升高达上千倍。无损伤模板掺入错误率达10-3～10-4；大肠杆菌跨损伤DNA合成依赖于UmuD’2C复合体，其中介导的途径通常是易误性的，它的突变引起诱发突变频率的抑制。UmuD’2C复合体也具有Pol活性(称为PolV)。它在损伤或未损伤DNA模板皆表现为

6、高度易误性，能有效跨越DNA上无碱基部位(abasicsite)并优先插入一个腺嘌呤。酿酒酵母PRR途径有三个独立旁路(一个易误，两个无误)。基因REV1、REV3和REV7与易误性旁路有关。其中Rev3和Rev7蛋白构成Polζ，Rev1蛋白为有DNA模板指导的dCMP转移酶活性，因此也是一种Pol。在芽生酵母中的两条无误PRR途径依赖RAD5和RAD30基因。RAD30基因与大肠杆菌的DinB和UmuC和酿酒酵母中的Rev1基因同源。它可在DNA合成时在嘧啶二聚体的对面正确掺入两个腺嘌呤。它是一个保真度很低的Pol，其掺入差错率高达10-2到10-3。这些与突

7、变形成密切相关的Pol在人细胞中都找到了相应的同源物基因，与酵母中的REV3同源的hREV3编码的Polζ以及与Rev1同源的基因；与大肠杆菌中的DinB和酵母RAD30同源的hDinB基因编码Polθ；与大肠杆菌UmuC和酵母RAD30同源的hRAD30基因编码Polη、另一与酵母RAD30同源的hRAD30B编码的Polι。已证明着色性干皮病变型(XPV)系Po1η的突变所致。这些新发现的Pol，可能与诱发的细胞遗传不稳定的形成有关。我们证明用反义核酸技术阻断Polζ表达的细胞系MNNG诱发的非定标性突变的频率减低。(二)原核生物DNA聚合酶在大肠杆菌体内发现

8、了三类DN