鸭新城疫病毒HN蛋白原核表达及初步应用

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文鸭新城疫病毒HN蛋白原核表达及初步应用ProkaryoticExpressionandFirstApplicationofHNGeneofDuck-originNDV刘俊指导教师姓名贾宁教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称基础兽医学研究方向兽医病理学论文答辩日期2014年5月30日学位授予日期2014年6月答辩委员会主席李克生研究员评阅人刘光远研究员李剑勇研究员2014年5月30日ClassificationNo：Secrecylevel：ZeroUDC：Schoolcode：10733Ga

2、nsuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeProkaryoticExpressionandFirstApplicationofHNGeneofDuck-originNDVPostgraduate:LiuJunSupervisor:Prof.JiaNingSpeciality:BasicVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryPathologySubmittedTime:June2014Address:Lanzhou,China,730070甘肃

3、农业大学2014届硕士学位论文摘要【目的】本研究利用Westernblot技术，对表达的HN蛋白进行免疫原性分析，并利用获得的可溶性纯化蛋白为初步构建鸭源NDV抗体ELISA检测方法。【方法】(1)设计一对特异性引物用来扩增HN基因，将扩增出的HN基因，克隆入原核表达载体pET-30a(+)。将成功克隆的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，诱导表达目的蛋白，利用Westernblot技术检测重组抗原的反应原性。将可溶性目的蛋白免疫成年短毛雄兔，制备（兔免血清）多克隆抗体。(2)以纯化后的重组蛋白为包被抗原，棋盘方阵滴定试验摸索最佳工作条件，

4、并根据100份健康鸭血确定阴阳性血清临界值，建立鸭NDVELISA抗体检测方法。根据初步构建的间接ELISA方法，对江苏省泰州市某地区收集的部分鸭只进行新城疫病毒血清学检测。【结果】(1)在64KD左右处可见融合蛋白预期条带，并且形式存在为包涵体，Westernblot显示，在预期大小处有一条特异性条带，表明重组抗原具有良好的反应原性；(2)Westernblot证明制备的兔免血清多克隆抗体在对鸭源新城疫全病毒具有良好的特异性；(3)方阵滴定法，确定最佳工作条件为抗原包被液浓度：1000ng/well；血清最佳稀释度：1:500。根据100份健康鸭血确定阴阳性

5、血清临界值为当待检血清OD450≥0.340时，确定为阳性；待检血清OD450＜0.295时，确定为阴性。应用建立的间接ELISA方法对江苏省泰州市某地区收集的部分鸭只进行新城疫病毒血清学检测，阳性检出率为75%（84/116）。【结论】本研究将NDVHN基因成功克隆入pET-30a（+）载体，并优化融合蛋白表达量；制备了良好的兔免血清多克隆抗体；摸索出ELISA最佳工作条件，并根据阴性血清确定阴性和阳性血清临界值；建立了鸭源NDVELISA抗体技术检测，并在鸭NDV血清学技术诊断中得到了初步应用。关键词：鸭；NDV；HN基因；诱导；表达；ELISAI甘肃农业

6、大学2014届硕士学位论文SummaryDuck-originNDisanacuteandhighlycontagiousinfectiousdisease.Formerlywaterfowlhavestrongerresistancetocold,showedonlythepoison.Butinrecently,NDValsohadstrongpathogenicitytoducks,Ithasaseriousimpactonthebusinessofduck.InordertoestablishaELISAmethodtodetectantibodyag

7、ainstduck-originNDV,thisresearchinsertedtheHNgeneintotheprokaryoticvectorpET-30a(+)andexpressedsuccessfully,BasedontheantigenicanalysisofHNprotein.Atthesametime,preparedrabbitantiserum.Specificmethodsasfollowings:(1)InsertedtheextensionofNDVHNgeneofduckwhichhasapairofspecificprimers

8、intotheprokaryotice