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《猪繁殖与呼吸综合征病毒N、GP5蛋白的表达、纯化及结构分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
摘要猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。由PRRSV基因组ORF5、ORF7编码的GP5、N蛋白是其主要的结构蛋白。本研究通过构建PRRSVBJ一4株ORF5、ORF7不同的原核表达载体，应用不同的纯化方法。获得高纯度的重组表达蛋白，通过对纯化蛋白的圆二色谱(cD)分析，绘制出GP5、N蛋白的二级结构图，从结构生物学的角度分析了PRRSVN、GP5蛋白结构与功能的关系。分别应用pGEX-6P一1、pET28a表达载体，获得核衣壳蛋白N的可溶性表达。将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)PRRSBJ-4株N基因克隆至原核表达载体pGEX-6P．1，重组质粒pGEX一6P-N在E,coliBL21细胞中可溶性表达融和蛋白GST-N，经GST亲和层析获得重组蛋白GST-N，应用PrescissionProtease切割获得纯化的N蛋白；将BJ-4株N基因克隆至原核表达载体pET28a，得到重组表达载体pET28-N．转化E．coliBL21(DE3)细胞，’获得可溶性表达，表达量占菌体蛋白的28％。经ProbandNi”亲和层析获得重组蛋白P28-N。通过生物信息学分析，应用pGEx—6P-1、pET32a表达载体，分别构建了缺失信号肽的GP5蛋白及缺失跨膜域的t3P5突变体原核表达载体pGEX-6P-dE、pGEX-6P．dEM、pET32-dEM。表达量分别为16％，32％，50％。进一步通过包涵体变性复性、分子筛凝胶层析、GST亲和层析获得纯化的重组表达蛋白GST-dE、GST-dEM和P32．dEM。应用圆二色谱测定纯化的P28-N、GST-dE、GST-dEM等蛋白，计算相应的二级结构组成，结合生物信息学分析，绘制出GP5、N蛋白的二级结构图。对P28-N重组蛋白的CD分析表明，P28-N中n螺旋、B折叠、T-转角、蜷曲分别为26．1％，23．7％，19．8％和30．3％：根据PDB中PRRSVVR2332株N蛋白c端部分三级结构，经同源模建绘制了BJ-4株相应域的三级结构；结合P28-N的结构预测，绘制出PRRSVN蛋白的=级结构图。N蛋白二级结构中，Ⅱ螺旋由40个∞组成。形成2条p链(12aa)，含有多处p转角(14aa)。圆二色谱对GST-dEM蛋白的分析表明，GST-dEM含有44％(155aa)的Ⅱ螺旋，14．4％的B链(约50aa)。应用PDB中已解析的部分GST结构信息校正融合分子的结构；通过多种结构预测方法比较，确定共同保守域的二级结构；结合圆二色谱二级结构的检测结果，进一步绘制出PRRSVBJ．4GP5蛋白的二级结构图。GP5蛋白a螺旋约58n，B链约56fla，p转角14aa，其它为无规则蜷曲。根据N、GP5的二级结构，从结构的角度分析了PRRSVGP5、N蛋白结构与其功能的关系。N蛋白的二级结构与其参与病毒核衣壳的形成、NLS穿梭运转功能及其线性表位的形成等功能密切相关，N蛋白3个Ⅱ螺旋区及6链对N蛋白农壳的结构形成起重要作用。通过对GP5二级结构的分析，为PRRSVGP5的变异、免疫原性、GP5的诱变表位等功能的认识提供了依据。关键词：PRRSV；N蛋白；GP5；二级结构；圆二色谱 AbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isthecausativeagentofPRRS。whichcausedreproductivefailureinSOWSandrespiratoryproblemsinpiglets．Glycosylatedmembranceprotein(GP5),nucleocapsid(N)proteincodedbyORF5，ORF7ofPRESV，a∞twomajorstructuralproteinsofPRRSV．Inthisstudy,theNproteinandGP5wereexpressedasafusionproteinwithglutathione—S-transferase(GST)orhis-taginEcoil,andtherecombinantproteinofNandGP5weresuccessfullypurifiedusingdifferentpurificationmethods．Subsequently,thesecondarystructureofNandGP5werecharacterizedbyciculardichroism(CD)spectroscopy,andtherelationshipsbetweenthestructureandfunctionofNorGP5wereanalyzedthroughtheirsecondarystructure．Thesolublerecombinantnucleocapsidprotein(tOwasobtainedbyeoustruetingdifferentexpressionvector．TheNpreoteinWasexpressedasafusionproteinwithglutathione-S-transferas口(GST)inEcoliBL21strainbyusingprokaryoticexpressionvectorpGEX-6P一1，therecombinantprotein(GST-N)WitSobtainedbyasinglestepofaffinitychromatographyusingGlutathinioneSepharose4B，andtheintactN(N’)wassuccessfullypurifiedfromthefusionproteinbyPrescissionprotease．ThepET28-NexpressionvectorWasconstructedusingpET28avector．Thesolublefusionprotein(P28-N)withhis-taglocatedinN-terminalwasexpressedat28％expressionlevelinEcoliBL21(DE3)hostcells,andthepurifiedP28-Nproteinwasharvestedbynickelchelateaffnitychromatographymethod．ThebiochemicalcharacteristicsofGP5，dE(thesignalpeptidedeleted)，dEM(thetransmembraneedomaindeleted)proteinandmanypresumptiveGP5fusionproteinswereanalyzedbybioinformaticsanalysismethods，andthedifferentrecombinantexpressionvectors(pGEX-6P-dE．pGEX-6P-．dEM,pET32-dEM)woreconstructedwithexpressionvectorspGEX-6P-Iand／orpET32a．TherecombinantfusionproteinsGST-dE，GST--dEMandP32-dEM(expressedbypGEX-6P-dE，pGEX-6P-dEMandpET32-dEM，respectively．)couldamountto16％，32％and50％ofthetotalmassofbacterialproteins．ThepurifiedrecombinantproteinsGST-dE，GST-dEMandP32-dEMweregainedthroughdenaturationandrefoldofinclusionbodies，affinitychromatographyonglutathione-agnrosecolumn,andgelfiltrationchromatographyonSephacrylS-100HRoncohmm．ThesecondarystructureofF28-N，GST-dE，GST-dEMwereperformedbyCDspectroseopy．ThesecondarystructureofGP5andNproteinwereplottedintermsoftheresultsofCDspectroscopyandsecondarystructurepredicationbybioinformaticsanalysis．ThehelicalcontentofP28-NWasestimatedbycomparingitsmearlresidueellipticity,TheCDanalysisshowedthatthepurifiedPET28-Nsharedasignificant(26坳a-helicalsmlcture，13-sheet(23．7哟，争turn(19．8徇，andrandomcoil(30．3呦，respectively．ThethirdstructureofNA57(themutantdeletedN-terminal57aminoacidsoftheNprotein)anditsdimersofBJ-4strainswereprotractedbyhomologymodelingwithNprotein3DstructuretemplateofPRRSVVR2332strainfromPDB．Finally，amodifiedNproteinsecondarystructureofBJ-4strainofPRRSVWasdeduced，andtheaminoacidamountsofn-helical，[],-sheets，11 13-turuandrandomcoilofNproteinwasapproximately40，12，14and57，respectively．ThecirculardichroismanalysisshowedthatthepurifiedGST-dEMcontainCt-helical(44％)(155aa)andB-sheet(14．4％1structure．‘rhesecondarystructureofGP5wereplottedaccordingtotheresultsofGSTprotein3DstructuretemplatefromPDBdata,differentstructuralpredicationandCDanalysis．Theaminoacidamountsofa-helical，p-sheets，]3-turnandrandomcoilofGP5proteinwasapproximately58，56，14，and72，respectively．TherelationshipsbetweenthestructumandfunctionofNorGP5ofPRRSVwereelucidatedthroughtheirsecondarystructureinaspectsofstructuralbiology．ThesecondarystructureofNproteinishelpfulforunderstandingitsfunctions．ItWasindicatedthatthestructureofNLS(nuclearlocalizationsignal)，NoLS(nucleoluslocalizationsignal)andNES(nuclearexportsignal)hadthecapacitytobindsomeshuttleprotein，andmightplayaimportantroleintheshuttlingofNproteinbetweenthecytoplasmaandthenucleus．TheprimarysequentialepitopeslocatedinthepartoftherandomcoilofNprotein．Threea-helixandits[3-sheetsofNproteinmightplayaimportantroleinthenuclaneapsidformationofPRRSV,ahighsurfaceprobabilityofconformationalepitopein56an～90aaWaSgeneratedowingtoNhomodimersformation．ThesecondarystructureofGP5couldproviderationalstructuralexplanationforrecognizingthefunctionofconservedtransmembranceregions，varimion，immunogenicityandthedecoyepitopelocatedin27an-31aaofGP5ofPRRSV．Itisnecessarytoresolvethethree-dimensionstructureofGP5anditscorrespondingligandsinordertounderstandthestructuralrelationshipofGP5-Mheterodimers，andthefunctionofapoptosisinducingbyGP5protein．Keywords：PRRSV；Nprotein；GP5；secondarystructure；titulardichroismIll 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。僦躲若毒、哆帆朋声年舭日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生繇粕。略帆础年／彬日导师签名：岔獗耖时间：缈矽年钥∥日 缩略词表塑堕塑薹塞全整!塞全整aaaminoacid氨基酸Ampampicillin氨苄青霉素bDbasepair碱基对CDcirculardichroism圆二色谱DAB3,3，-diaminobenzidine3,3’一二氨基联苯胺DNAdeoxyribonucleteicacid脱氧核糖核酸dNTPsdeoxynucleosidetriDhosphate三磷酸脱氧核苷DTTdithiothretol巯基苏糖醇EDTAdisodiumethylenediarninetetraacetate乙二胺四乙酸二钠GSTGlutathioneS-transferase备胱菅肽转移酶HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGp-D-thiogaiaetopyranoside异丙基硫代半乳糖苷karlkanamyein卡那霉素kbkilobasepair千碱基对kDakilodaiton千道尔顿Lliter升mgmilligram毫克minminute分钟mLmilliter毫升mol／Lmole／liter摩尔，升litnucleotide核苷酸ODopticaldensity光密度ORFOpenreadingflmme开放阅读框PAGEpolyacrylamidegeleleetrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PPEPreseissionprotease鼻病毒前体切割蛋白酶PRRSVporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合症病毒rpmrevolutionsperminute每分钟转数SDSSodiumdodeeylsulfate十二烷基硫酸钠ssecond秒ltLmieroliter微升VlⅡ 些窑些耋茎鳘姜耋，一。!，。，，!。!．，，。。，耋=耋堑第一章引言猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种传染病，以怀孕母猪发生流产、死胎、术乃伊胎等繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为特征-该痛自1987年爆发虬米，在世界各地广泛流行，给世界养猎业造成了严重的经济损失(B耐ield“aL1992：Meulenbergetat，2000：Blaha8，a1．2000)。1995年至今．PRRS在我国北京、河北、河南、湖南、广东等主要养猪省份流行，引起我国养猪生产的巨大经济损失(郭宝靖，1996：杨汉春．1997；刘文兴，1998：黄金海，2002)。由于PRRSV可引起持续性感染和兔瘦抑制(rdarmugh甜越，1995；Huauel以2003；Wilkd口^，1997；Chung吖a／．，1997)，猪场一旦感染。很难消灭，潜在危害极大。1．1国内外研究概况PRRSV归属于套式病毒目动脉炎病毒科．是一种专嗜在巨噬细胞内生长、有囊膜的单股正链RNA病毒(Conzelmann盯aL,1993)。病毒全基因组长约15kb,包括9个开放阅读框(ORFs)(Faabergetai．．1998)．其中ORFla和ORFlb位于基因组的s端，占据整个基因组的∞％．编码RaNA聚台酶和相关蛋白酶等非结构蛋白(NSPI～NSPl2)。ORF2a～ORF7位于基因组的3‘端，其中ORF2--4分别编码GP2、GP3、GP4三种塘基化蛋白，OKFS-．ORF7分别编码囊膜蛋白GP5、基质蛋白M和核农壳蛋白N州删【蛆曲“以1995；Suarezeta／,1996；WuWH盯at,200I：Meulenberg““，1995；Drw．v日以，1995；MeuLenberg，1996：Wieezorek-Kmhmereta／。1996：Deaetal．，2000a)．GF5、N蛋白作为PRKSV的主要结构蛋自．在庸毒的复制与增殖、致病与免疫、遗传变异等方面有重要作用，因而成为研究的热点。N蛋白分子量约为15kDa，其上至少有7个抗原表位，是PRRSV粒子中含量最多的病毒结构蛋白，也是免痤原性最强的蛋白。N蛋白是体液免疫应菩的主要抗原，是目前PRRS血清学诊断方法的抗原基础(Deaetal．2000b：WooRonetat，1998：MengX．J．，1995a；I)enae，“aL，t997)，也是PRRSV抗原分型和基因分型的主要依据．N蛋白是形成PRRSV核表壳的唯一结构蛋白，在稳定病毒RNA基困及病毒复制、转录、病毒粒子的装配过程中起着重要作用。研究推测PRRSVN蛋自可能形成20--30m的二十面体的核衣壳核心，其外面包裹一层包含病毒腆蛋白，形成约60f帆的球形病毒粒子。对RNA晶体的X．射线衍射表明，许多遗传上无关的二十面体RNA痫毒衣壳单体均可形成相同的“8条反平行链形成的B桶型结构”，表壳内部突出的臂带有阳性电荷，可与病毒粒子内部的RNA反应(AlanJCmm，∞0})。RNA内韶鸵基毋以同样的方式形成二十厦体对祢结构，其项点与袁隽血翻表面的碱性氨基酸残基反应。这些共同的结构基元在一定程度上解释了病毒是如何选择性地姐装具有一定结构的基因核酸，甚至可提供设计特异性药物以阻断这种组装，最近DoaB等(2003)解析了N蛋白C端部分区域的三缓结构，认为两个N蛋白单俸可以遵过C端(约66曲)区域的口蠕旋、p折叠形成同滚二聚体，两个较长白哿Ⅱ螺旋形成衣壳的多}茬面(Woollenet吐，2003)。c端1i个氨 基酸残基对衣壳的形成起重要作用(Woottenela1．，2001)。但由于缺乏对整个N蛋白二级结构或三维结构的解析报道，不能完全揭示PRRSV在壳的组装形式。N蛋白在PRRSV感染中具有双重作用，N蛋白在细胞浆中作为病毒的结构蛋白形成核农壳；在核或核仁中则作为非结构蛋白调节宿主细胞的功能(Dongwanetal．，2003)。N蛋白具有在胞浆和核内间穿梭转运的功能，并可能参与宿主细胞的调节。这与N蛋白上诸多的功能基元(核定位、信号NLS、核仁定位信号NoLS、核输出信号NES和胞浆保留域)密切相关(Wotton，2003；DongwanetaL，2003：AlanJ．C．，2001)。因此，明确N蛋自的结构，有助于了解N蛋白与病毒基因组闰的关系，以及N蛋白在病毒复制、转录、翻译和装配中的作用。GP5是PRRSV中变异最大、功能最复杂的结构蛋白。前期大量的研究表明，GP5蛋白在PRRSV的致病与免疫机制上有特殊的作用。众多研究表明，PRRSV可；f起免疫抑制和持续性感染(LemkeetaL，2004；Lamontaglleeta1．，2003；Rowlandetal,2003)。免疫抑制可能与病毒对免疫细胞的嗜性有关。PRRSV主要分布于感染猪的淋巴结、肝、脾脏等免疫器官，其主要嗜性细胞为肺泡巨噬细胞(PAMs)。决定该病原感染的关键是病毒对肺泡巨噬细胞的吸附与侵入(Nanwyneketal．，1999)。GP5蛋白和M蛋白可能参与识别PRRSV在PAMs上的受体，并认为该受体是一种类肝素分子(Nathalieet口f'2003；P．L．Delputte，2002；Wissinketa1．，2003)。GP5具有中和表位，又有诱导细胞凋亡的活性，在诱发T细胞的增殖应答方面很重要(BautlstaE．M，eta1．1997)。已证明最重要的中和表位(37aa--45aa)位于GP5的胞外区，GP5C端的50个∞对维持其抗原性具有重要作用。缺失C端50个n则GP5失去与血清抗体的反应性(Deaetdf．，2000)。GP5蛋白在体内外均能诱导细胞凋亡(SuarezP．，1996；LabarqueGG，2001：NauwynekHJ，1999；Sureta1．，1998)，缺失突变质粮的体外瞬时表达试验表明GP5N端的118个氨基酸对于维持GP5诱导细胞凋亡的活性必不可少(Femanderzetal．，2002)。PRRSV诱导细胞凋亡可能是其引起免疫抑制和持续性感染的原因之一。GP5又是PRRSV最易发生变异的结构蛋白，其变异袭现在遗传(基因水平)和结构(蛋白质水平)上。ORF5可通过随机突变(ChaagCC，2002；Kapurelal．。1996；Goldberg，2000)、基因重组(YuanetaL，1999；Meng,2000；MurtaughetaL，1998,VailvugtJJ’2001；Yoonetal．，2001；Forsbergeta1．，2002)和准种的产生(Rowland，1999；TonyetaL，2003；Ranee“aL，2003)等发生基因改变。GP5的变异表现在氨基酸序列的变化、糖基化位点的缺失或修饰、氨基酸缺失等方面(VingFang,2004；Kijonaeta1．，2001)。目前已有大量的PRRSVORF5基因序列被测定，但对GP5功能的认识也仅局限于一级结构的认识。尚不能完全揭示其结构与功能的关系。因此认为，GP5蛋白与细胞免疫、体液免疫有关，也可能涉及PRRSV的免疫抑制和持续感染。通过对GP5结构的分析，有望揭示结构与功能的必然联系。虽然对PRRSV的研究不断深入，在病毒结构蛋白和功能的关系和免疫特性等方面取得了一些进展，但对PRRSV蛋白功能的认识，有赖于对其结构的解析，但目前对N、GP5蛋白的结构仅局限于一级结构的认识。2 中国农业大学博士论文第一章引言1．2研究目的与意义晷内外学者对PRRSV的研究主要集中于病毒的分子生物学、各蛋白生物学功能以及诊断和免疫防制技术等方面，大量的研究表明，PRRSVN、GP5蛋白在PRRSV的致病与免疫机理上有特殊的作用。但这些研究中，关于PRRSV蛋白结构与功能关系的研究较少，特别是通过蛋白结构的研究来认识PRRSV致病机制和免疫抑制、持续性感染的特殊性和复杂性。对蛋白质折叠问题．即蛋白质分子如何从一条完整伸展的肽链最终形成难一构象和生物活性静天然状态的研究是当前蛋白质科学和分子生物学领域的一个热点。蛋白质是发挥生物学活性的直接物质，对PRRSV主要病毒蛋白结构的研究，将有助于认识PRRSV复杂的致病与免疫机制，为有效防制该病提供理论依据。本研究旨在通过解析PRRSVBJ-4主要结构蛋白N、GP5的结构，为认识和分析PRRSV的致病与免疫机制提供结构生物学依据。1．3研究内容与技术路线本研究拟应用基因表达技术，表达PRRSVBJ-4株主要结构蛋白N、OP5，通过不同的纯化方法，获得高纯度的重组蛋白，通过圆二色谱(ciculardichroism，CD)分析，解析PRRSVBl4主要结构蛋白N、GP5的二级结构，从结构生物学的角度分析N、GP5结构与功能的关系。主要研究内容包括以下三部分：1．3．1PRRSVBJ’4核农壳蛋白N的可溶性表达与纯化1．3．2PRRSVBJ-4GP5蛋白的高效表达与纯化1，3．3PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析FOEX、pET原核表达系统具有高效、可溶性表达、可通过亲和层柝获得毫纯度重组虽白等优点，而被广泛应用于重组蛋白的结构生物学研究。本研究选择了原核高效表达载体pGEX—6P．1及具有较小融合肽的pET28a系统，表达PRRSVBJ-4N及缺失突变的GP5蛋白；应用GsT亲和层析、镍金属整合层析等技术，获得高纯度的重组表达蛋白：通过CD分析，明确重组蛋白的二级结构组成．结合二级结构预测、与蛋白质结构数据库(PDB)中相关蛋自的同源模建等方法，解析BJ-4毒株N、GP5蛋白的二级结构；根据BJ_4株N、GP5蛋白的二级结构，来认识和分析PRRSVN、GP5蛋白特殊的生物学功能。1，4研究目标通过解析PRRSVB14主要结构蛋白N、GP5的二级结构，旨在从结构的角度分析N、OP5蛋白结构与其功能的关系。为认识PRRSV的致病与免疫机制提供结构生物学依据。 中国农业大学博士论文第二章PRRSVBJ一4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化第二章PRRSVBJ．4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化摘要：通过设计不同引物将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ一4N基因及其缺失体dN48基因分别克隆至原核表达栽体pGEX．6P-1或pET28a，获得的重组表遥质粒pGEX-6P-N、pGEX．6P．dN、pET28．NmE、pET28-N／NX分别转化宿主细胞，表述量分别占茵体蛋白的28％。46％，28％和26％，其中重组质粒pGEX．6P-N、pET28-N／BE转化菌为可漆№表达．应用GST亲和层析获得融合N蛋白(GST-N)，经PrescissionProtease切割获得纯化的N蛋白：应用ProbandNi”NTA金属树脂层析获得重组蛋白P28-N．关键词：PRRSV；N蛋白：表达：纯化2．1前言PRRSV的核衣壳蛋8NmORF7编码(MurtaughetaL，1995．Meulenbergeta1．，1995；DrewetaL，1995)。N蛋白为不含信号肽、非耱基化蛋白，占病毒总蛋白的20％～40％左右。成熟的N蛋白在美洲型和欧洲型分别为123aa，128aa(Mardassietal,1996)。N蛋白是目前PRI疆v研究中功能最为复杂的蛋白之一。在病毒复制过程中，不论欧洲型或美洲型毒株，N蛋白均定位于肺泡巨噬细胞(PAMs)或MARC．145细胞的胞浆与核仁(Rowlandeta／．，1999)。对所有P瑚强v分离毒株N蛋白氨基酸组成分析表明，N蛋白中的碱性氨基酸比例商达26％，N蛋白上有与RNA基因组结合的关键位点。该蛋白是邢：ILsV的主要免疫原，抗原性最强，PRRSV感染后机体首先产生的是针对N蛋白抗体，并且N蛋白抗体在体内的存在时闯最长(Bautistaeta／．，1996)。此外，用纯化的P砒毽v免疫小鼠制备的单克隆抗体大部分是针对N蛋白，因而该蛋白己被作为检测PRRsv感染猪血清抗体的诊断抗原(Loumbaetat,1996；刘平黄等，2003；Denaceta／．。1997)。目前对N蛋白的研究主要集中于功能与诊断应用等方面．结构的研究成为进一步认识其功能的必然选择。最近，Doan等(2003)得到缺失N端57aa的N蛋白结晶，并解析了其三维结构，但目前仍缺乏完整N蛋白结构的认识。大肠杆菌表达系统具有低廉、高效和稳定等优点，成为目前蛋白质结构生物学研究中基因表达的首选系统。pGEX原核表达系统可通过GST亲和纯化、蛋白酶切割融合肽等获得目的蛋白。pET28a表达系统是一种方便而且有效的原核表达载体，通过设计不同的引物，可以构建在N端或C端含有His-tag的小分子量融合肤，有利于蛋白的提纯，同时又不影响蛋白结构的分析。本研究选择了原核高效表达载体pGEX-6P-1及具有较小融合肽的pET28a系统，以便于通过亲和层析技术获得高纯度的重组表达蛋白，为N蛋白结构的研究奠定基础。4 2．2材料与方法2．21材料2．2．1．1血清PRRS阳性血清：为本实验室用PRRSBJ-4人工感染SPF猪制备。2．2．1．2载体与菌株pGEX．6P．1：AmersheiaPharmaeiaBioteeh公司产品：重组P∞sci嚣iDnP俐瑚se(PPE)表达质粒(pGEX-PPE)，清华大学韩雪清博士惠赠：E．coli．BL21菌株：基因型为F-,ompT,hsdS(rB’naB。)，gal，购于AmershamPharmaciaBiotech公司；E．coliJMl09菌株：购自Promega公司；表达载体pET29a(Navagen公司产品)，E．celliBL21(DE3)菌株(Novagen公司产品)，均由本室保存；PRRSV8．I-4pGEM-ORF7阳性重组质粒，由本室构建(高云等，2001)。2．2．1．3主要试剂TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、和dNTPs。购自踟"lgO／l公司；限制性内切懿西口RI、Ba,nHI、DL．15000DNAMarker、DL-2000DNAMarker购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶：Biolabs公司产品：DNA快速纯化回收试剂盒：购自博大泰克生物工程公司；GlutathioneSepharose4B、氧化型谷胱苷肽(Glutathioneoxidized)、还原型谷胱苷肽(Glutathioneredu∞d)和．BulkGSTPurificationModules，购于AmarshampharmaeiaBioteeh公司．4"C保存：ProbondResin镍基质，invitrogen产品，批号1160763，4℃保存；HRP标记的兔抗猪IgO，由本实验室制备，--20"12保存：三羟甲基氨基甲烷(Tris-碱)、甘氨酸：购自上海生物工程公司；N’N’一二甲基甲叉双丙稀酰胺、丙烯酰胺：购自华美生物工程公司。2．2．1．4镍螯合层析用溶液结合缓冲液A：50mmol／LNaH2P04，500mmol／LNaCI，HCI调至pH8．0。用于裂解细菌和镍基质与裂解液作用·洗涤缓冲液B：50mmol／LNaH2P04，500mmol／LNaCl，HCl调至png-0。10mmol／Liraidazole．用NaoH或20mmol／Limidazole，用NaOH或洗脱缓冲液c；50mmol／LNaH2POt，500mmol／LNaCI，250mmol／Limidazole，用NaOH或HCI调至pH8．0。 中国农业大学博士论文第二章PRRSVBJ-4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化22．1．5诱导表达用溶液100mmol／LIPTG贮存液：IPTG0．2389溶于10mL去离子水中．过滤除菌，分装，．20℃冻存。2xYT液体培养基：Tryptone169，YeastExtract89，NaCI59加入蒸馏水950mL，NaOH调节pH值至7．4，定容至1000mL，115’C高压灭菌20rain。Amp／2xyT液体培养基：于2xYT液体培养基中按终浓度Ioort∥rnLjJnZ．Amp贮存液制备。l(mn／2xyT液体培养基：于2xYT液体培养基中按终浓度50”g／mL加入Kan贮存液制各。Amp(／Can)／2xYT固体培养基：琼脂粉1．5g溶于100mL液体2xYT中，12l℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右-加入Amp分别至终浓度为100ug／mt,(或加入终浓度50ug／mL的kan)，浇制平板。2．2．1．6SDS．PAGE溶液30％丙烯酰胺(呐)：丙烯酰胺299、N-N’甲叉双丙烯酰胺lg，去离子水定容至100mL，pH不能超过7．0，过滤，4"C于棕色玻璃瓶贮存。1．5mol／L'rrls·CI(pHS．8)：Tris-碱18．179溶于80mL去离水中，加入约3mL的浓盐酸调pH8．8，定容至100mL。lmol／LTr／s·CI(pH6．8)：Tris-碱12．19，溶于80mL去离水中，加入约7mL的浓盐酸调pH6．8。定容至100mL。10％SDS：SDS109．100mL去离子水。加热至68"0助溶。10％过硫酸胺：过硫酸胺59，加去离子水定容至50mL。TEMED原液5x'rr|s-甘氨酸电泳缓冲液贮存液(pⅡ＆3)：在900raL去离子水中溶解15．19Tris碱和949甘氨酸，然后加入50mL10％(W／V)的电泳级SDS贮存液。定容至1000mL。2xSDS加样缓冲液：100mmol／L"Iris’CI(9H6．8、200mmol／L二硫苏糖醇(DTT)或5％13-巯基乙醇(临用前加入)2％SDS0．03％溴酚蓝20％甘油考马斯亮蓝染色液：90mL甲醇：H20(1：1v／v)和10mL冰乙酸的混和液中溶解0．259考马斯亮蓝R250，用Whatman滤纸过滤，以除去颗粒状物质。脱色液：按甲醇：冰乙酸：水(3：I：6)的体积配成脱色液。2．2．1．7Western-Blot用溶液6蛋白转印缓冲液(pUS-2) 中国农业大学博士论文第二章PRRSv8J-4按衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化Tris碱1．939甘氨酸99甲醇20％加水定容至1000mL。10x丽春红贮存液：丽春红S29三氯乙酸309磺基水扬酸309加水定容至100mL。应用时用蒸馏水作1：10稀释后即可使用，用后应予废弃。PBS：NaCi89KH2P040．24gNa2HP04(无水)1．44gKClO．2g37"C加热溶解后，定容至1000mL．15磅高压灭菌。TBS(pⅡ7．5)：101RmOI／LTris·CI150mmol／LNaCI定容至1000mL，高压灭菌后，室温保存。封闭液(St清稀释液)：含10％马血清的PBS。底物溶液：20ragDAB，30％H20218IIL。50mL0．01mol／LTris．CI(pH7．5)·临用前配制。Bradford试剂(考马斯亮兰C一250检测试剂，汪家政，2001)：100mg考马斯亮兰G-250，溶于50mL95％的乙醇后，再加入120mL85％的磷酸，用水稀释至lL。2．2．1．8Prescissionprotease切割用溶液Prescissionprotease贮存缓冲液：50mmol／LTris’CI，150mmol／LNaCl，1mmol／LEDTA，1mmol／LDTT，调整至pH8．0。冻存酶时，补加20％甘油·]Prescissionprotease切割缓冲液(pH7m)：50mmoVLTris-Cl，150耻ml，LNaC!，1mmol／LEDTA．Immol／L【玎Ta2．2．1．910xPBS细胞裂解液(pH7．4)140mmol／LNaCI2．7mrfiovLKCl10mmoI／LNa2HP041．8mmol／LKH2P04．补充蒸馏水至40．991．0917．99I．2g500mL7 中国农业大学博士论文第二章PRRSVBJ-4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化2．2．1．10鸡尾酒蛋白酶抑制剂(工作浓度)PMSFEDTAPepstatinA(胃蛋白酶抑制剂)Leupeptin(亮抑蛋白酶肽、Aprotinin(trypsininhibitor)现用现配。2．2．1．11GST亲台洗脱缓冲液(pn8．0)O．35ug／mLO．3mg／mLIug／mLO．5～!ug／mLlug／mE50mmol／L"Iris·CI，10mmol几还原型谷胱苷肽，调pH值至8．0。2．2．1，12主要仪器设备BiofugePrimoR台式冷冻高速离心机：购自德国Heraeus公司BiometraPCR仪：Whatman公司BiometraPTC．100TMPcR仪；购自MJ研究公司AlphalmagerTM2200凝胶成像分析系统：美国Alpha公司产品HZQ-C型恒温振荡器：购白哈尔滨东联仪器厂蛋白垂直电泳仪：购自Bio-RAD公司超声波裂解仪：sonicsvibmcell产品。CentriconYM-3型、Y／v1．10型蛋白浓缩管：Millipore产品。分光光度计111emoSpeetronie，HeliosGamma型(英国产)。2．2．2方法2．2．2．1PRRSVBJ-4N蛋白特性的生物信息学分析N蛋白的生化特性预潮在htlp：t／cn．expasy．org／tools／protparam．html服务器上。按照Hoop和Woods的方法(1981)，分析BJ-4株N蛋白平均憎水值(grandaverageofhydropathicity，GRAVY)；分析拟表达蛋白在大肠杆菌表达的半衰期(half-life)、不稳定指数(instabilityindex)等。N蛋白相关构像参数的预测在http：／／cn．expasy．org／tools／protseale．html来绘制蛋白质的亲／疏水性图谱、易接近性(accessibility)、易变性(flexibility)等二级结构构象参数。N蛋白的NLS序列预测应用http：／／psort．nihb．ae．jp／fonn2．html预测核定位信号(NLS)序列(BenjaminL．，2000)。可溶性预测根据DavisGD．(1999)等修订的Wilkinson-Harrison模型通过正则变量(cV)和8 中国农业太学博士论文第二章PRRSVBJ-4携衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化组成参数计算来判断蛋白质的可溶性。CV；kl(N叶G+P十s)，n+地I【(R+KHD+E)l／n-0．03l；n=蛋白中的氨基酸数；N、G、P、s分别表示Ash，Gly,Pro，ser残基的数量；R、K、D、E分别表示Arg,Lys，Asp，Glu残基的数量，丸1=15．43，k2=一29．56：可溶性的概率=cv-cv’，判别常数CV’=1．71：CV-CV，>O，为不溶性蛋白；CV-CV’(0，为可溶性蛋白。可溶性环溶性的概率=0．4934+0．276Kcv-cv’)卜0。0392(cv-cv’)‘抗原表位分析应用hltp：／／www．bioinfo．org．crdlmh／antigenicI．html分析N蛋白的抗原表位。2．2．2．2引物设计与合成根据PRRSVBJ-4株N基因序列(GeilBank收录号：AF331831)，采用Oti904．0软件，设计合成如下特异性引物(斜体下划线表示引入的酶切位点)．引物编号、长度等见表2。l。表2-1ORF7引物编号、序列、长度及引入的内切酶!!!堕；：!!b!宝2Q§墅91竺!!』!墅壁!!!!!盈罂璧堂e!罂融．!!g壁!四巴墅一编号序列内切酶长(nO画线注解CodeSequenceRestricionendonuclcaseL∞glllRemarks以FTU和P7L为上下游引物扩增ORF7，预期扩增产物长度为401bp，克隆至pGEX-6P-1载体，理论上表达一含354aa、分子量约40．3kDa、N端带有GST-tag的融合蛋白；克隆至pET28a载体，理论上表达一含157aa、分子量约17．083kDa、N端带有His-tag的融合蛋白。以pd'N48、P7L为引物，扩增产物dN48长度为272bp，克隆至pGEX-6P-1载体，理论上表达一含311aa,分子量约35．7kDa、N端带有GST-tag的融合蛋白；以PTl和P72为扩增引物，预期扩增产物长度为379bp，克隆至pET28a载体，理论上表达产物含136氨基酸，编码一C端带有Hi．tag，分子量约14．846kDa的融和蛋白。根据pOE)(系统载体序列，合成通用鉴定引物，5"-pGEX：5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG．3’；3"-pGEX：5，-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG．3’，应用该通用引物，扩增pGEX-6P．1载体长度为187bp。2．2．2．3目的基因的PCR扩增以阳性重组质粒pGEM-ORF7为模板，利用P7U、PTL引物PCR扩增含有BamHFEcoRI酶切位点的ORF7基因。PCR按顺序加入以下试剂，建立50v-LPCR反应体系：9 串国农业天擎馕±论文第二章肚髂vBJ-4糖衣舞置自N神可溶性表达与纯化2．5mmol几dNTPs1uLIOxpCR缓冲液5uL25pmol／L的上下游引物各】laL阳性克隆质}i(1：100)2ⅡLPfllDNA聚台酶2．5U用无菌去离子水补至50止．按以下程序进行PcR反应：舛℃预变性3rain，进入循环：94"C交性4血，55。e退火40s．72"C蜒伸45S，共30个循环，最后72℃延伸5rain。1．2％琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。2．2．2．4原核重组表达载体的构造分别接圈2．i，圈2-2拘建pGEX系统、蛭T系统的表达毁体，●PPELEVL．FQOPLGsMPNⅫ{G—ASPsA。J(肺殴直巡ATGCCAAATCCCTCAGCATOATGGGCTG鲍d珏g田2-IpGEX-6P-N盈含量白表达鹱律鞫建示意豳洼：荷头指示为msa轴I加PIa吼靼(呷E】切翎位点l下划越撕擂入片段的酶切位点．Fig2·1Schcnmficrcpr㈣tationofIllecxDmssioneonslrugliDnofpGEx-6P-NprolcirlND悼：thean'owhd-叫田Ⅱ"PPEd刚自蚌；ite；嘶cti∞曲血n-*I％徘pilesis佃d甘．岫圈2-2pET2$-N表达虢体构构建艟式国Fig．2·lsd扯Inalic砖pfcsen协曲noftheexpr懿ionc．onsla"dctiortofpE砣s-Npmtcin目的基因I'CR产物与表达筑体质粒pGEX-6P-I、pE'I'28j的酶切利用艘制性内切酶岛D尺iIBamHI或Neol／Xh01分射对目的基因PCR产物和表达载体质粒pGBX石P-{、pET2如37℃承浴双酶切2h。电泳回收醇切后的目的基因和表达载俸DNA参照鼎国DNA回收试ifll盒说明书操作：切驭含DNA片段的琼脂糖凝胶．按重量比1：3(DNA片段：溶液B，体积重量比)加入溶液B，50'C水浴10rrtin，萁问涡漩振荡三次，直至胶完全溶化；籍溶液重于离-Ii,鞋中，静置1～2ntin，8000rpm离心30--60s，倒掉液体：加入500¨L溶液C(用无水乙醇1：1稀释)于离心柱中。8000rpm离心30--缶Os，倒掉液体；用溶液C重复洗涤一次。15000rpm再次离心30--60s，以服于剩余液体：将离心柱置于薪的离心管中，加入55℃预热的帮坡D20—301xL,混匀．静置2rnin，10 中国农业大学博士论文第二章PRR“Bd-4辕农壳蛋包髓鹩可溶性表达与纯{艺15000rpm离心60s，管底即为所需DNA。耳的基因与凌体DNA的连接与转化按颗序加入下列试荆建立lO江韵连接体系，将纯化回收后的PCR产物与表达载体pGEX-6P．1连接：10xT4DNA连接酶缓冲液1止表达载体DNA100ngPCR产物50"-'100ng1"4DNA连接酶ou／吐)l儿用无菌去离子水补至10皿，离心混匀于管底，4"12连接过夜。从_800e冰箱取出冰冻的YMl09感受态细胞(100讧，管)于冰上融化，轻弹管壁使其混匀。吸取5止连接液加入上述盛有感受态细胞的离一fi,管中；轻弹管外壁使其混匀，冰浴20min：42℃水浴热激45s后立即冰浴2rain；加入900止L8培葬液。150rpm，37"C培养60m沁取lOOIlL菌液涂布于Amp／LB(pGEX．-6P-1载体)平板或Kan／LB平板(pET28a载体)，37"(2培养过夜，利用抗性筛选重组转化体。2．2．2。4重组表达载体的鉴定挑取单个抗性转化子菌落，接种3mLAmp／LB或Kan／LB液体培养基，37"C摇菌过夜培养，用碱裂解法提取质粒傲以下鉴定。重组表达载体的PCR鉴定对∞Ex系统，分尉应用pGEX-6e-I载体通用引钧、N基因特异引物进行PCR扩增，电泳鉴定扩增产物；pET系统，分别应用pET28a载体T7上游引物和P7L下游引物、N基因特异性引物进行PCR扩增，电泳鉴定扩增片段。重组质粒的双酶切鉴定用EcoRI／BamHl双酶切重组质粒，37"C反应2h，l％琼脂糖电泳检查插入片段的大小，序列测定利用位于pGEX．．6P-!载体多克隆位点上游和下游的通用钡4序引物结合位点．对插入N基因片段的阳性重组表达质粒pGEX·6P-N、pGEX-6P-dN进行序列洳定：对pET28-N(BE)、pET28稍(Nx)重组载体应用上游T7引物测序，测序由华大中生生物科技有限公司完成。2．2．2．5基因工程重组表达菌的诱导表达重组菌的诱导表达将构建的重组表达质粒pOEx-6P-N、pGEX-6P-dN转化BL21礴受态细胞，涂布于Amp／LB平板，37"(2培养过夜．利用Amp抗性筛选重组转化体；将鉴定后的重组表达质粒pET28-N(BE)、pET28-N(NX)分别转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于K出-dLB平板，过夜培养，利用kan抗性筛选重组转化子。挑取阳性重组菌的单菌落，接种于3mLAmp(或Kan)抗性的2xYT培养基中，37"12活化过夜后，l：100稀释到相应抗性的2xyT中，37'U、230rpm振摇培养至对数生长期(OD6,oo---0．6～1．o)，加入终浓度为1mmol／L的IPTG，于28℃、230rpm振摇诱导培养3～6h。分掰于诱导前和诱导后不同时间取出1．5mL。5000rpm离心10rain收集菌体，弃上清后加入2xSDS上样缓冲液，煮沸5rain，甩12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检查表达情况。重组蛋白的可溶性检测将诱导表达的蛋白经超声波裂解，裂解条件如下：4"12冰浴间断超声，超声2s、间歇5s．共3rain。波幅为30％，待超声苗液较清亮时。4"C12，000×g离心 中国农业大学博士论文第二章PRRSVBJ-4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化20min，分别收集上清和沉淀，取样作SDS．PAGE电泳。2．2．2．6SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDs—PAGE)参照分子克隆实验指南的方法配制12％的分离胶(SambrookJ．，2001)，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶(使梳子到胶面的距离约1cm)，胶面上加一层水，室温放置约30rain，待胶充分聚合后吸干水，加入配好的浓缩胶。装上梳子：室温放置约30rain使胶充分聚合，于4"C放置2h后拔出梳子即可加样进行电泳；取诱导表达苗液1mL，5000rpm离心10min．弃上清，加入50肛I2xSDS上样缓冲液，混匀，煮沸5min，12000rpm离心2rain，取上清lO山上样，同时设蛋白质标准分子量孔：恒压200V电泳50～60min；用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色渡浸泡凝胶，在摇床上染色30～45min；将凝胶浸泡于脱色液中，脱色2～4h，其间换液数次，直至有清晰条带出现。2．2．2．7Western-Blot检测电转印将基因工程诱导菌和对照菌全菌体蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，按如下操作进行电转印：裁剪大小与凝胶面积一致的Whatman滤纸6张和PVDF膜l张，先将PVDF膜在甲醇中浸泡10min，然后于转印缓冲液中浸透(gJ10rain)。转印电极装置从负极到正极依次放置海绵垫、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸和海绵垫。放置时用玻棒轻轻滚动赶除气泡；固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注满转印缓冲液(pH8．2)，恒压70V转印2h或35V转印过夜。PVDF膜总蛋白质染色转印结束后，取出PVDF膜晾干置室温风干10min，浸入1x丽春红染色液染色5～10min，取出用蒸馏水漂洗至条带清晰，检测转印效果，并用铅笔标出蛋白质标准分子量。丽春红可在随后的免疫检测过程中被洗掉，而不影响检测结果。免疫检测将丽春红染色后的PVDF膜转移至封闭液中，室温轻摇3～5h后4℃封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液PBS-T洗膜3次，每次5min。然后加入适当稀释的一抗溶液(以封闭液1：40稀释的PRRS阳性猪血清)中，室温下振荡1～2h：PBS-T洗膜3次，每次10min。然后加入适当稀释的酶标二抗溶液(以封闭液1：400稀释的HRP一兔抗猪IgG)，室温振荡l～1．5h；PBS-T洗膜3次，每次10min。然后置于底物溶液中显色，条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应。2．2．2．8亲和层析纯化GST-N融合蛋白谷胱甘肽Sepharose4B的平衡混匀谷胱苷肽Sepharose413基质后，取出所需用量放于合适的离心管内(若需1mL柱床体积，需取1．33mL初始的谷胱苷肽Sepharose4B基质)。500rpm离心smin沉淀介质，小心地吸弃上清。用预冷的PBS洗涤Sepharose4B(每1．33mL初始的谷胱苷肽Sepharose4B需用10mLPBS洗涤)，加入PBS后混匀。500rpm离心5min沉淀介质，小心地吸弃上清。每1．33mL初始的谷胱苷肽sephal"05e4B加入lmLPBS得到50％的Sepharose4B，混合均匀，4"C备用，亲和层析--Column法取约含10fng融合蛋白的超生裂解上清，加入lmL经PBS平衡12 的50％谷胱苷肽Sepharose4B，冰浴或4℃振荡作用60rain。用灭菌吸头将第一步中的混合物移入拄内，取下柱昀底盖让液体自然流出。保留部分样品，做SDS—PAGE分析。加入lO倍柱床体积的PBS进行洗涤．让PBS自然流出t再重复洗涤数次。至A280小于o．02。将柱的底盖盖上，用洗脱液(50mmolILTris-C1、10mmo|／L还原型谷胱甘肽·pH8．O)洗脱融合蛋白，每毫升柱体积加入1mL洗脱液．冰浴或432作用15～30rain。取下柱的底盖t收集洗脱液，即为目的蛋自。再重复洗脱并收集2～3次。最后SDS．PAGE检查各步骤的样品。确定亲和层析情况。用紫外分光光度计测定样品在260啪和280珊波长的光吸收值，计算样品中的蛋白质含量·谷胱甘肽Sepharose4B的再生加入2倍柱体积的Sepharose4B再生缓冲液l(pH8．s)进行洗涤，然后500rpm离心5rain沉淀介质，小心地弃去上清。加入2倍柱体积的Sepharose4B再生缓冲液Ⅱ(pH4．5)进行洗涤，然后500rpm离心5rain沉淀介质，小心地弃去上清。再重复用再生缓冲液I和Il洗涤3-4次。最后用3～s倍柱体积的PBS平衡，放于4"C备用。若长期保存(1月以上)，用10倍柱体积的PBS洗涤2次，再用20％的乙醇重复洗涤2次，放于4"C保存。2．2．2．9重组Prescissionprotease(PPE)的制备重组PPE蛋白的诱导与纯化将pGEX-PPE质粒转化BL21宿主菌后3732培养12h，挑取单菌落，按上述方法接种Amp／LB培养，诱导、超声裂解后，离心收集裂解上清，过GST亲和层析柱，应用还原性谷胱萤肚洗脱，收集纯化的pGEX-PPE蛋白，SDS-PAGE检查洗脱蛋白的纯度，确定亲和层析情况。合并46kDa单一条带的纯化PPE洗脱蛋白，经PBS透析，，孀紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm波长的光吸收值，计算样品中的蛋白质含量。pGEX-PPE蛋白的分装、保存按Prescissionprotease单位的定义(50mmol／LTris．CI．150mmol／LNaCl。1mmol／LEDTA。lmmol／LDTT,pH7．0的缓冲液中，在532下16h切割100pgGST．融合蛋自获得90％以上切割效力的酶，为一个活性单位CU)。一般她，2u鹊Preseissionprotcase可切割100ug融合蛋白)，每mg蛋白的酶活为833～1000units。应用Preseissionprotease贮存缓冲液(50mmol／L"Iris·CI，150lllmo扎NaCI，10mmol／LEDTA，1mmol／L饼rr，20％-R油，pH8．0)将纯化PPE调整至每mL含2000units，一80℃保存。2．2．2．10N蛋白的回收应用一步亲和层析法从GgT-N融和蛋白中切去GST，回收N蛋白。具体方法如下：取lmL柱床体积的谷胱苷肽Sepharose4B，500xg离心洗涤5rain，弃上清，经10倍柱床体积的PBS洗涤．加入到20mL表达裂解上清中(加有鸡尾酒蛋白酶抑制剂)，432作用lh后上柱，用432预冷的10～20倍柱床体积的Prescissionpmte勰e裂解缓冲液(50mmol／LTris·C1，pH7．0，150mmol，LNaCl。lrnmol／LEDTA，lmmol／LD1了)洗床，至0I)280<0，02；加入20止(80ilnits)的PrescissionproteaB,c，980}lL432预冷的裂解缓冲液，432振荡作用10--24h。收集物即为纯化的N蛋白。应用CntriconYM-313 中国农业大学博士论文第二章PRRSVBJ-4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化型超滤浓缩管浓缩样品。用还原型谷胱苷肽洗脱GSTSepharose4B柱上结台的GST、GST-PPE等，并按前所述再生GlutathioneSepharose4B基质。2．2．2．11可溶性重组蛋白P28-N的镍螯台纯化样品的处理将25"C诱导4h的P28-N培养物200mL离心后，按约1：10(Ⅵ，v)的比例加入预冷的含1％TritonX-100、Immol／LPMSF、1mg／mL溶菌酶的结合缓冲液A，冰浴30min；将诱导表达的蛋白4℃冰浴间断超声波裂解，裂解条件如下：超声、间歇各2S，共3min，波幅为30％，4℃12,oooxg离心20rain；上清经O．22pro的微孔滤膜过滤后备用。天然可溶性蛋白的纯化按1mL50％Pmband基质加入4mL结合缓冲液A。轻柔混合，待基质自然沉淀后，用吸头轻轻吸弃上清；加入4mL诱导菌裂解上清，在4℃或冰浴条件下，200rpm的摇床上混合60min；将裂解液-PronbandResin混合物加入带有平底盖帽的柱子内；取F柱底盏子让液体自然流出。保留部分样品作SDS-PAGE分析{用4～lO倍柱床体积的洗涤缓冲液B(加入30％甘油，1mmol／L的PMsF)洗涤2～5次，并用考马斯亮兰G-250检测试剂(Bradford法)间隔检测洗脱液，如果颜色由棕红色转变为蓝色，则继续洗脱，直到洗脱液颜色不变为止；用0．5mL含100～500mmol／L咪唑的磷酸盐洗脱缓冲液C洗脱含his-tag的重组蛋自P28-N，分管收集洗脱液，留样进行SDS-PAGE分析。洗脱流速控制在0．5～1mL／min。SDS．PAGE检验纯化蛋白的纯度，合并仅有目的蛋白的收集管，经分子截量3虹)a的蛋白浓缩管(YM-3型，Milliporej：a：盅n)浓缩后，4"12下磁力搅拌PBS液快速透析4h，收集蛋白于一80℃保存。Proband镍基质的再生在纯化柱中加入2mL再生介质。加入50mmol／L的EDTA8mL洗涤络合Ni2十；用0．5mol／L的NaOH溶液8mL洗涤介质2次，8mL灭菌蒸馏水洗涤2次；加入5mg／mLNiCh灭菌水溶液8札再生作用1h，用8mL蒸馏水洗涤2次；加入0．02％叠氮化钠或20％乙醇作保护剂，用盖帽或paratilm膜封柱，室温储存。ProBond基质可反复利用3～4次不需再生，再生不要超过3次。2．3结果与分析2．3．1BJ．4N蛋白及其拟表达重组蛋白的理化特性分析N蛋白及拟表达重组蛋白的主要理化特性、不稳定指数(Ouruprasad，eta／．，1990)、根据蛋白质‘‘N端规则’预测的大肠杆菌体内半衰期(Cieehanover，efa／．，1989)等结果见表2-2；N蛋白、表达载体、拟表达融合蛋白的可溶性预测见表2-3。14 m龇2也PIe书怕姑蜘d哟sbe．吐蚴ic“p缸ame￡懿s(印，GRAVY，{diphaticindex，instabilityind耽＆b扛lf-Iifc)pres$e(Inftheor0忙●n}x1n丘cD，，型迪婪堕一一——————趔坠——型竖——————一N13．56t23t0．07-0．94057．894272U’iOh6P．12831482436．01-0．398帆673816S>10hDG鹾招K40．40354S．乃一0．53678．对3，·91S’1铀DGEX-6P-dN35．714316．60·0．402B3．093"7—4)S’10hpET2$-N／BB17．12D1辩'D．34-0．97,35(3．3239·82S’10h堕翌!型竖!塑!．垡!!：翌墨竺L—竺已—兰芝——L——型皇一蛋白氧荽酸致(n)N+P+G晦(甜^K】一正划至重cVcV’川带任小，川搿仕傅年I掬J．：堡i虫塑!堑!堡～i!竺!!鲤．旦一￡!里!型垒竖!塑．．!!!：!：!j!!!!!：!三2苎竖!!!：!!在106～117位氨基酸闻，包含一潜在的核输出信号序列(NES)，通过N蛋白上的核输出序列 16妻．-“～m11．⋯p⋯⋯⋯⋯⋯a-，危r、一‘f{、≥_。以f、＼jLI，、J?。5／、∥蝌●心V。汀℃妒c}一 中国农业大学博士论文第二章PRRSV8J一4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化m～●1●⋯p⋯⋯⋯⋯⋯口。一』t／1一F旷0～＼捌II|_-础兰鹭；图2-3N蛋白相关构像参数的预测注：4．亲水性油．相对突变力{c．易变性；d．易接近性残基Fig．2-3Conformationa]parameterspredicationofNproteinNote：_．hydB_bilicily)b。Relativemtnabifity=c,Aver．g。／]=xibility：d，accc☆ibleresidues抗原表位分析http：／hM．vw．bioinfo．oIg．cn／lmh／antigenicl．htm通过分折已明确蛋白的抗原位置信息显示，如果疏水氨基酸如Cys，Leu和Ⅶ暴露在蛋白质的表面则很有可能是抗原表位的一部分。Kohskar与Tongaonkar开发了一个半经验的模块来预测蛋白的抗原表位部位，其中使用了物理化学方法对氨基酸残基进行分析，并且归纳了经试验确证的抗原表位数据。应用该模块预测大量蛋白质的结果表明其精确性可达到75％。对BJ-4株N蛋白抗原表位的预测，表明以下位置存在潜在的表位：19aa～33aa，53aa～58aa，63aa～68aa，72aa～82aa，88aa～93aa，99aa～120aa。2．3．2重组表达质粒的鉴定2,3，2．1PCR鉴定挑取不同抗性的重组单菌落，培养后提取质粒作模板，进行PCR扩增。pGEX-6P—N、pGEX-6P-dN的PCR结果见图2-4，pET28-N㈣、pET28·NmX)的PCR结果见图2-5，电泳结果显示PeR扩增产物大小与预期结果一致。17 中国农业大学博士论文第二章PRRSV日J-4核衣壳蛋白N的可溶性表达与纯化围2．4pGEX．6P．N．pGEX．6P．dN重组质粒的PCR鉴定往：1，pGEX_6p-dN(通用引物)；2，pGEX-6P-dN(PdN48fPTL)：，，pGE)油P|l(通用引钉kM,DL2呻ODNAMarkcr}4，水对照：5，PGEX'6P-N(通用引挪f6,pGEX一6P-N(P7U／P7L)Fig．2．41heidentificationofpGEX-6P-N’pGEX-6P-dNrecombinantclonebyPCRNote：1,3．5，PCRproductsofpGEX,．6p-dN，pGEX-6P．1，pGEX-6P-Nbyuniversialptime*s5'-pGEXand3'-pG既：2,6，PCRprOdUCtsofpGEX-6P10h6P-dE4096．60_0．02495113672S>10h6P·dEM3526．72-0．26188953946S>10hP32一dEM287611-0．25883．3430．IIS>10h可溶性预测根据Wilkinson-Harrison模型计算拟表达蛋白的可溶性，结果见表3-4。预测表明所表达的蛋白均为包涵体。表3-4目的蛋白、载体蛋白及拟表达融合蛋白的可溶性预测Table3-4Predicatedsolubilityofcarrier,target,andfusionprotein蛋白分了量(kDa)氨基酸数(n)正则变量CVCV-CV’可溶性，币溶性的概率ProteinMWNo．ofaminoCononicalpmbabilityofsolubilityor篓!查!墅!堕!!!!!!业迎6P-128．32431357027_o．35297585％solublepET32a20．4189l930237022023743．1％insolubleGP52222002．48830．7783685％insoluble6P-dE466740919112930．20129354．7％insolube6P·dEM40563522．220367051036762．4％insolublep32-dEM3I．442872．2003430．49034361．％insoluble3．3．20RF5缺失突变体dE、dEM的PCR扩增以pGEM-ORF5为模板，以P51和P52为上下游引物扩增ORF5，预期扩增产物长度．为565bp：P51／PN、PCP52分别为引物，扩增片段分别为MSbp、255bp，再以这两个片段为模板，以P51、P52为引物，获幸导397bp缺失跨膜域能jdEM基因，见图3—9。42图3-9ORF5缺失突变体dE、dEM的PCR扩增淀：l，】00却DNA]adder：2，dE；3，P5】PN；4，PCP52；5dEMFig3-9dE＆dEMmutantsofORF5amplifiedbyovcrlappingPCR ±里壅些查兰竖士论文第三章PRRSVBJ一4GP5蛋白的高效表达与纯化3-3．3原核重组表达载体的鉴定小量抽提Amp抗性的重组菌质粒，进行以下鉴定。3．3．3．1PCR鉴定分别应用pGEX-6P-l载体上下游引物及各特异性引物对进行PCR扩增，结果见图3-10。电泳结果显示PCR扩增产物大小与预期一致。图3-10pGEX-6P-dEM，pGEX-6P-dE重组克隆的PCR鉴定注：M，Marker(DL2000)：1，pGEx_6P_l(通用引物){2，水对照：3，pGEx—6P_dEM(通用引物b4，pOEX-6P-dEM；5，pGEX-6PME(通用引物)t6．oGEX-6PMEFig3-10TheidentificationofpGEX-6P-dEM-pGEX-6P-dErecombinantclonebyPCRNote：M，DL2000DNAladder；l，3，5，PCRproductsofp6EX-6P-I，pGEX-6P-dEM，pGEX4SP_cIEbyuniversal"reefs；2．control：4,6，FCRproductsofpGEX-6P-dEM，pGEX45PpET32a>pET28a，相对于膜蛋白，pGEX系统是一种理想的表达系统。PGEX载体上接上了寄生蠕虫Schistosomajaponicun的sJ26蛋白基网，表达一26kDa的谷胱苷肽s．转移酶，所表达出来的融合蛋向质大部分是可 中国农业大学博士论文第三章PRRSVBJ一4GP5蛋白的高效表达与纯化溶的．可咀在不变性的条件下用谷胱苷肽亲和柱进行层析：它的C端加入了部分蛋白酶切割序列和十多个附加的氨基酸序列．而且这些氨基酸残基不会影响GST同谷胱苷肽的结合。pGEX-6P一1载体含有鼻病毒3c蛋白酶Prescissionprotease切割位点，可以用与GST融合的重组Prescissionprotease在4℃切割，防止高温切割导致的蛋白降解，GST及未被切割的融合蛋白可以用谷胱苷肽．Agarose吸附除去，从而获得目的蛋白单体。相对于dE，缺失疏水性跨膜区的dEM基因，在较多的的融合表达系统得以表达，而且表达量大大提高。分析其原因，跨膜性蛋白可能与宿主膜蛋白竞争有限的膜空间等。而表现出对宿主细胞的毒性。先后应用不同的宿主细胞，BL21、BL21-CodonPlus-RP(可识别AGG／AGA／CCC密码子)及Rosetta(DE3)(可识别AGGAGA，AUA，CUA，CCC，GGA6种稀有密码子)均可获得目的蛋白的表达．但表达量没有明显的差异，可能与所表达的目的蛋白含有极少的稀有密码子有关。一般地．目的基因上含有很少稀有密码子或非多个串联的稀有密码子对基因表达的“瓶颈效应”影响不大。但不同宿主细胞均不能得到可溶性表达，表明宿主细胞不能改变表达蛋白的可溶性。应用Wilkinson-Harrison模型可以预测原核表达蛋白的可溶性。改造前后GP5不同表达载体表达产物的可溶性预测表明，GP5的融合表达产物均为包涵体。但表达蛋白的可溶性受表达基因、诱导条件、环境条件等因素的影响，在前面的研究中，通过低温诱导，曾获得较大量的可溶性GST-N蛋白。本研究曾尝试低温诱导、改变宿主细胞、培养条件等，均没有获得GP5相关改造蛋白的可溶性表达。多种因素影响蛋白质的可溶性，其中基因(或氨基酸)组成是影响表达和蛋白质可溶性的重要因素(JanetS．，1999)，通过缺失GP5跨膜域、信号肽等较多疏水性氨基酸．明显提高了蛋白的表达量，但通过低温诱导、改变宿主细胞、培养基等均不能改变蛋白的可溶性，获得的蛋白仍为包涵体。表明目的基因是决定蛋白可溶性的关键因素。试验结果也表明，改造后表达的重组蛋白的理化特性得以改善。重组蛋白GST-dEM的表达量、在溶液中的溶解度和稳定性以及与GST亲合基质的结合能力均优于重组蛋白GST-dE：此外，缺失跨膜区后表达量明显提高(重组载体pGEX-6P--dE，pGEX-6P-dEM。pET32-dEM的表达蛋白分别占菌体蛋白的16％，32％，50％)，使后续蛋白纯化的操作难度明显降低。3．4．2关于包涵体的纯化与变性复性新合成大量目标蛋白的折叠过程中，菌体内参与折叠的蛋白因子的量不能满足需要，无法形成正确的折叠。很多外源蛋白在大肠杆菌细胞内表达时往往以不溶的、无生物活性的包涵体形式存在。至今人们尚不清楚包涵体形成的确切机理，有人认为决定包涵体形成的关键是折叠中间体的稳定性及影响其折叠的环境因素综合作用的结果(AlanSmith,1995)。包涵体是由于新生肽链折叠过程中所形成的折叠中间体分子间的不正确的相互作用而发生聚集所产生。一些研究表明，新生肽链合成过程中，由于各种原因所引起的肽链中氨基酸残基疏水侧链的不正常暴露，促使高效表达的重组蛋白分子之间相互作用，产生聚集而形成包涵体。包涵体的形成给通过亲和层析纯化蛋白造成困难。要得到较纯较高产率的目的蛋白，需要做好破菌，包涵体的分离、洗涤及增溶、变性复性等过程。(1)所表达的融合蛋白GST-dE，GST-dEM均较稳定，通过加入终浓度lOOug／mL的溶菌酶，冻融1次，超声裂解，镜检等步骤，以确保菌体充分裂解。 中国农业大学博士论文第三章PRRSvBJ一46P5蛋白的高效表达与纯化(2)为了除去包涵体上粘附的杂质(膜蛋白或核酸等)，在低浓度变性剂洗涤液(2mol／L尿素，1mmol几EDTA，50mmol几Tds-CI，pH8．0)中加入温和去垢剂TritonX．100洗涤去除膜碎片和膜蛋白(FischerB，1993)；加入脱氧胆酸钠以促进脂蛋白的溶解，并洗涤包涵体2次，以充分除去尽可能多的杂蛋白。(3)应用6-8M尿素，通过离子间的相互作_}}J，打断包涵体蛋白质分子内和分子问的各种化学键，使多肽伸展；同时为了打开包涵体中一些链间形成的二硫键、链内的非活性二硫键，加入5mM的还原剂二硫基苏糖醇(DTT)：调高包涵体溶解液pH值至9,5左右，以增加蛋白质的亲水性，促进包涵体溶解。在包涵体溶解过程中，应避免使用SDS等去垢剂，SDS虽然可以破坏蛋白内的疏水键．溶解包涵体蛋白质，但其可导致蛋白结构不可逆性的变化(宁云山，2001)，不利于结构分析。(4)为了研究蛋白结构，必须使变性的蛋白恢复其天然构象。在复性过程中，将溶解的包涵体充分稀释至蛋白浓度O．5m∥mL左右：在采用连续递减浓度的尿素复性液中缓慢复性；在．复性溶液中加入lmmol，L还原型谷胱苷肽与氧化型谷胱苷肽(摩尔比为10：1)，以促进潜在二硫键的形成；保持复性液pH值在8．0以上，防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对二硫键的形成。将GST-dE，GST-dEM与谷胱苷肽亲合基质作用，来纯化两种重组蛋白，但不能获得GsT．dE纯化蛋白，推测可能是由于GST-dE蛋白的结构经变性复性重折叠后受到影响，与亲合基质结合的氨基酸残基被掩盖，GsT-dE蛋白的复性效果较差。(5)复性效果的检测通过圆二色谱光谱检测、与GST的亲合性能及免疫学方法检测了复性效果。结果表明，GST-dEM蛋白在几方面的性能均优于GSTME蛋白。我们应用SDS处理得到的GsT．dE纯化蛋白，在CD检测中，n螺旋比其它复性样品明显降低，表明SDS处理导致蛋白结构不可逆性变化，难以恢复。变性的包涵体蛋白经高稀释度稀释后，通过递减的尿素浓度会缓慢的复性，但一般复性效率不超过20％(宁云山，2001)。而且复性蛋白经冻融后，会有许多沉淀形成，必须经离心或超滤后才能进行CD分析。经改造的GST-dEM复性的比率约为15％，远远高于未缺失跨膜区的GST-dE蛋白。P32MEM蛋白由于超高表达(约50％)，蛋白的纯化的难度也明显降低。复性的样品经sDS_PAGE表明，分子量与预期一致，纯度达到结构分析的要求。未缺失跨膜域的GST-dE蛋白含有较多的疏水氨基酸，在水溶液中的稳定性差，易聚集形成沉淀，亲台纯化效果差，不适于进行CD分析；变性复性的GST-dEM蛋白具有良好的免疫原性及与GST亲合基质结合的能力，纯化蛋白的亲水性增强，在溶液中的稳定性较好，适合于进行CD分析。3．4_3关于变性条件下金属螯合层析纯化重组蛋白镍螯合层析可以在变性条件下纯化带有His4ag的重组蛋白。但N端或C端带有一个或多个组氨酸的蛋白具有强的镍基质的亲和力，其作用甚至大于抗原抗体的亲和力；一些不带His-tag、但有组氮酸位于蛋白结构表面的、具有较强可近性的蛋白也可以与镍基质结合，所以镍螯合层析纯化常出现较强的非特异性杂蛋白。为了获得高纯度的蛋白，必须对纯化条件进行50 中国农业大学博士论文第三章PRRSVBJ一4GP5蛋白的高效表达与纯化优化。我们选用含有20mmol／L咪唑、0～2mol／L梯度尿素、pH值8．0的结合缓冲液，pH6．3的洗涤缓冲液，pH值5．9～pH4．5的洗脱液洗脱的进行纯化。(1)通过在尿素溶液中对包涵体蛋白P32一dEM的变性，使His-tag充分暴露，从而易于与镍基质作用。但高浓度的尿素使变性蛋白有较强的粘性，不利于His-tag与镍基质的作用，我们选用含低浓度(2mol／L)尿素的结合缓冲溶液与镍亲合基质作用；(2)采用柱(column)纯化法纯化。P32-dEM的His-tag位于重组蛋白中部，不利于与镍基质的作用，加之变性复性的效率一般不高(心O％)，而柱纯化法有利于充分复性，使His-tag充分暴露、Hi．tag融合肽的可近性(accessbility)明显改进。在高表达、杂蛋白较少的情况下，纯化效果显著。(3)由于P32．dEM表达量高，复性的包涵体中重组蛋白纯度高，选用较高浓度的味唑结合缓冲液(20mmol／L)有利于降低杂蛋白与镍基质的非特异性结合。(4)His．诅叠的pKa约为6．0．在pH5．34．5的情况下。将被质子化而不再与镍基质结合，重组蛋白被洗脱。因此，采用较低的洗脱液pH值(pn值由5．9降至4．5)洗脱，pH5．9含50mmol／L眯唑的洗脱液洗脱1次后，应用pH4．5、含250mmol／L的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白·3．5小结3．5．1通过对PRRSVGP5基因的缺失突变，应用pGEX-6P．1，pET32a载体高效表达了缺失跨膜域的GP5蛋白。3．5．2通过包涵体洗涤、变性复性、凝胶层析、GST亲和层析等条件的优化，获得了高纯度的GST-dEM蛋白。3．5．3在变性条件下应用金属螯舍层析获得了高纯度的重组蛋白P32-dEM。3．5．4改造表达的GST-dEM重组蛋白理化特性明显改善。其表达量、包涵体复性比率、在溶液中的溶解度和稳定性、与GST亲合基质的结合能力均优于重组蛋白GST-dE：缺失跨膜区后的重组蛋白表达量明显提高，大大降低了纯化难度。5J 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析摘要：应用圆二色谱(CD)测定了纯化的P28-N，GST-dE，GST-dEM等蛋白，计算相应的二级结构组成，结合生物信息学分析，绘制出PRRSVBJ-4株GP5、N蛋白的二级结构图．分祈结果表明，PRRSVN蛋白中a螺旋占40aa，B折叠占12aa，转角14aa，蜷曲占57aa；GP5重组蛋白n螺旋、D折叠、转角、无规则蜷曲分别为58an，56aa，14aa和72aa．根据BJ-4株GP5、N蛋白的二级结构。从结构生物学的角度分析了PRRSVGP5、N蛋白结构与功能的关系。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒，N蛋白，GP5，圆二色谱(CD)，二级结构，功能4．1前言虽然国内外学者对PRRS进行了大量的研究，但目前PRRS免疫防制效果仍不尽人意。PRRS可引起持续感染和免疫抑制(Lemke2004；Lamontagne2003；Rowland2003；HuaLi．，2003：WissinkEH，2003)，具有复杂的致病机理和免疫机理。前期对PRRSV的大量研究主要集中于病毒的分子生物学、各蛋白生物学功能、诊断和疫苗防制技术，缺乏对PRRSV病毒蛋白结构与功能关系的研究。GP5、N作为PRRSV的主要结构蛋白，在瘸毒的复制与增殖、致病与免疫、遗传变异等方面有重要作用。现已证实PRRSV嗜性的肺泡巨噬细胞上存在M或M-GP5蛋白复合体的唾液酸受体(Delputt℃，2002)，GP5蛋白存在中和表位，针对GP5的单抗在病毒中和试验中比其它蛋白的单抗更有效(Weilandeta1．，1999；Gonineta1．，1999：Zhangeta1．，1998；Pirzadeheta1．，1997；Ostrowski，2002)；GP5在诱发T细胞的增殖应答方面也很重要(BautismE．M．etal．1997)；GP5又是PRRSV变异较大的蛋白，对PRRSV持续性感染和PRRSV变异机理的认识仅建立在核酸和蛋白质一级结构的基础上；GP5诱导细胞凋亡的活性(Suarczeta／．，1996；Labarqueeta1．，2001：Nauwyncketa1．，1999：SuretaL，1998：FemanderzetaL，2002)，可能也是PRRSV引起免疫抑制和持续性感染的原因之一。N蛋白作为PRRSV的主要结构蛋白之一．具有复杂的功能。作为PRRSV分型的基础，N蛋白参与病毒核衣壳的形成，N蛋白上具有重要的功能域NLS、NES，参与病毒增殖的调节(Wotton，2003；Dongwan。2003：XuD．，1997)；N蛋白的抗原表位主要位于中间区域，并且N蛋白的完整性对维持其抗原性至关重要，少量删除N蛋白的C端氨基酸残基将破坏N蛋白的构象(YangL．，1999：Wotton，2001)。蛋白质是发挥生物学活性的直接物质，对PRRSV主要病毒蛋白结构的研究，将有助于认识PRRS复杂的致病与免疫机制，为有效防制该病提供依据。本研究通过对重组GP5、N蛋白的圆二色谱(cD)分析，结合结构预测、蛋白结构的同源模建等方法，解析了PRRSVBJ．4N、GP5蛋白的二级结构，从结构生物学的角度分析了它们的生物学功能。 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析4．2材料与方法4．2．1纯化的重组蛋白P28-N，GST-N切割下的单体N’，GST-dEM，GST-dE，P32-dEM纯化蛋白(见第一、二章)。4．2．2仪器与层析介质JascoJ715型圆二色谱仪，日本产；Milliporell超滤器Cenlricon10，Millipore产品。4．2．3重组蛋白的CD分析应用JaseoJ715光谱仪在250C恒温下记录测定数据，比色杯光径为0．1em，钡9定190--250m范围的光谱值，所有cD光谱用平均残基椭圆度【O】m糠示，单位为度-厘米2份摩尔(deg．cm2-dmol‘1)。通过单值法计算平均残基椭圆度计算Ⅱ螺旋含量(j，)。儿躲芸，p瓿=岛·铬’M，。丽M’0x：CD棵馓’；Cw：蛋白浓度(mg／mL)；f：样品杯光径(dln)：pJ臻Ⅳ：平均残基椭圆度；MR∥：平均残基分子量；^彳：分子量(M／L)。4．2．4N蛋白结构分析4．2．4．1重组蛋白P28-N的二级结构预测应用EXPASY服务器(htlp：／／www．expasy．eh／tools／)上的SOPMA方法(Ocourjon与Delete．1987)预测P28-N重组蛋白的二级结构。4．2．4．2N蛋自C端结构域的空间结构模拟以PDB中已解析的PRRSVVR2332N蛋白57aa～123aa的三维结晶结构为模板(．DoanD．2003)，利用http：／／www．expasy．org／swissmod／SWISS-MODEL．hmaL同源模建PRRSVBJ-4毒相应区段的三维结构，应用spdbv，Rasm01分析软件绘制其结构图·4．2．4．3PRRSVBJ-4N蛋白2D结构的分析根据CD检测结果，计算融合蛋白P28-N的二级结构组成；结合Do锄D．等(2003)解析的Pm璁VVR2332缺失N端57个氨基酸的N蛋白的结构信息，对融合蛋白P28-N结构预测结果加以校正，确 ——三堕农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析定N蛋白的二级结构组成。4．2．5GP5蛋白的结构分析4．2．5．1各重组蛋白二级结构预测分别应用ExPASY服务器(http：／／www．expasy．eh／tools／)上的soPMA方法(Geourjon-与Deleage，1987)、GOR(Gamieretal．，1996)、nnPredict(UniversitsofCaliforniaatSanFrancisco(UCSF)HNN饵ierarchiealNeuralNetworkmethod，Guernlcur,1997)预测各重组蛋白的二级结构。4．2．5．2GST融合肽与蛋白质结构数据库(PDB)中同源蛋白结构的比较通过在http：／／en．expasy．org／tools／#secondary／Gen03d查找与目的蛋白序列相似的模板(PDB中已有其结构)，选定模板，在www．rcsb．o啊pdb查找相应序列的二级结构；将该结构与GST预测结构相比较。4．2．5．3PRRSVBJ-4GP5蛋白2D结构的分析比较多种预测方法，确定共同保守域的二级结构；应用PDB中己解析的部分GST序列结构信息校正融合分子的结构，结合圆二色谱检测的结果进一步确定GP5的结构组成。4．3结果与分析4．3．1重组N蛋白的2D结构解析4．3．1．1重组蛋白P28-N的CD测定对纯化的可溶性重组蛋白P28-N经圆二色谱测定(图4．1)，从图中可以看出在208nm和220nm附近为最小值，这是典型的Ⅱ螺旋结构。应用CONTIN程序(yang．jsr数据库，Dr．J．T．Yaag，1986)，分析表明，重组蛋白P28-N中螺旋占26．1％(41个氨基酸)，折叠占23．7％，转角19．8％，蜷曲占30．3％。N蛋白单体(N’)中的CD结构中，208nm没有形成明显的最小值，估计与N蛋白不稳定，部分发生降解有关，其结果估算的a螺旋约占30．1％(39aa)。 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析图4—1纯化P28-N与N’单体蛋白的cD光谱Fig．4—1CDspectraofthepurifiedP28一N＆N’protein4．3．1．2P28．N蛋白的结构预测应用SPOMA分析P28．N蛋白的结构(图3．2)，表明其中a螺旋约为19．11％(tip30个氨基酸)，B转角占10．19％(16个氨基酸)，延伸链14．65％(约23个氨基酸)，无规则蜷曲占56．05％(约88个氨基酸)。RGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLccccttcccccccccccccccccccchhhhccccchhhhhhhhhhhhtttccceeecttcceeeeeeeecPTHHTVRLIRVTASPSACCCCCeeeeeeeCCCCC图4-2P28-N二级结构预测结果Fi94—2PredictionofthesecondarystlI咖rcofthePET28-N注：t转角；hd螺旋；c延伸链；c随机蜷曲。Note：t，Bturn；h，Ⅱhelices；e,p—strands；c，randomCoils4．3．1．3PRRSVBJ．4N蛋白C端域三级结构的同源模建根据DoanD(2003)解析的PRRsVVR2332毒株缺失N端57个氨基酸N蛋白(Nd57)的三级结构以及蛋白质结构的同源模建原理，绘制了脚-4N蛋白c端相应域的3D结构(见图4·3)及其同源二聚体的三维结构(1虱44)。!}i一_{E口Hg才，nao巨 圈4-3Nd57蛋白单体三维结构丝带图(缺失前57个氨基酸的N蛋白结构，分别用rpdbv与rasmol软件绘制)Fig4-3RibbondiagramoftheNd57structure注：t蓝色表示碱性氨基酸：红色表示酸性氪基酸．黄色表示极性氨基酸；灰色代表非极性氨基酸；b．红、黄、蓝、灰色分别表示n螺旋、B链、p转角和无规则蜷蓝。Note：I：msic，acidic，polar,and∞np0船甜订J∞acidIsindicatedbyblue,red,)ellowandgraycoloor,respeotively；b，dhelioes,p-strands，p—tuna，randomcoilisindicatedHred，”IIow,blueandgraycolour，mpcc“veb图4-4Nd57蛋白二聚体结构图(RasmoI软件绘制)注；≈分子表血圈(蓝色表示碱性氢基酸；红色表示酸性氨基酸，黄色表示极性氨基酸：衷色代表非极性氨基酸kh，三维卡通囤(不同颜色分别表币不同的结构)Fig．4-4CartoondiagramoftheNd57dimerstructurebyhomologymodelingNote：a，Moiecidarsurfacediagram，basic,acidie,polar,andnonpolaraminoacidisindicatedbyblue，red．yellowandgraycolour,respectivelyb，three-dimentinalcartoondiagram，differentstructureisindicatedindifferentcolour从同源二聚体的结构来看，每个N蛋nc端两条D链在较长n螺旋的同一侧形成反平行的p链N蛋白_二聚体通过4个B链形成扁平的反相p层，两个较短的u螺旋则分别位于p层的两侧。 4．3．1．4PRRSVBJ．4N蛋白2D结构的分析DoanD等(2003)解析了PRRSVVR2332毒株缺失N端57个氨基酸N蛋白的三级结构，其中d螺旋所占氨基酸为26个。结合SPOMA二级结构的预测结果绘制出PRRSVBJ_4N蛋白的二级结构图(舢5)。其中N蛋自a螺旋所占氨基酸约为40个，这与我们对P28-N的CD测定结果(a螺旋为41个氨基酸)基本一致。图4-5PRRSVBJ-4与VR2332、Lv株N蛋白氯基酸序列及二级结构比较注：“黼”and“口’’分别表示完全保守或部分保守的氨基酸；oa眦表示q螺旋；p表示p链；T表示B转角Fig．4-5Secondarys扎cmmandsequencealignmentofthePRRSVNproteinofBJ-4，VR2332andLVstrainsNoto：“嚣蠢”and‘口’indicatethecomplemlyconservedandpartiallyconservedresidues，andsecondarystnlctUreelementsarc唧rcsentedbyspirals(ahelices),allOWS(pstrands)，T(Bturn)，respectively．4．3．2重组GP5蛋白的2D结构解析4．3．2．1重组蛋白GST-dE，GST-dEM二级结构预测分别应用EXPASY服务器(http：／／www．expasy．ch／tools／)上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN(HierarchicalNeuralNetworkmethod，Guermeur,1997)预测重组蛋白GSTME，GSTIdEM、GST的二级结构，结果见图4-6，4-7，4-8。 图4-6GST—dE蛋白的二级结构预测注：SOI叫A，GOR．FINN，nnPredict分别为不同的预测方法；t．转角：ha螺旋：e，B延伸链；c．随机蜷曲：一．末预测结构；为dE蛋白 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析图4-7GST—dEM蛋白的二级结构预测注：L转角：h,H，q螺旋；E,e，P延伸链；c，随机蜷曲i一，末预测结构：口为加入的连接肽f为dEM蛋白：SOPMA，GOR，tiNN，nnpredict分*Ⅱ为不同的预测方法Fig．4—7SecondarystructurepredictionofGST-dEMproteinumngthestnJcturepredictionmethodsavailableattheEXPASYserver．Note-SOPMA．COP,,HNN．nnPmdictmdicateddifferentstueturepredicationmetllods；t，Btum，h，ct-hdic8；tB‘strands；c，iⅧdomcoils；、nonpredieatedstructure；“誊⋯，dEMprotein从预测结果看，几种方法对跨膜区的预测相对稳定，该区域含有多处保守的p链和n螺旋a4．32．2GST融合肽与蛋白质结构数据库(PDB)中同源蛋白结构的比较在http：／／cn．expasy．org／tools／#secondary／Gen03d查找GST(6P-I)的同源序列的，选定GST相似模板188X：A和1BG5(TangL，1998；ZhangZ．，1998)，在www．rcsb．org／pdb查找相应序列的二级结构；将该结构与GST预测结构相比较。结果见图4-8。根据PDB数据库中GST结构 可知，参与重组蛋白GST-dE，GST-dEM融合分子GST(221aa)中的n螺旋、B链、无规则蜷曲分别为105，11，105个氢基酸。图4-86ST蛋白的二级结构预测及与相关PDB测定结构的比较注：t，转角；h、H，a螺旋：E、e，口延伸链；c，S，随机蜷曲；一，未预测结构：B，单个的B转桥残基；G㈣3螺旋，T，氢键转角：SOPMA、GOR、HNN、nnprcdict分别为不同的预测方往；1BG5、1B$X：A为PDB中解析的GST结构。Fig4—8SecondarystructurecomparisonbetweenpredicatedGSTstructure＆structureinPDBNote：t,B，T，I{-tum，h，a-helices；e,B-strands；c，randomcoils；一，nonpredicmedstructure；SOPMA，GORHNN，nnPredictindicateddiftcrentstucturepredicationmethods；lBG5，IBSX：A，aGST-like3DstructurefromPDB；GⅢ3-helix 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析43．2．3GST-dEMCD测定结果对纯化的可溶性重组蛋白GsT-dEM经劂二色谱测定(图3—9)，从图中可以看出在209nm和222nm附近为最小值，具有典型的Ⅱ螺旋结构。应用Dr，J．T．Yang的解析软件(yang．jsr)分析表明，重组蛋白GST_dEM含有44％055aa)的a@N，14．4％的p链(约50aa)。GST-dE，P32-dEM的cD测定结果见国4．10，4-11。围4-9GST—dEM纯化蛋白的CD光谱Fig．4-9CDspectraofthepurifiedGST-dEMprotein围4-10GST-dE纯化蛋白的cD光谱Fig，4-10CDspectraofthepurifiedGST-dEprotein囤4-11P32一dEM纯化蛋白的cD光谱Fig4．IICDspectraofthepurifiedPET·dEMprolein6 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP51R!tl的结构与功能分析4_3．2．4PRRSVBJ一4GP5蛋白的2D结构分析蛋白质结构预测中通常包括结构保守性分析、序列对比、主链和侧链结构预测。廊用PDB中已解析的部分GST序列结构信息校正融合分子的结构，比较多种预测方法，确定共同保守域的二级结构，结合圆二色谱二级结构的检测结果，进一步绘a蛐PRRSVBJ-4GP5蛋白的二级结构图(图3·11)。其qTGP5蛋白n螺旋约58个氮基酸，B链约56个氨基酸，T转角14个，其它为无规则蜷曲。这与我们对GST-dEM的CD测定结果基本一致(Ⅱ螺旋比测定少约5个氨基酸，误差约3．3％)。al咀旧BIa4叩Ⅱ口。唧口∞a∞o口o∞a—’TTa口a口∞lMLEKCLTAGCCSQLLSLWCIVPFCFAALANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKF¨肚心酆睥砸∞oaa——————————————+Ii∞oGo——————+1J—}11—H，口叩口aaoaa∞口u61DWAV溺缫缫糕麟黝麟鳓麟叮a8胪B6B7B8晒曼孵=∞o丁T∞4∞o——_÷—叶———÷TT—斗唧∞叫121TCFVIRFAKNCMSWRYACTRYTNFLLDTKGGLYRWRSPVIIEKRGKVEVEGHLIDLKRVVB9TT——_181LDGSVATPITRVSAEQWGRP图4-12PRRSVBJ_4GP5蛋白二级结构图注：“；|溺”表永跨膜氨基酸残基；oaan表示q螺旋：8表示B链；T囊示B转角Fig．4·12SecondarystructureofthePRRSVGP5proteinofBJ·4“^”andindicatethetransmcmbraneeresidues,andsecondarystrictureelementsa”representedbyspimls((xhelices)．arrows(13strands)，T(Bturn)，respectively．从GP5的二级结构可以看出，GP5具有丰富的B链结构，按照蛋自的结构分类，属于典型的p型结构(Bg仃ucture)。许多球形病毒的外膜蛋白都具有这种p型结构(王大成，2002)。有规律的二级结构和内埋部分可作为保守性的判据。蛋白质的疏水性内核保守性比亲水表面高，一般有有序的二级结构单元(如Ⅱ螺旋和B折叠)构成，表面主要为转角和无规部分(王人成，2002)。从GP5的二级结构图可以看出，GP560aa～120aa的跨膜区富含a螺旋和B链，具有强的疏水性和稳定保守的结构，这与其跨膜功能密切相关，符合跨膜蛋白的结构特点(高镜岩，2002；BenjaminL．2000)。GP5C端145aa～170aa间后含有较多的B链，理论上极易形成p层，否则很难维持其结构的稳定性(王大成，2002)，形成的B层能进一步影响GP5的结构。而180aa-200aaⅢ1]含有多个无规则蜷曲，易于形成抗原表位。这种结构特点与其功能(Dea2000；Rodriguez，2001)相一致。研究表明，C端在维持GP5结构稳定和抗原性上具有重要作用，缺失C端50aa的表达蛋白．将失去与PRRSV感染猪血清的反应性(Deaetal．，2000)，130aa～170aa与自然感染猪阳性血清反应性差，而170aa～201aa与PRRSV阳性血清具存很好的反应性，并认为最后11氨基酸残基(190aa～201aa)暴露于病毒表面，易于与抗体作用(Rodriguezeta1．，2001)。 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分折4．4讨论4．4．1关于蛋白质结构的预测及蛋白的二级结构的CD测定对蛋白结构的认识，主要通过晶体的X-ray测定、NMR法解析。由蛋白质的氨基酸序列预测分子的三维结构是一大挑战。目前预测蛋白质结构的方法可分成有同源仿真法(HomologyModeling)、折叠识别(FoldingRecogifion)、重头起算法口Bim．fio)。基于资料库提供的序列、理化学原理基础上的检测以及对蛋白质折叠认识基础上衍生的threadingmethod和同源模建(homologymodeling)法，也可以来预测蛋El结构。同源模建法是根据同源蛋El质三级结构的保守性太于蛋白质序列的理论，进行蛋白结构模拟。一般地，蛋白质序列上的稍微改变其三级结构改变很小，在蛋白序列一致性(identity)大于30％的前提下，一个未知蛋白的结构可以利用一个或多个与其结构相关的蛋白来建立。在目前生物化学研究领域，同源模建法所扮演的角色越来越重要，经由同源模建法可以快速、有效地获得蛋白的三维结构，以进一步了解蛋白的功能。’蛋白质二级结构预铡是蛋白质折叠的主要研究内容，也是获取新氨基酸序列结构信息的～般方法(王大成，2002)。预测二级结构的方法可分为统计方法(stafisticalmethod：如Chou-Fasman法、GOR法、神经网络方法等)、基于已有知识的预测方法(knowledge-basedmethod；如Lim法，Cohen法等)和混合方法。常用PHD、SOPMA、nnlPredict等方法柬预测靶蛋白的二级结构，最好是以三种以上方法柬预测，然后综合分析得到可信度较高的二级结构。伸展的O链单链原子闻没有相互作用，其构像是不稳定的，只有当一股B链与另一股p链主链以间以轻键相连。结合在B层时，它们才能稳定，因此蛋白结构中出现p链都是以p层方式存在，一般包含5—10个氨基酸(王大成，2002)。Ⅱ螺旋和D折叠在一定程度上可以互补。所产生的多重序列结构排列中的结构保守区(SCR，structureconservedregion)及结构变异区(SVR，structurevariableregion)，通常结构保守区位于n螺旋和B链，而结构变异区通常出现在蜷曲或环状区段。环状区段易暴露在蛋白表面，亦决定着活性或结台部位等功能的专一性。圆二色谱是一种利用不对称性生物分子在圆偏振光下具有不同的吸收、产生椭圆偏振光的光学效应来分析溶液中蛋El_-级结构的技术。通过定量蛋白质中不同二级结构的摩尔椭圆率来计算n螺旋、B折叠和无规则蜷曲的含量(NormaJ．Q，1999；王镜岩，2002)。CD分析要求在不影响蛋白信号产生的合适缓冲溶液(如不能含有咪唑，因为咪唑在220nm内可产生杂信号)；产生光谱的蛋白是高纯度的，不含核酸、杂蛋白；蛋El浓度为O．1~o．5mg／mL：尽可能减少金属稳定荆，在蛋白稳定情况下，缓冲液浓度最好低于5mmol／L(如应用lmm光程的比色杯，在含有l～2mmol／LEDTA或1～2ramoflDTT的生理缓冲液即可)。在200nm～240nm范围内的数据对蛋白质构象的估算有效(赵南明，2000；NormaJ．G，1996=王云峰，2004)。应用CD进行蛋白二级结构的测定，要求所测定的蛋El具有结构和水溶液中的稳定性，易降解、水溶液中不稳定的蛋El不适于进行结构分析。本研究通过采用不同的融合策略和防止蛋白降解的综合性措施，克服了结构和溶液中不稳定蛋白难于进行结构分析等技术瓶颈，获得了易纯化、相对稳定的、可用于结构分析的重组蛋白。重组蛋白P28-N的稳定性明显优于从GST-N 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析融合蛋白切割获得的单体N7蛋白，更适合于进行CD分析：重组蛋白的稳定性、可溶性、表达量与其编码基因密切相关，疏水性的跨膜序列，严重影响蛋白表达量及可溶性。对GP5的表达，我们通过选用与亲水性强的GST融合表达、缺失严重影响表达量与溶液中稳定性的跨膜区序列，获得了适于进行CD分析的重组蛋白。本研究应用多种预测方法比较确定公共保守的二级结构，应用PDB中己解析的部分GST]事列结构信息校正融合分子的结构，结合圆二色谱检测的结果进一步确定GP5的结构组成，从而提高了结果的可信度。对N蛋白的结构分析，通过应用CD分析融合蛋P28-N的结构组成，参考已解析的部分N蛋白二级结构信息，对融合蛋flP'2S-N结构预测结果加以校正，确定了其二级结构组成。4．4．2PRRSVN蛋白结构与功能的分析已有大量莱于N蛋白表达和功能的研究报道，鉴定了N蛋白部分重要的功能区域，如NLS序列(AlanjC．，2001；Raymond，2003；Wotton，2003；Dongwanelal,，2003)、主要抗原表位(Meulenberg．1998；Rodfiguez,1997：Wootton，1998；Casal，1998)、潜在的病毒RNA结合域(Woottanelal．，2003)等。为研究N蛋白功能与结构的关系。需要较多的纯化N蛋白。然而，由于GST-N在表达和纯化过程中极易降解，很难从重组GST-N蛋白获得大量稳定的、理想的天然N‘蛋白；经加入蛋白酶抑制削后GST-N蛋白的降解明显改善，大约1000mL诱导苗可获得1mg的GST-N蛋白。但N’蛋白单体本身也存在不同程度的降解，用单体N’蛋白进行CD测定，发现208nm的吸收值不是最小，可能与N’蛋白不稳定、易降解产生的小肽影响了CD光谱有关。医此对其测定结果仅作参考，没有用于结{哿的分析。P28-N具有捃对的稳定性，因此应用其进行CD分析。N蛋白是PRRSV功能最为复杂的蛋白。前期的研究表明，N蛋白上至少有7个抗原决定簇。是PRRS病毒粒子中含量最多的结构蛋白，约占病毒粒子的40％．是形成病毒核衣壳的基础，也是免疫原性最强的蛋白。PRRSV感染猪体后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是针对N蛋白。N蛋白的功能与其结构密切相关。对重组N蛋白的二级结构分析表明，PRRSVN蛋白中q螺旋约为40个氨基酸，占整个N蛋白的26％，含有多处B转角。N蛋臼可形成同源二聚体，根据Doan等(2003)的结果，经同源模建绘制了BJ-．4N蛋白C端序列的3D结构图。核衣壳的组装形式N蛋白在同型毒株之间相对保守，N蛋白单体及二聚体结构与其功能密切相关。研究推测N蛋白可能形戒20．--30lllrl的二十面体的核衣壳核心，其外面包裹～层包含病毒膜蛋白，形成球形的约60nm的病毒粒子。与其它囊膜,RNA病毒相似区域的比较发现，含有123个氨基酸的N蛋白的N端(34,--51位氨基酸残基的碱性区域)富含Lys、Gin和Ash，可能与病毒RNA的结合有关(Woottcn甜a1．，2003)。N蛋白通过31—37aa间的非共价结合、23位c通过二硫键的共价结合形成规则有序的同源二聚体(RaymondR，R．，2003)。每-'i-N蛋tic端pl、胆在较长Ⅱ3螺旋的同一侧形成反平行的D链，N蛋白二聚体通过4个瞄形成扁平的反相聊罢．两个较短的的02、o,4螺旋则分别位于B层的两侧，这样，N蛋白通过同源二聚体p折叠层形成衣壳内表面．N蛋白N端则为病毒RNA结合域。位于农壳内侧，从而形成蛋白衣壳的骨架。这样形成的N蛋白二聚体也使两个邻体上51aa,-67aa，80aa,--90aa,f立的氨基酸残基更加接近，从而形成N蛋白的构像型表位，而且这64 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析个表位在欧美毒株间相对保守(MeulenbergetaL，19981caSa|1998)。C端形成蛋白的壳形域，与衣壳的形成与稳定有关，c端11个氮基酸残基对衣壳的形成起重要作用(Wootteneta1．．2003)。N蛋白的优势表位已有大量N蛋白单抗的报道，但大多数单抗识别N蛋白中心区域52--69aa之间的序列(Rodriguez1997：Wotton1998)。对BJ．4N蛋白的结构分析表明，该区域在PRRSV间相对保守，折叠后形成蜷曲环状域，主要暴露于表面，从而形成主要的抗原表位。体内实验表明，PRRSVN蛋白的羧基端11个氨基酸残基对维持C一端依赖表位的B构象起到至关重要的作用，因为在竞争酶联免疫试验中针对构象型表位的单克隆抗体是唯一可以与PRRSV阳性血清竞争的单抗(Rodriguezeta1．，1997；SarahWooUon，etaL，2001；Meulenberg，1998：Wootton，1998；Wootton，2001)。因此，在自然宿主体内，羧基端依赖的单抗在PRRSVN蛋白的单抗中占绝对优势。N蛋白的单克隆抗体大多是构象型抗原表位，这些抗原表位特性的维持与N蛋白的折叠密切相关。一般地，很难制备获得识别N蛋白N端30个氨基酸的单抗(Wootton，1998)，缺乏抗原性表明包含NLS一1的N端区域通常隐藏在蛋白内部；NLS．1缺乏抗原性也可能与N蛋白形成寡聚体有关。寡聚体的形成可封闭NLS-I而不影响NLS．2的易接近性(Raymond，2003)。N蛋白单体上蜷曲与转角区域具有较强抗原性，N蛋白同源二聚体的形成使部分表位被封闭，同时也出现部分构象性表位，N蛋白的结构与其功能密切相关。功能域及其结构许多输出蛋白质都有相同类型的信号，这些信号对于蛋白质从核内转运到胞质是必要的也是足够的。它被称为核输出信号(Nuclearexportsignal，NES)，一般含约10个氨基酸。不同蛋白质NES的唯一相同特点是具有保守的亮氨酸(BenjaminL．。2000)。一种蛋白质可能既有NLS序列又有NES序列，前者负责它的核输入，而后者负责它的输出。一些既能在胞质中又能在核内结合poly(A)+RNA的蛋白质具有这样的特点(BenjaminL．，2000)。PRRSV的N蛋白具有这种特点(Woaon，2003；Raymond，2003)。N蛋白上包含一潜在的核定位信号NLS—l(10aa～13aa)、一个功能性的NLS-2(41aa---47aa)、一个核仁定位信号序列NoLS(4laa-72aa)、一个可能的核输出信号基元(NES．106aa～l17aa)。在病毒复制过程中，N蛋白上的核仁定位信号使N蛋白出现在细胞核内，调节核内的加工，N蛋白上的核仁定位信号、核输出信号序列等，则涉及N蛋白从核膜内外的穿梭转运(Raymond，2003)。BJ-4的N蛋白含有潜在的核定位信号NLS．1(10aa-13aa)、NLS．2(41aa,--47aa)。一个核仁定位信号序列NoLS(41aa～72aa)及一个潜在的NES(106aa～117aa)。NLS位于富含碱性氨基酸的亲水区域，并位于已暴露的无规则蜷曲处，可能利于其与其它转运分子的作用(AlanJC．．2001：Raymond，2003；Woaon，2003；Dongwanela／．，2003)。应用GST-Npull-down分析表明N蛋白可与感染细胞的核输入子(importin‰importin-B，nueleolin等)结合(Wotton，2003；Dongwan，2003)，而且这种结合不依赖于其它蛋白的参与。通过形成N-输入子(importin)复合体使N蛋白穿膜并定位于核或核仁。BJ-4N蛋白106aa～117aa的NES基元TVRLIR，位于q螺旋区，这样可以形成螺旋内疏水、亲水的外表面。该序列可与CRMl蛋白作用，使N蛋白通过核膜从核内向胞浆转运(Raymond，2003)。从以上的分析表明，N蛋白3个a螺旋区及B链对N蛋白衣壳的形成与结构起重要作用，其它蜷曲结构则与其抗原性、N蛋白的转运等功能密切相关。单体结构的解析有助于对N蛋白的参与病毒核衣壳的形成、NLS穿梭运转功能及其线性表位的认识，N蛋白二聚体3D结构的 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析分析，对分析PRRSV核衣壳的组装形成及二聚体导致新构象表位的产生有指导意义。4．4．3PRRSVGP5蛋白结构与功能分析由于表达获得的GST-dE。GST-dEM，P32-dEM蛋白均为包涵体，只有对其进行很好的复性，才能用于CD分析。通过圆二色谱光谱检测．与GST的亲合性能及免疫学方法检测了复性效果。结果表明，GST-dEM蛋白在几方面的性能均优于GST-dE蛋白。未缺失跨膜域的GST-dE蛋白含有较多的疏水氨基酸，在水溶液中的稳定性差，易聚集形成沉淀，亲合纯化效果差，复性效果差；变性复性的GST-dEM蛋白具有良好的免疫原性及与GST亲台基质结合的能力。纯化蛋白的亲水性增强，在溶液中的稳定性较好，适合于进行CD分析。对纯化的GSTMEM，P32-dEM蛋白CD的分析，均获得了理想的结果。但基于缺乏对P32．dEMN端融合肽二级结构的了解，没有应用其进行GP5蛋白结构的分析。由于GST-dE蛋白含有较多的疏水性氨基酸，复性蛋白在水溶液中很不稳定，极易发生聚集、沉淀，这也与GST-dE蛋白的不完全复性有关。不完全复性。导致蛋白疏水区外露，溶解度降低，分子聚集而沉淀(王镜岩，2002)。对GSTME蛋白的CD测定结果也不够理想，在202rim以内的吸收很不稳定，因此，本研究没有采用GST-dE的CD测定结果。但由于几种二级结构预测方法对跨膜区的预测相对保守，对跨膜区结构的解析采用了生物信息学预溅结果。通过对GST融合肽结构的同源模拟、跨膜域的预测及其对GST-dEM的CD测定结果，绘制出PRRSVBJ-4GP5的二级结构图。结果表明，BJ-4GP5含有n螺旋约58个氨基酸，B链约56个氮基酸，T转角14个，其它为无规则蜷曲。按照蛋白的结构分类，属于典型的0型结构(Bstructure)。c端对维持GP5抗甄性的重要性应忍ORF5缺失突变、GP5亲水区多肽合成与不同单抗的作用的鉴定表明，GP5上胞外区27aa～41aa、C端(180aa～197ea)位存在2个优势表位，缺失C端50个氨基酸的表达蛋白与感染猪血清的反应性消失t表明C端有较强的抗原性或其在维持GP5结构上有重要作用(Dea，2000)。Rodriguezetal(2001)通过伟9备重组蛋白的单抗表明，GP5上存在2个线性表位(130彻～170aa’170龋~201曲)。130aa～lT0aa与自然感染猪阳性血清反应性差，而170aa～201aa与PRRSV阳性血清具有很好的反应性，并认为最后11氨基酸残基(190aa～201aa)暴露于病毒表面，易于与抗体作用，但该表位没有中和活性。由于晟后25个氨基酸在欧美毒株间高度保守，可作为诊断工具。从GP5C端的结构可以看出，150aa～170aa之间形成连续的13链，理论上极易形成B层(王大成，2002)，而170aa后的蛋白则具有多处无规则蜷曲。具有相对的灵活性，推测170aa后的区域可以“包裹”式地稳定B层结构·从而维持GP5蛋白的结构。GP5的诱变表位研究表明，表位的化学组成或结构是影响免瘦决定簇的重要参数(Nakray．，2000)。抗原的分子构象发生的细微变化，就可能导致其抗原性发生明显变化。易接近性则指的是抗原分子表面的特殊化学集团与淋巴细胞表面的抗原受体相互接触的难易程度。位于表面的决定簇(即功能性决定簇)易于被相应的淋巴细胞所识别，具有易接近性，可直接启动免疫应答。对GP5可近性的分析表明，27aa～33aa具有强的可近性，而相应的37aa～45aa则很弱。研究表明PRRSVGP5蛋白27aa～30aa表位具有诱变表位(decoycpitope)的特征(感染后强的免疫原性；多变性)(Oarrity，1997)。可以诱变免疫反应远离具有中和活性的37aa～ 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、GP5蛋白的结构与功能分析45aa表位。因此。27aa～30aa表位的抗体在感染早期(1周)即可检测到(Ostrowskietal．，2002：Locmba，1996)，而中和表位37～45aa的抗体在感染后3周才可检测到，而且两个表位的抗体呈负相关。Ostrowski等(2002)认为，H”和145Y“N45构成37aa～45aa表位的主要识别位点。这些区域在PRRSV分离株中较保守，表明这种区域结构的稳定性在维持表位识别上具有重要作用。对GP5的二级结构分析表明，37aa“6aaa为结构稳定的“B混合体，27aa～30aa及其紧跟37aa--46aa后的氨基酸可形成一不规则蜷曲，具有较强的易变性，推测该区域在空间上可引起37aa～46aa表位的空间屏蔽。这可能是中和抗体产生较晚的结构原因。GP5的变异及其对结构的影响GP5是PRRSV最易发生变异的结构蛋白，其变异表现在遗传(基因水平)和结构(蛋白质水平)上。ORF5可通过随机突变、基因重组((Kaputetel．，1996：Yuaneta1．，1999：Meng，2000：Murtaughela1．，2001；Yooneta1．，200l；vailVugtJJ．，2001)和准种的产生(Rowlandetal．，1999；TonyL．G．，2003；ReneeL．，2003)等发生基因改变。前期对300多株PRRsW毒毒ORF5的变异分析表明(AndreyevV．G．，1997：s．Deaetal，2000)，GP5存在4个保守区40犷57aa，67aa～90aa，107aa～120aa，129aa～150aa；高变匿域主要出现在信号肽序列(1aa～31aa)和胞膜外域2个高变区(32∞～35柏与57a“1雅)。30aa～37aa是GP5蛋白第1个糖基化位点，又是极易变异的中和位点，其中和活性因毒株而异(Rodriguezetal．，2001：OsWowsHetaL，2002；Tonyet口f'2003：ReneeetaL，2003)，从结构上看，该位点处于无规则蜷曲处，易形成有差异的抗原表位。具有中和活性的37∞～53∞位富含亲水性氨基酸，该区段处于B链主区、两边为无规则蜷曲区域，可以形成优势表位。一般地，相对保守的区域都易形成较为稳定的ft．螺旋或p折叠，易变异的氨基酸则多出现于结构上相对灵活的无规则蜷曲处(BenjaminL．，2000)，这种结构特性有利于病毒功能的维持与延续。从BJ-4GP5蛋白的结构可以看出，GP5的三次跨膜区域均具有稳定的二级结构，其68aa～77aa、91aa一96∞形成稳定的B链、108aa～120aa为显著的n螺旋区域，符合跨膜区多为n螺旋或B链组成的特点(高镜岩，2002)。遗憾的是，从结构上分析，作为GP5比较保守的跨膜区、129aa～150aa区域，虽然也可形成相对保守的结构，但却不能形成优势表位原性，易变异的区域却具有相对多变的结构，这可能也是PRRSV难以防制的原因之一。根据以上的分析，BJ-4GP5级结构，可为PRRSVGP5的变异、免疫原性等功能的分析提供部分结构依据，但对GP5与M蛋白异聚体的结构关系、GP5诱导细胞凋亡等功能等的认识，尚有依赖于对GP5及其相应配体蛋白等3D结构的解析。4．5小结4．5．1应用圆二色谱(CD)进行了重组蛋白P28-N、N’蛋白，GST-dE、GST-dEM、P32-dEM的测定，获得了相应的二级结构信息；进一步通过生物信息学预测，结合已解析的部分同源蛋白结构的比较，绘制出PRRSVBJ-4主要结构蛋白GP5、N的二级结构图·4．5．2N蛋白二级结构的分析，有助于对N蛋白复杂功能的阐释。N蛋白单体二级结构的解析有助于对N蛋白的参与病毒复制、N蛋白重要功能域(NLS，NES的穿梭运转功能)、线性表位的形成等功能的认识，N蛋白二聚体3D结构的分析。对分析PRRSV核衣壳的组装形成，认识 中国农业大学博士论文第四章PRRSVN、6P5置白的结构与功能分析二聚体形成的构象表位有指导意义。4．5．3GP5蛋自二级结构的解析．有助于对GP5功能的分析。根据绘制的BJ一5GP5的二级结构。可以较好地解释PRRSVGP5变异、GP5诱变表位、GP5c端50个氨基酸在维持GP5抗原性等免疫现象。GP5具有表现出三次跨膜、抗原变异、出现诱变表位等功能的结构基础。4．5．4重组蛋白的稳定性、可溶性、表达量与其编码基因密切相关。疏水性的跨膜序列，严重影响蛋白表达量及可溶性。4．5．5通过对不同纯化蛋白CD波谱的分析认为．结构稳定(不易降解)、水溶液中的稳定性好的重组蛋白对获取理想的检测结果尤为重要。易降解、水溶液中不稳定的蛋白不适于进行结构分析。对结构稳定性差、易降解的蛋白可以通过融合表达和多种措施措施防止降解；对疏水性强钓蛋白可班遥过融合表达、巯水区基因缺失等途径加以改进。 中国农业大学博士论文第五章结论第五章结论5．1通过对蛋白的CD测定、生物信息学预测、结构的同源模建及蛋白质数据库(PDB)资料分析，在解析PRRSVBJ-4株N、GP5蛋白的二级结构的基础上，绘制出了BJ-4N、GP5蛋白的二级结构图。5．2根据GP5、N蛋白的二级结构，从结构生物学的角度阐释了PRRSVN、GP5蛋白的部分生物学功能，表明PRRSV的N、GP5蛋白参与病毒在细胞内的增殖与调节，PRRSV的变异、特殊的致病与免疫机制等功能与其结构密切相关。创新点1．以国内猪繁殖与呼吸综合征病毒(PlⅡ塔vBJ-4)为材料，分析了PRRSVN蛋白、GP5蛋白的二级结构，绘制出其二级结构图。2．从结构生物学的角度阐释了PRRSVN、GP5蛋白的部分生物学功能．为认识PRRSV在细胞内的增殖规律，变异、及其致病免疫机制提供了结构依据，丰富了对PRRSV致病及免疫机理的理解与认识。3．在技术上，通过采用不同的融合策略和防止蛋白降解的综合性措施，克服了结构和溶液中不稳定蛋白难于进行结构分析等技术瓶颈，获得了易纯化、相对稳定的、可用于结构分析的重组蛋白。 中国农业大学博士论文第六章文献综述6．1PRRSV结构蛋白N、GP5结构与功能研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus。PRRSV)可以感染任何年龄的猪，主幕引起怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状。1987年首发于美国。随后2～3年内迅速在欧洲广泛流行．以后蔓延至亚太地区，造成世界范围的大流行，绘世界养猪业造成巨大的经济损失。该病毒于1991年首先由荷兰分离获得Lelystad病毒(Lv)株(Wensvoort。1991；Albina，1997)，1992年美国也分离到VR2332毒株。PRRSV归属于套式病毒目动脉炎病毒科．是一种专嗜在巨噬细胞内生长的、有囊膜、单股正链RaNA病毒(Conzelmarm，1993)。病毒基因组垒长约15kb,包括9令开放阅读框(ORF)(FaabergKS，1995)，其中ORFla和ORFlb位于基因组的5’端，占据整个基因组的80％，编码RNA聚合酶和相关的蛋白酶，为非结构蛋白(NsPl甘4sPl2)。ORF2a--7位于基因组的3’端，其中ORF2--4分别编码GP2、GP3、GP4三种糖基化蛋白，ORF5--7分别编码囊膜蛋白GP5、基质蛋白M和核表壳蛋白N(Mur‰j曲甜at,1995：Suarezelal,1996：WuwH，el口‘2001；Meulenbergeta1．，1995：Dmwetal．，1995：Benfieldet81．'1992}BautistaelⅡ，，1996：Meulenberg，1996：Wieczorek-Krohmereta1．，1996：DeaS．，2000)。GP5、N作为PRRSV的主要结构蛋白，在病毒的复制与增殖、致病与免疫机理、遗传变异等方面有重要作用，因而成为研究的热点。目前对其的研究主要集中于功能与变异等方面的研究，对其结构的研究成为进一步了解其功能的必然选择。本文就GP5、N蛋白结构与功能方面的研究进展作以综述。6．1．1N蛋白的结构与功能6．1．1．1N蛋白的理化学特性PRRSV的N蛋白为不舍信号肽、非糖基化的蛋白，成熟的N蛋白在美渊型和欧洲型分别为123aa，128aa(Mardassietal，1996)，此差异是由于大最核苷酸的置换、插入和缺失造成的。N蛋白相对保守，美洲株间氨基酸的同源率为96％～100％，欧洲株间氨基酸同源率为94％～99％，欧洲型与美洲型间的同源性仅为63*．6，但在52aa～69aa间抗原性高度相似(Wottonctal．．1998：MeulenbergelaL，1998)。在病毒复制过程中，不论欧洲型或美洲型毒株，N蛋白均定位于肺泡巨噬细胞(PAMs)或MARC．145细胞的胞浆与核仁(Rowlandela1．，1999)。猪感染PRRSV后会产生很强的针对N蛋白的免疫应答，且持续时间长。N蛋白是一个等电点约10．4的碱性蛋白、具有强的免疫原性，在丝氮酸可发生磷酸化(Wootton，2002)：N蛋白转移到高尔基体(套式病毒的成熟位点)后，由23位的半胱氮酸通过二硫键形成同源二聚体并装配成核 中国农业大学博士论文第六章文献综述农壳(W00Uon，2003)。N蛋白是目前PRRSV研究中功能最为多样、复杂的蛋白之一。6．1．1．2N蛋白的功能域与生物学功能研究中发现，N蛋白出现在感染细胞核仁中的百分率与检测的时间相关，此外，N蛋白主要出现在围绕核仁的核浆区域，这表明N蛋白在核仁的定位是一个复杂而高度调节的过程。PRRSVN蛋白从胞浆进入核仁是NLS依赖性的(RaymondetaL，2003)。N蛋白可能参与病毒复制过程的调节。N蛋白上至少存在4个单独的功能区域(见圈6-1)，分别为核定位、核仁定位、核输出(NES)和胞浆保留域。其中包含一潜在的核定位信号NLS．1(10∞～13aa)、一个功能性的NLS-2(4l姗■7∞)，一个核仁定位信号序列NoLS(4laa岬2∞)，～个可能的核输出信号基元(NEs，106a扣117雒)。在病毒复隹4过程中，N蛋白上的核仁定位信号使N蛋白出现在细胞核内，调节核内的加工，N蛋白上的核仁定位信号、核输出信号序列等，则涉及N蛋白从核膜内外的穿梭转运。表明N蛋白在核一胞浆之问的穿梭是一个复杂的调节过程。图6-1PRRsvN蛋白的主要功能域示意图(引自Raymondk凡，2003)Fi粤6_1stm船卸d伍a曲naIdomainswiⅡIi王lPRRSVNproton通常的核定位信号(NLS)富含碱性氨基酸，可分为三型：Pal4型NLS由连续的4个碱性氨基酸或3个碱性氨基酸与脯氨酸、组氨酸组成；Pat'／型NLS由脯氨酸起始，由4分子氪基酸基序中含有3个碱性氨基酸插入的片段组成：3型NLS，即双分子基元(bipaftnem甜f)·由2个碱性氨基酸、10n间隔、5个中至少3个碱性氨基酸的插入片断组成衅icl【s1995)。应用POSRT程序预测表(Raymondeta1．，2003)，N蛋白上存在2个NLS基元，这两个基元高度亲水，易于接近穿梭蛋白并相互作用。NLS与病毒基因与相关蛋白在细胞内的迁移有关(Al缸J．C．，2001)。N蛋自进入细胞按依赖于N蛋白上的NLSPRRSVN蛋白上有2个NLS，这2个区域位于高度易接近性的区域。将EGFP与N蛋白或单纯的NLS-l，NLS-2序列融合表达后发现，融合的N-EGFP与单纯的EGFP相比，荧光分布发生了变化，核内荧光增强而核周围胞浆的荧光减弱，NLS．1，NLs_2对N蛋白进入核是必须的。应用NLs-1，NLs．2上R、K氨基酸点突变技术进一步证明NLs-2是天然N蛋白进入核仁的主要定位信号序列，43-KKNKK．47是萁核心序列；41aa～72aa多肽含有核仁定位信号(NoLS)。NLs．1在细胞核内的定位受N蛋白高级结构的影响改变N蛋白C端氨基酸或C端加入融合蛋白可导致N蛋白定位于核内的功能丧失，表明N蛋白C端氨基酸可显著影响N蛋白的构象。一方面可能是由于改变N蛋白C端。使N蛋白三级或四级结构发生变化，导致NLS被 中国农业大学博士论文第六章文献综述封闭；另外可能是由于NLS．1与穿梭蛋白受体域的结合受到影响，使N蛋白不能穿膜进入核内。这说明NLS．1的活性与N蛋白的高级结构密切相关。N蛋白可与细胞核膜上的穿梭蛋白结合应用GST-Np此l-down分析表明N蛋白可与感染细胞的核穿梭蛋白(importin％importin—B，nueleolin等)结合(WoRon，2003：DongwanY，2003)，而且这种结合不依赖于其它蛋白的参与。通过形成N-输入子(importin)复合体使N蛋白穿膜并定位于核或核仁。6．1．I．3N蛋白结构与免疫学功能N蛋白分子量为15kDa，N蛋白虽小，但其上至少有7个抗原决定簇，是PRRSV病毒粒子中含量最多的病毒结构蛋白，也是免疫原性最强的蛋白。N蛋白是体液免疫应答的主要抗原。是目前PRRS血清学诊断方法的抗原基础(Bautista,1993：Dea，2000b：Denac，1997)，也是PRRSV抗原分型和基因分型的主要依据。因此．可以用N蛋白单抗分离鉴别欧美毒株，用于抗原分型。PRRSV感染猪体后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是针对N蛋白。用PJlRsv纯化全病毒免疫小鼠产生的单抗大多数是抗N蛋白的(谷红等,2000：Magaret口f’1995)。L．Yang(1999)比较了67株美洲型分离株、2株疫苗毒和欧洲I．alysyad株N蛋白的变异情况，并应用24株单抗将这些毒株分为5个群，但在美洲株间．N蛋白C端(50aa～123aa)很保守，暗示其二级结构的稳定性。不同的研究者制各了多株N蛋白的单克隆抗体对N蛋白的抗原表位进行了研究，结果表明欧洲型分离株和美洲型分离株的N蛋白既有高度保守的抗原表位又有型特异性表位，型特异性位点的构象与其免疫原性有关(Nelson，1993；DrewetaL，1995；WieczorekK．M．，1996：Dea刮at，1996；Casaletal,1998；Meulenberg酣a／．，1998；WoRonetaL，1998；Yangeta1．，1999)。美洲型毒株N蛋白至少有5个抗原表位，四个是线性表位(30aa一52aa．37aa～52aa，69aa～112aa，112aa一123aa)，另一个是以52aa--69aa和112aa一123aa为中心的构象决定簇。N蛋白30aa～37aa(IAQQNQSR)也参与N蛋白二聚体的形成(Wootton，2003)，此区域具有较强的亲水性并形成SDOWl7单抗识别的部分构象性表位(Wootton，2001)。其中37aa-52aa线性表位在欧美毒株间高度保守，结构预测表明，该区域处于B转角与无规则蜷曲的区域．极易形成良好的抗原表位。而构象决定簇在欧美毒株间则是部分保守(Rudriguezetal，1997；Wononelal．。1998；YangetaL，1999；Wottonet口fI，2001)。欧洲型毒株N蛋白至少有4个抗原表位：三个线性(2aa～12aa,25aa～30aa,40aa--46aa)、一个构象决定簇(以51aa～67aa和80aa--90aa为中心)，其中25aa一30aa是欧美毒株高度保守的线性表位，构象决定簇在欧美毒株问也部分保守，另外2个(2aa一12aa,40aa,-46aa)为欧洲型特异性表位(Meulenberg“a／．，1998)。已有大量N蛋白单抗的报道，但大多数单抗识别N蛋白中心区域52．--69aa之间的序列(R．odriguez,MJ．，1997；WoRon,S．，1998)。结构分析表明该区域在PRRSV间相对保守，折叠后形成蜷曲环状域，主要暴露于表面，从而形成主要的抗原表位。N蛋白二聚体也使两个不同邻体上51aa,-67aa，80aa～90aa位的氮基酸残基更加接近，从而形成N蛋白的构象型表位(Meulenberg，1998)。一般地，很难制备获得识别N蛋白N端30个氨基酸的单抗(Wootton，1998)，缺乏抗原性表明包含NLS．1的N端区域通常隐藏在蛋白内部；NLS．1缺乏抗原性也可能与N蛋白形成寡聚体有关，寡聚体的形成可封闭NLS．1而不影响NLS一2的易接近性(Raymond，2003)。 中国农业大学博士论文第六章文献综述N蛋白单体上蜷曲与转角区域具有较强抗原性，N蛋白同源二聚体的形成使部分表位被封闭。同时也出现部分构象性表位，N蛋白的结构与其功能密切相关。6．1．1．4N蛋白的结构与功能分析N蛋白在PRRSV感染中具有双重作用，N蛋白在细胞浆中作为病毒的结构蛋白形成核衣壳：在核或核仁中则作为非结构蛋白来调节宿主细胞的功能(Dongwan，2003)。N蛋白参与病毒农壳的形成N蛋白是形成PRRSV核衣壳的唯一结构蛋白。N蛋白在同型毒株之间相对保守。研究推测N蛋白可能形成20nm一30nm的二十面体的核衣壳核心，其外面包裹一层包含病毒膜蛋白，形成球形的约60nm的病毒粒子，见图6-2。围6-2PRRw棱衣壳形成模式图(引自DoanD．．20∞)Fig．6-2ModelforshelfformationinthePRRSVnucleocapsid注：N蛋白二聚件与RNA核心(橙色)、N蛋白N端域与RNA作用、N蛋白的2个n螺旋与在脂质双殿绿色)的囊膜蛋白(E)的关系Note：thvNdimersintea-ac'twiththeRNAco陀(orange),formingdimcficinte删on$v缸theeirN-t廿mthaldomains．twoahdk幅ofNinteractwiththeenwlopeproteinsinthelipidbilayer(gr酏n)N蛋白Ⅱ螺旋区及B链对N蛋白核衣壳的形成起重要作用。与其它囊膜RNA病毒相似区域的比较发现，含有123个氨基酸的N蛋白的N端(34aa一51aa残基的碱性区域)富含Lys、Gin和Asn，可能与病毒RNA的结合有关(Wootten，2003)；Dongwan等(2003)表明N蛋白上与核定位信号重叠的41aa～47aa氨基酸可与PRRSVRNA结合，参与病毒核农壳的形成。N蛋白30aa～37aa(IAQQNQSR)也参与N蛋白二聚体的形成，此区域具有较强的亲水性使该区域比其它序列更易暴露于水相环境，较多的N、Q等氨基化合物残基，使该区域介导较强氢键来形成N-N二聚体(XuD．．1997)。N蛋白通过30--37aa问的非共价结合、23位C通过二硫键的共价结合形成规则有序的同源二聚体(SarahK．Wotten,2003)。缺失N端57个氨基酸的N蛋白单体结构、二聚体结构的模式图见图∞。每个N蛋白C端89aa--93aa，99aa-108aa形成两条反相B链，20aa一30aa、63aa～66aa，69aa-一86aa，109aa～118aa间形成4个n螺旋(nl～¨)。两个B链在较长略螺旋的同一侧形成反平行的13层．N蛋白二聚体通过4个B链形成扁平的反相B层，两个较短的的o．2、ct4螺旋则分别位于p层的两侧。这样，N蛋白通过同源二聚体B折叠层形成衣壳内表面，N蛋白N端则为病毒RNA结合域，位于衣壳内侧，从而形成蛋白表壳的骨架。这样形成的N蛋白二聚体也使两个不同牺体上51aa--67aa，80aa-,90aa位的氨基酸残基 中国农业大学博士论文第六章文献综述更加接近，从而形成N蛋向的构像型表位(Meulenberg，1998；ZhangY．，1998)。C端形成蛋白的壳形域，与衣壳的形成与稳定有关。C端11个氨基酸残基对衣壳的形成起重要作J=fj(Wooaeneta1．．2001)。VerheUeMH(200I)应川Lv株的感染性克隆，对N蛋白进行缺失突变，表明PRRSV欧洲株可以耐受N蛋向c端6个氨基酸的缺失。图6-3m57蛋白单体与二聚体结构三维卡通圈Fig．6—3CartoondiagramoftheNd57＆itsdimerstruetul'ebyHomologymodeling注：缺失前57个氮基酸的BJ-4株N蛋白结构的同源模建圈，～单体；h二聚体(不同颜色分别袭示不同的结构)Note：stluctureofN(delted57aainN·terminal)ofBJ-4删mbyhomologymodeling．^monomer；hdirects,differentshc【llrcisindicatedindifferenteolour核内N蛋白可调节宿主细胞的合成进入核内的N蛋白则通过影响宿主细胞rRNA前体加工和核糖体的生物合成(biogenesis)过程．来调节宿主细胞的功能。病毒核衣壳蛋白在核内的定位主要发生在病毒蛋白碱性区域与宿主的核蛋白(如B23，nueleolin(C23)等核穿梭蛋白)上延伸的酸性残基之间。在胞浆内，病毒核衣壳与感染细胞核膜上的核穿梭蛋白(importin-e．importin-13)或B23、(223等结合后(Wotton，2003：Dongwan，2003)，通过形成N-输入蛋白(importin)复合体转运N蛋白通过核孔复合体穿膜并定位于核或核仁，而且这种结合不依赖于其它蛋白的参与。相对于形成N蛋白同源二聚体，N蛋白更容易与fibrillarin形成稳定的异源二聚体。通过一系列的缺失突变和蛋白关系的研究表明，N蛋白30aa-37aa区域较多的N、Q等氨基化台物残基使该区域介导较强氢键来形成N．fibfillarm结合物(XuD．，1997；Dongwan，2003)，N蛋白可与fibrillarinN端80个氨基酸上富含甘氨酸、精氨酸的区域(GAP,域，70个残基中含有46个G，13个R)结合，而且N蛋白和flbrillarin的结合依赖RNA的存在。Fibrillarin是一种与小核RNA(snoRNAs)相关、形成小核核糖体蛋白粒子(snoRNPs)的核蛋白。flbrillarinC端具有甲基化酶样域，可能参与rRNA前体的甲基化、前体rRNA的切割加工，以及核糖体亚单位的装配。N蛋白、fibrillarin均具有结合RNA的功能，N．fibrilladn的结合是RNA依赖性的，与N蛋白的磷酸化无关，N蛋白也可与28sRNA、18sRNA结合。因此推测N蛋白与flbrillarin可竞争性的与核仁内相同的rRNA底物结合，导致感染细胞内fibfilladn蛋白的修饰功能改变，进一步影响宿主细胞的功能。6．1．2囊膜糖蛋白GP5的结构与功能74 中国农业大学博士论文第六章文献综述6．1．2．1GP5的理化学特征GP5是由ORF5编码的N．糖基化囊膜蛋白，分子量为25kDa。GP5不同毒株间变异较大(Pirzadehetal．．1998；Rowlandetal,1999)，同型毒株问氨基酸的同源率在88％～99％之间，而欧美两型毒株间氨基酸同源率只有52％～55％(DeaS．,2000)。所有分离株均具有一公认的信号肽序列(1aa一32aa)、2个穿膜基元(65aa～130aa；170aa一190aa)。在GP530aa～32aa；44勰q6aa：51aa-53aa位存在3个潜在的糖基化位点，后两个糖基化位点相对保守，VR2332株33aa～35aa上还存在一个糖基化位点。GP5与M蛋白在内织网结合后才完成糖基化过程，在成熟病毒粒子中，通常与M蛋白通过=硫键以异二聚体的形式存在(deVrieset以1995：Mardassi．1996)。6．1．2．2GP5的结构与生物学功能针对GP5的单抗在病毒中和试验中比其它蛋白的单抗更有效(M．Ostrowski，2002)。GP5在PRRSV感染细胞内表达水平较低。体外中和试验均已证明抗GP5抗体具有中和活性(Weiland“aL，1999：Gonine／a／．，1999：Zhangeta／．，1998；Pirzadehetal．，1997：Gagnon．2001；Zhang，2003)。应用杆状病毒表达系统制各GP5的亚单位抗原(PlanaD．，1997)、DNA疫苗免疫(Pirzadeh，1998：Dea。2000)，使免疫猪接触自然构象的GP5，猪只体内会产生保护性抗体，表明GP5具有中和活性。此外，GP5对T淋巴细胞增殖反应的刺激作用仅次于M蛋白，表明GP5在诱导PRRSV特异性细胞免疫中也具有重要作用。RRRSV通过与细胞上的唾液酸受体黏附，经内吞作用进入肺泡巨噬细胞(Nathalie，2003)。DelpuRe(2002)认为肺泡巨噬细胞上存在M或M-GP5蛋白复合体的受体，该受体约210kDa，为肝素样唾液酸受体。NathalieV．等(2003)最近克隆并在PKl5细胞表达该受体，应用美洲及欧洲型PRRSV毒株感染该细胞系，可在细胞内检测到增殖的病毒，进一步表明唾液酸与PRRSV进入PAM细胞有关。Wissink等(2003)应用单抗鉴定了PAM细胞上至少存在2种N-糖基化蛋白(150kDa和一220kDa蛋白)可作为PRRSV感染的受体。PRRSV可引起肺、淋巴组织、睾丸等组织的细胞凋亡，是否与PRRSV感染早期PAM功能损害和急性期内PAM和外周血白细胞数量减少有关还有待继续研究。GP5体外能诱导原代肺泡巨噬细胞(PAMs)、MARC-145细胞凋亡(Suarez，1996：Labarque，200hNauwynck，1999{Sureta／．．1998；Labarque，2003)，通过构建N端或C端的缺失表达质粒作瞬时表达表明，GP5前端118aa与诱导凋亡有关(Femanderz，2002)。6．I．2．3GP5的结构及其免疫学功能欧洲株和美洲株GP5之间存在共同抗原表位(Oleksiewiez．2002)，也存在型独特性表位。GP5上至少存在2个线性中和表位，但也有构象决定簇(Zhang，1998；Pirzadeh·1998)。目前的研究(Yang。2000；Weiland，1999．RodriguezetaL，2001；Ostrowsl【ieta1．,2002zPlagemarmeta1．．2002)表明，美洲型GP5上有3个线性表位，分别位于27aa～30aa(非中和性表位)、37aa～45aa(糖基化的中和表位，Plagemannetal．，2002)、170aa～201aa(非中和性表位)。 中国农业大学博士论文第六章文献综述Pirzadeh等(1997，1998)认为GP5上存在2个中和表位，一个线性表位，一个为构象表位。Pirzadeh应用大肠杆菌表达的重组蛋白制备单抗，鉴定出一具有中和活性的美洲株线性表位．该表位不受糖基化的影响，这表明GP5在病毒感染或吸附细胞受体、病毒进入靶细胞中起重要作用；应用PRRSVORF5的DNA疫苗及单抗鉴定表明GP5上还存在一构象性表位(Pirzadeh，1998)。欧洲型的Gp5蛋白至少存在着三个线性表位：一个中和性表位(38aa～54aa)和两个非中和性表位(130aa～170aa和170aa～201aa)．并认为在38位以前的氨基酸区域并不存在着线性或非线性表位(Plagemann，2004；Rodriguez，2001)。但Wissink等(2003)认为欧洲株29aa-35aa有一中和表位，24位氨基酸突变为P可导致信号肽不被切割或切割错误并出现新的表位。OstrowskiM等(2002)用噬菌体呈现技术．用PRRSV中和单抗ISU25-C1从12肽库中筛选带有能够被抗血清识剐并具有较高中和滴度短肽的噬菌体。结果在GP5的胞外区发现2个表位，其中一个(表位B)是线性保守表位，既能被单抗ISU25-CI识别，又能被猪抗PRRSv中和血清识别，表明它是一个中和表位。另一个可以被非中和抗体识别、不被猪抗PRRSv中和血清识别的非中和表位(A)是为高变异性的免疫优势表位。应用ORF5缺失突变、GP5亲水区合成多肽与不同单抗作用的鉴定表明，GP5上胞外区27aa～41aa、C一端(180aa-197aa位存在2个优势表位，缺失C端50个氨基酸的表达蛋白与感染猪血清的反应性消失，表明C端有较强的抗原性或其在内部的构象对中和活性抗体的产生、及维持GP5结构上有重要作用(Dea，2000)。Rodriguez等(2001)通过制各重组蛋白的单抗表明，GP5上存在2个线性表位(130aa～170aa,170aa-201aa)，但130aa～170aa与自然感染猪阳性血清反应性差，而170aa～201aa与PRRSV阳性血清具有很好的反应性，且最后25个氨基酸在欧美毒株间高度保守，可作为诊断工具，并认为最后11氨基酸残基(190aa～201aa)暴露于病毒表面，易于与抗体作用。但该表位没有中和活性。研究表明，表位的化学组成或结构是影响免疫决定簇的重要参数(NakraP．，2000)。PRRSVGP527aa～31aa表位具有诱变表位(decoyepitope)的特征(感染后强的免疫原性：多变性)(Garrity，1997)·可以诱变免疫反应远离具有中和活性的37aa～45aa表位。因此，27aa～30aa表位的抗体在感染早期(1周)即可检测到(William，2003；Os劬啪kjet口L,2002：HDLoemba，1996：Kwang，1999b；Yoon，1995)，而中和表位37aa～45aa的抗体在感染后3周才可检测到，而且两个表位的抗体里负相关，在AIDS等免疫抑制病上也存在这种现象。H”和14’Y44l一构成37aa～45aa表位的主要识别位点，这些区域在PRRSV分离株中较保守，表明此区域在病毒结构中具有重要作用(Ostrows蚰甜甜．．2002)。6．1．2．4GP5的结构与变异GP5是PRRSV最易发生变异的结构蛋白，其变异表现在遗传(基因水平)和结构(蛋白质水平)上。ORF5可通过随机突变0Dee2001：WesleyRD．，1998；ChangCC．，2002：Kaputeta1．，1996；GoldbergTL．，2000；CheonDS．，2000)、基因重组(Yuanel甜．，1999：Meng,2000：Murtaugheta／．。1998，2001：vailVugtJJ．，2001；Yooneta／．，2001；ForsbergR．，2002)和准种的产生(Rowlandctal．，1999：TonyL—G2003；ReneeL，2003：GaoZQ．elaL，2004)等发生基因改变。GP5的变异表现在 中国农业大学博士论文第六章文献综述氮基酸序列的变化、糖基化位点的缺失或修饰、氮基酸缺失等方面(YingFang,2004；KijonaFK．，2001)。一般地，相对保守的区域都易形成较为稳定的n螺旋或9折叠，很少位于无规贝Ⅱ蜷曲处。这种结构特性与其功能密起相关。对300多株PRRSv病毒ORF5的变异分析表明，GP5存在4个保守区40aa～57aa，67aa～90aa．107aa～120aa，129aa～150aa，高变区域主要出现在信号肽序列(1髓～3laa)和胞膜外域2个高变区(32黼～35∞糖基化位点。57aa,--61aa)(AndreyevVG．，1997：Deas．,2000)。相对保守的区域有40aa～56aa．62aa～89aa，107缸～120龃和129～150缸。主要位于B延伸链(“∞～5laa)、预测的跨膜区和GP5的C端。一般地，跨膜区多为礞旋或8链组成。预测的PRRSV的3个跨膜区域氨基酸组成则相对保守(Pirzadeh,1997)，组成也符合跨膜区的特征(高镜岩，2002)。GP5的三次跨膜区域均具有稳定的二级结构，其68aa--77aa、91aa--96aa为一稳定的B链、108aa～124aa为显著的n螺旋区域。PPRSV存在3～4个潜在的糖基化位点(Nxsrr，X是除脯氨酸外的任何氨基酸)：30-NAS：r或32-NST(美洲株)、44-NLT；9151-biGT糖基化位点。糖基化不影响中和能力(GabonCA，2003)30aa-35aa为一高度变异的糖基化位点，后2个糖基化位点在美洲株与欧洲株间较保守(ReneeL．，2003；MateuE．，2003)。30aa～37aa是GP5蛋白第1个赭基化位点，从结构上看，该位点处于为规则蜷曲处，易形成抗原表位，但又是极易变异的中和位点，其中和活性因毒株而异(Rodriguez“a／．，2001；os的wsl【ietal．，2002：TonyLG．，2003：ReneeL．,2003)。37强～53∞位富含亲水性氨基酸，该区段处于B链主区、两边为无规则蜷曲区域，也可以形成优势表位。多个比较研究表明GP5上位于信号肽的第13位氨基酸(Arg突变为Ash，可能影响信号肽的结构，从而干扰GP5蛋白的转运)、137位(Ser转变为Ala)、151位(由Arg突变：为Oly．位于疏水区，该氨基酸的变异改变了该区域的疏水性)等～个或几个氨基酸的改变，可能降低病毒的毒力(AllendeR．，2000：YangSX．，1998：StanislavI．，2000)，这种改变可能通过改变蛋白质的结构，导致病毒增殖能力的变化。因此可以看出，GP5的变异主要发生于无规则蜷曲．重要功能域则保持了相对的结构稳定性。6，1．3展望虽然对PRRSV的研究不断深入，在病毒结构蛋白和功能的关系和免疫特性方面取得了一些进展，但对PRRSV蛋白功能的认识，有赖于对其结构的解析。N蛋自C端部分结构域的解析对N蛋白二聚体的认识，核衣壳的包装，N蛋白免痉原性的认识提供了合理的解释。但目前仍没有完整N蛋白的结构解析资料。不稳定、易降解的重组N蛋自成为其晶体制备的致命伤。GP5=级结构的分析，为其变异性、免疫原性等功能的认识提供部分依据，但对GP5与M蛋白异聚体的结构关系，GP5诱导细胞凋亡等功能的认识尚有依赖于对GP531)结构的解析。GP5作为一种膜蛋白，其重组蟹白的可溶性表达与纯化成为制各其蛋白晶体的前提和瓶颈。目前从PDB资料不能获取与GP5同源性较高的部分蛋白域的相似结构，难以通过同源模建的方法解析GP5的蛋白结构。因此，通过基因改造获得重要结构域重组蛋白，逐步解析GP5的结构可能成为认识GP5结构生物学研究的选择。 中国农业大学博士论文第六章文献综述6．2用于结构生物学研究的原核表达技术大肠杆菌是结构基因组中蛋白质表达的主要手段(ShigeyukiY，2003；CeliaW．，2003)，基‘『J对大肠杆菌基础生物学、遗传学以及生物学等背景知识的认识．特别是对其基因表达调控分子机理的深刻了解；越来越多不同类型表达载体及其寄主菌的开发；以及丈肠杆菌高表达水平、低成本、操作简单．易于进行工业化批量生产等优点，使大肠杆菌表达系统已成为目前应用最广的表达系统。PDB中大部分结构数据都是由大肠杆菌表达系统获得的。6．2．1原核表达系统的组成及其对基因表达的影响6．2．1．1表达载体的选择表达载体的选择主要决定于试验的目的要求。但往往有许多不明因素影响着外源基因在大肠杆菌的表达，常常出现不表达或表达量低微及形成包涵体(约占70％)等疑难问题。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，被内膜(又称质膜)和外膜隔开形成三个腔(compartment)：胞内、周质和胞外。表达的外源重组蛋白也可相应地定位于胞内、周质空间或胞外培养基中。此外，近年发展起来的表面呈示(surfacedisplay)技术，还可使重组蛋白定位在大肠杆菌的表面。这种外源蛋白表达场所的选择主要取决于目的蛋白的类型、数量和纯化要求。它们有着各自的优势和缺陷(GerhardH．，1998)(见表6-1)。如果靶蛋白主要用于制备抗体。则不必要求可溶性或有其它活性，包涵体即可满足要求：但如果表达的靶蛋白用于酶活性或其它生物学活性的检测、结构研究(NMR、结晶等)，则要求正确的折叠，最好为可溶性表达(PeterA．Bell，20011M．Opekarova,2003)。表6-l大肠杆菌不同腔室生产蛋白的优缺点Fi96-1Advantages＆disadvantagesofeachcompartmentofE．coliforproteinproduction胞浆中(包涵体)细胞周间隙易从细胞分离：纯化简单(最初表达盈：5—25％；欣乏生物学活性；需要进行重折叠复性；后洗涤、提取纯度后达25--809；离子交换后可达期纯化较复杂；S-S键形成不佳；不同蛋白90％以上)；高教表达l蛋白无括性．对宿主细胞纯化方法相似，需多步骤、高倍稀释提高溶无害；防止宿主蛋白酶降解；蛋白稳定性好解度纯化简单l蛋白折叠较好；蛋白酶降解较少；N表达量稍高时，形成包涵体；折叠效率有限；端稳定．保真性好细胞外N端保真性好；蛋白折叠充分；蛋白酶解最少膜蛋白过量表达受膜空间的限制，但每升培养物仍可得到10mg的膜蛋白．通常为非分泌蛋白；纯化较复杂原核表达载体至少包括以下元件：转录启动子；核糖体结合位点(I国s)i翻译起始位点，选择性标记(如抗性筛选)；复制原点等。见图64。 中国农业大学博士论文第六章文献综述图6-4原核表达载体的结构模式图(引自GerhardH．，1996)Fig．6-4Schematicrepresentationofprokayoticexpressionvector目前已有许多商品化的表达载体供选择(AlanSmith，1995)．但一般地，要考虑以下因素：复制子(Ori)决定基因的拷贝数。结构生物学研究中，低拷贝数质粒比高拷贝数质粒好，建议5～40个拷贝。启动予(P)启动子的强弱可影响基因的表达。高水平表达的启动子要满足以下标准：(1)强启动子，蛋白表达量占总菌体蛋白量的10～30N：(2)尽可能小的本底转录，在目的蛋白有毒性或影响宿主细胞生长时，高抑制性的启动子是很重要的：(3)在简单和经济的条件下诱导，常用温度(如lacI启动子)或化学诱导(如IPTG诱导的fie,l口C启动子)的方法。转录终止子(Transcriptionterminators,TT)转录终止子可以加强mRNA的稳定性，提高表达水平。核糖体结合位点(mks)指原核细胞mRNA5’端非翻译区同16SRma3’端的互补序列。包括转录开始信号(SD序列，最适为AGGAGG)及紧跟其后的富含AT的转录间隔序列(最适为8个)。转录调节有时受编码序列影响，+5、+10位应该为A或T。在编码区3’形成茎环结构可提高RNA的稳定性。翻译调节mRNA5，端的结构严重影响mRNA的翻译起始。RBS序列中AT含量多时有利于翻译的起始。密码子起始密码子的使用频率为AUG(90％)，GUG(8％)，UUO(1％)，CUG(O．I％)；应避免sD序列与mRNA多聚体中的起始AUG间形成二级结构。大肠杆菌利用密码子具有偏倚性。5’端稀有密码子较多及Gc含量较高时严重影响翻译效率。大肠杆菌的稀有密码子主要有编码精氨酸(R)的AGA(AGG)，因只有很少的tRNA与这些稀有密码子互补而影响翻译。大肠杆菌偏爱UAA终止子，在存在UAAU时翻译终止进一步加强。mRNA的稳定性mRNA的快速降解影响蛋白表达量。mRNA5’端UTR形成保护性的发荚结构可延长mRNA的半衰期，3，UTR衍生序列形成茎环结构可增强mRNA的稳定性。宿主菌的选择宿主菌的选择取决于载体的启动子。对一些蛋白来说，选用蛋白酶缺陷或共表达分子伴侣的宿主菌是有效的(Georgiou&VMax,1996)。6．2．1．2对所表达靶基因的理解预测靶基因的表达是困难的，对任何载体来说都可能不表达。但仍然有相当的经验可循，一 中国农业大学博士论文第六章文献综述般地-简单的球装蛋白、含较少半胱氨酸(如血凝或金属蛋白)、中等大小(<60kDa)的蛋白易于用Ecoli表达系统表达，而分泌性的真核蛋白和膜蛋白(特别是那些具有几个转膜区的蛋白)则不易表达(P．J．L．Werten．2002)。应用原核表达靶基因还要分析以下因素：(1)GC含量GC含量高(>70％)的序列不易表达；(2)密码子的偏倚性分子量>60kDa的蛋白．如果含有高频率的稀有密码子或多个稀有密码子距离较近。则不易表达：辖氨酸稀有密码子串可导致形成核糖体结合序列，如--AC,GAGG序列与SD序列(UAAGGAGG)相似，这样常影响翻译。常需要经过稀有密码子的突变、在宿主细胞内共表达识别稀有密码子的tRNA基因来解决；(3)靶基因的二级结构起始密码子附近序列的二级结构可影响转录及翻译起始。通过点突变或部分、全部人工合成的方法破坏mRNA5'-未翻译区的茎环结构(超过8个碱基)，增强翻译起始速率；(4)基因或蛋白的大小过大(>100kDa)或过小(《kDa)不易表达；(5)蛋白对宿主细胞的潜在毒性部分非特异的蛋白酶、核酸酶、孔蛋白等可能对宿主细胞有毒性。如果表达载体有毒性，可改用严谨性调节的启动子(如T7启动子、pET载体)，同时减少细胞传代防止突变和重组的发生。6．2．2结构生物学对表达蛋白的特殊要求不是所有的蛋白都可用于结构分析，特别是3D结构的分析。对于大肠杆菌表达异源蛋白用于结构研究是目前最困难、最富有挑战的问题(CeliaW,2002)。通常要求表达的蛋白必须是天然、有活性、可溶的。高纯度的，并有一定的浓度：同时要考虑糖基化及糖基化程度对维持蛋白天然构象的影响。防止蛋白被修饰化，磷酸化、乙酰化、甲基化往往使蛋白质形成异构体，并影响等电点。因此，重组蛋白的获取要从多方面考虑，其生产蛋白的路线见图6-5。靶基因的确定士克隆和表达(c端His-tagN端His-tagN端融合其它蛋白)／＼＼▲可溶性稳定性(低温诱导添加助溶物质分子伴侣防止聚集)(蛋白酶抑制剂低温操作保存)蛋白纯化(亲和层析分子筛层析离子交换)0结构分析围6-5大肠杆菌生产结构生物学研究用蛋白质的策略Fig．6-5SwatagyforproteinproductionusinginsWacturalbiologyresearchinEcolt 中国农业大学博士论文第六章文献综述6．2．2．1蛋白质的稳定性表达的蛋白可在大肠杆菌体内或裂解后发生降解。因此，保持蛋白的完摧性是结构研究的前提。菌体内的蛋白酶也可降解蛋白(PeterA．Bell，2001)。细胞内表达蛋白的稳定性主要受表达基因的影响，蛋白在大肠杆菌体内降解的第一步是除去氨基端的甲硫氨酸(由甲硫氨酸氨基肽酶催化)，当+2位的氨基酸有一大的侧链时，此步反应交慢；Tobias(1991)提出氨基酸稳定性的‘‘N端规则”，当N端氨基酸为Arg，Lys，Leu，Phen‘Trp残基，含Pro,Glu,Seu，TIn"残基丰富的蛋白质在大肠杆菌内易降解，蛋白在体内的半衰期仅为2min，N端为其它氨基酸时半衰期则大于lOh。细胞裂解后，产生的可溶性蛋白可发生凝聚，细胞膜上释放的蛋白水解酶会裂解蛋白。降低表达蛋白降解的措施包括：(1准靶蛋白表达于细胞问隙或分泌于胞外；(2)改变存在蛋白酶切割位点的氨基酸残基；(3)融合或串联表达，细菌降解蛋白主要识别其N端序列，一般而言，融合蛋白在宿主菌体内较为稳定，不被菌体内的酶所降解。通过组建融合基因的方法，产生融合蛋白。融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解。这种通过融合蛋白表达外源基因，特别是为相对分子质量较小的多肽或蛋白编码的基因，尤为合适：(4)选用蛋白酶缺陷株(如OrigamiTM，Roscfta-gamiTM)作为宿主菌大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次黄噪吟核苷Ion，用Io棚陷型菌株作受体菌，蛋白酶不能合成，表达的目的蛋白得到保护；(5)将pin基因阅读框克隆入表达质粒：pin是T4噬菌体的l基因产物，是细菌蛋白酶的抑制剂：(6)温度、pH值可影响mRNA的转录，蛋白裂解酶的活性及分泌表达的水平。在表达过程中降解的蛋白，可尝试低温短期诱导(2．4h)，优化培养条件；(7)间歇超声，溶液里面要加蛋白酶抑制剂，在冰水浴中间歇超声，以防连续的超声使溶液温度升高：常用的蛋白酶抑制剂有PMSF(终浓度0．2retool／L)、Leupeptin(终浓度lI．tg／mL)、EDTA(Immol／L)、PepstatinAO“g／mL)、Aprotinin(1pg／mL)；(8)低温进行蛋白的纯化操作，冰上操作，可降低蛋白酶的活性，另一方面低温可以增加蛋白酶抑制剂的稳定性；(9)在没有别的方法时，可将裂解后的细胞与层析材料(如阴离子交换树脂)混合．可部分防止裂解。同时要保持蛋白在在溶液中的均一性，不发生聚集和沉淀(Celiaw．，2002)。因此，要针对不同的蛋白，选择不同的融合标签、筛选缓冲溶液及保存条件等。此外，要将蛋白降解和提前转录、翻译终止等区别开。蛋白降解、转录提前终止、不确定的错误翻译都可导致电泳时出现多条带，通过比较加入蛋白酶抑制剂(孙侣F)前后防止蛋白降解的程度可以区分这几种情况(PeterA．Bell，2001)。在AUG上游5～20nt存在AAGGAGG等RBS位点时常导致不需要的翻译，产生小的蛋白，在这种情况下，可在目的基因N端、c端分别加入tag，采用双重亲合纯化的方法获得全长蛋白。6．2．2．2蛋白的可溶性表达6．2．2．2．I靶蛋白的组成分析目的基因的序列组成，及其编码蛋白质的特性是可溶性与否的决定因素。含过多疏水性氨基8l 中国农业大学博士论文第六章文献综述酸的蛋白质疏水性强，易发生聚集、粘连，稳定性、可溶性差。氨基酸组成、电荷分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量等是影响分泌表达的重要因子(JanetSire，1999)。培养条件、启动子的选择、宿主菌、表达温度，诱导条件等都可影响蛋白质折叠使之可形成可溶性蛋白。不溶性主要依赖于蛋白结构，与亲水性，电荷也有一定关系。外源基因的过表达，特别在大肠杆菌中；易形成包涵体。蛋白质的可溶性并不总是依赖于亲水性、电荷与氨基酸构成等参数。但也有研究表明二级结构与可溶性表达有相关性，用一些带电荷、亲水性氨基酸代替一些暴露于外面的残基，可提高可溶性(JanetSim，1999)。但在氨基酸替换时，应避免替换涉及维持环稳定性(特别是转角处的P)、疏水基团包装，形成相应．OH键、盐桥的氨基酸(王大成，2002)。特异的残基可影响蛋白质折叠及二级结构，进一步影响蛋白的可溶性与其它生物化学参数。6,2．2．2．2蛋白可溶性预测的Wilknson-Harrison模型Wilknson-Harrison等(1991)根据大量试验提出了蛋白质原核表达的可溶性预测模型。Davis{3D等(t999)作了进一步修订。提出通过正则变量(cv)和氨基酸组成参数计算来判断蛋白质的可溶性的Willdn$orl．Ha晡son修订模型。CV=Xl(N+O+P+s)／n+k2．1【佛+K)_(呲)】／n-0．03l；n；蛋白中的氨基酸数；N’GEs；Am,Gly，Pro，Ser残基；R,ICD,E=Arg，Lys，Asp，Glu残基；Xl=15．43，旭=一29．56；可溶性的判别值=CV-CV7，判别常数CV7=1．71：CV-CV7>o，为不溶性蛋白；CV-CV’a的同源二聚体lkDa"国旧D蜘lkDa抗E琼脂糖抗FLAG柱子谷脐苷肚琼脂糖／sepharoseNA抗E抗体抗FLAG抗体抗GST抗体，C趼m底物抗HA抗体NTA琼脂糖，亚氨基抗His6抗体乙蕺乙酸sephI'ose，多搪珠抗MBP10aa,EQKLISEEDL抗Myc抗体基质大肠杆菌NusA蛋白．495aaNA12。5kDa生物素化底肚亲合索基质S-tag15n肽(S-tag)。与胰核酸酶s·蛋白琼脂糖珠A的一个104∞片段具有强的亲合力抗体-Myc抗体无亲合素，链亲舍素结合物S蛋白FITC结合物内含肽，通过DTI"或2．巯基乙醇4"C在柱子上诱导切割NA肠激酶凝血酶、Xa因子、PreScissionTprotease肠激酶Xa因子NA凝血酶：Ca园子凝血酶，肠澈酶Strep-tag结合链亲合素的10咀序列链亲台素珠链亲合索结台物兰：基堕全兰彗塑主=!!坠耋丛!鲤：!竺垒兰!篓兰!．里王——．(引自PctorABell．2001)在结构研究或与天然蛋白作比较等研究中，常需要切除融合蛋白。常有的切割酶见表6-3。此外，Biolabs公司有商品化的、可以裂解自身拚接的内含肽出售。表6-3常用的融和蛋白切割酶类(gl自Al眦sG，200])!!堡!：!婴竺!竺里璺!!!竺竺塑垒!竺￡!唑!!!!三坚矍!竺2苎三_————————一蛋白酶切割位点评价!业坚!!塑塑坐———————生!堕————=——_=-凝血酶VPR'、GS广泛应用，1：1000～l：2000(与靶蛋白的分子数比)；牛源，可能含其它杂蛋白Xa因子IEGR^切割决定于N端；l：500～I：1000(与靶蛋白的分子教比)；P后为R时不能切割肠澉酶DDDDKA切割决定于N端，重组蛋白rTEVENLYFQ'B烟草花叶病毒的重组内肚酶内含肚介导的自身切割不需要加酶!望i坐!!!!￡竺!!篓坚∑臻g：堡里翌壁垒塑墨堕童!呈曼鱼堕一一一．．——6．2．2．4包涵体的变性复性 中国农业大学博士论文第六章文献综述为了研究蛋白结构，必须使变性的蛋白恢复其天然构象。对于极少数经变性复性可获得理想折叠的包涵体蛋白，也可用于结构研究(王镜岩．2002)。要得到较纯较高产率的目的蛋白，需要做好破菌，包涵体的分离、洗涤及增溶、变性复性等过程。但一般复性效率不高，不超过20％(宁云山。2001)。对一些酶类可通过在复性过程中加入酶的底物或底物类似物促进蛋白复性。6．2．3方法学的进展与挑战应用大肠杆菌进行结构生物学研究．己在多方面取得大的进展。如对蛋白折叠的理解{在可溶性筛选等方面，已发展出在96孔板进行溶解和滤过操作分离包涵体和可溶性蛋白，形成高通量的可溶性蛋白筛选技术(shigeyukiY。2003)。大肠杆菌表达异源蛋白甩于结构研究是目前最困难、最富有挑战的闯题(CeliaW．，2002)，通常要求表达的蛋白必须是天然、有活性、可溶的，高纯度的，并有一定的浓度。目前，应用大肠杆菌对真核生物基因的表达，主要靶向功能域或小蛋白的研究假uneyJH．，2002)；基因组较大高等真核生物蛋白、多功能域蛋白、真核膜蛋白或多亚单位蛋白复合体的表达仍是表选的瓶颈(ShigeyukiY．,2003；M．Opek∞rova,2003)。需要进一步研究大肠杆菌分泌表达途径，以寻求有效的蛋白分泌表达；此外，通过基因工程技术在大肠杆菌质粒或染色体加入适当的真核酶类，以加强大肠杆菌糖基化、磷酸化、乙酰化或氨基化的修饰功能。这些问题的存在，都为应用大肠杆菌表达外源基因提出了挑战。 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中国农业大学博士论文致谢本论文是在导师杨汉春教授的悉心指导下完成的。三年来，思师授业育人，在科研、学习、生活等各个方面给予谆谆教诲、指导和关怀。导师严谨的学风，渊博的学识，对科研敏锐的洞察力和严密的逻辑思维，锐意开拓、乐观向上、谨己宽人的人生态度，使我敬佩并将受益终生。值此论文完成之际，谨向导师杨汉春教授表示深深的敬意和衷心的感谢!特别感谢郭鑫副教授、陈艳红、查振林、吕艳丽、匡字、张国中等老师和吴秀梅师傅对我实验研究所提供的指导和帮助!感谢曾给予我指导、关心和帮助的本院各位老师!感谢我的同班同学王建华、李永清、任慧英、陈小云、周双海、邓国华、王晓佳、安健、哈斯苏荣、马卫明、史喜菊等给予的帮助；感谢本研究室博士生宋勤叶、温立斌、盖新娜、付利芝、蒲静、磨美兰、冉智光、司兴奎，硕士生严安、姚建聪、姚鑫、李宁、李杰等师兄弟在实验和课题设计、课题实施中给予我的宝贵建议、协作以及无私帮助，使我在一个团结友爱、积极向上的集体中顺利完成论文．在此，我真挚地向他们表示衷心的感谢!衷心感谢清华大学丁晓岚老师在圆二色谱工作中给予的帮助。感谢清华大学韩雪清博士后、徐彦辉博士、张强哲硕士，军事医学科学院刘伯华博士，中国兽医药品监察所谷红博士、王忠田博士、刘业兵硕士，中国医学科学院王玉娥博士，北京出入境检验栓疫局高志强博士等给予我耐心的专业指导及有益的讨论!感谢美国明尼苏达大学的GoyaIMSagar教授，留学美国的韩军、郑沽博士给予的多方指导、建议和帮助。感谢我的硕士导师李健强教授几年来对我学业上的鼓励。感谢天津市农业科学院领导给予的支持与关怀，感谢天津市畜牧兽医研究所丁伯良、王英珍研究员及刘兰兰等同事几年来对我学业的鼓励与支持!特别感谢我的父母、爱人楼辰军女士和女儿黄潇雨的理解、全力支持和鼓励，三年来，是她们始终如一的爱与支持，鼓励我完成学业!在此，向所有给予我支持、关心和帮助的老师、同学、家人和朋友再一次致以衷心的感谢1100 中国农业大学博士论文附录重组表达质粒的构建图附录附图1原核重组表达质粒pGEX-6P-dE的构建Fig．1ConstructionofrecombinantprokaryoticexpressionplasimidpGEX-6P-dE10J 102附图2原接重组表达质粒pOEX-6P-dEM的构建Fig2ConstructionofrecombinantprokaryotieexpressionmutantplasimidpGEX-6P-dEM 中国农业大学博士论文附录附图3原核重组表达质粒pGEX-6P-N的构建Fig．3ConstructionoflecombinmttprokaryoticexpressionplasimldpGEX-6P-N103 104附图4原核重组表达质粒pET28-N的构建Fig．4Constructionofrccombinantprokaryoficexpressionpl∞imidpET28-Ngone． 中国农业大学博士论文附录附图5基因原核重组表达质粒pET32-dEM的构建Fig．5ConstructionofrecombinantprokaryoticexpressionplasimidpET32-dEM·105 中国农业大学博士论文作者简历黄金海，男，1970年1月出生，陕晒台阳人。1989年于西北农业大学动物医学系五年制本科学习，1994年获农学学士：1994年9月于西北农业大学动物医学系动物微生物学与免疫学专业学习，1997年6月获农学硕士学位，同年分配至天津市农业科学院畜牧兽医研究所工作。曾获省级科技进步一、二等奖各1项，厅局级科技进步一等奖2项。2001年9月至今，在中国农业大学动物医学院预防兽医学专业攻读博士学位。在读期问主持天津市自然基金1项，获天津市农科院科技进步二等奖1项。在读期间发表的论文【1】黄金海，杨汉春．蛋白结晶技术在病毒学研究中的应用．动物医学进展．2003，24(5)：1～3[2】黄金海，杨汉春，郭鑫，陈艳红，查振林．猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达、纯化与结构分析．微生物学报，2005，(1)：(已录用)【3】黄金海，李秀丽，鄢明华，等。天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定，动物科学与动物医学，2002，19(3)：21～23[4】黄金海，丁伯良，王东．猪主要繁殖障碍病的流行现状与防制对策，动物医学进展．2002，23(2)：99～102【5】黄金海，王英珍，丁伯良，等．问接ELISA检测禽流感抗体方法的建立，动物医学进展，2004，25(4)：(已录用)[6】黄金海，王英珍，丁伯良，等．间接ELISA检测鸡传染性鼻炎抗体的研究，中国预防兽医学报，2001，23(6)：454～457[7】黄金海，王英珍，丁伯良，等．间接ELISA检测鸡大肠埃希氏菌菌毛抗体方法的建立。中国兽医科技，2001，31(I)：6～8附注：【本论文圈共59个；表10个；参考文献207篇；约7万字】。
