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《丙型肝炎病毒f蛋白的原核表达及初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达及初步应用作者：蒋春梅,刁振宇,崔国兴,钱万红,邓小昭,许可,丁伟良,谈永飞,张云【关键词】丙型肝炎病毒;,F蛋白;,基因克隆;,蛋白表达;,抗体制备 ExpressionandpreliminarystudyofHCVFprotEingene [Abstract]AIM:ToexpressHCVFprotEIngenefragmentinE.colianddetectifthereisitsantibodyinHCVpatients.METHODS:RNAofthevirusid
2、entifiedasgeype1bplate,theFproteingeneplifiedbyRTPCR.ThisgenefragmentidvectorpGEMsimpleT.FgeneHIfrompGEMandclonedintoplasmidvectorpGEX4T2.TheligationmixtureedintoE.coli.TG1andFfragmentexpressionlysatesHI双酶切后,再插入表达载体pGEX4T2中,转化大肠杆菌TG1,在IPTG诱导下表达GSTF蛋白。用亲和层析法纯化
3、GSTF蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清。并用纯化的GSTF蛋白进行ELISA法检测丙肝患者血清抗F蛋白抗体。结果:在细菌裂解液中检测到重组的融合蛋白,经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GSTF融合蛋白。应用SIMPLET载体及蛋白marker购自TaKaRa公司。DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司。HRP标记的羊抗人IgG、羊抗鼠IgG购自南京阿恩地公司。6~8周龄BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,由南京军区军事医学研究所饲养。 1.2方法: 1
4、.2.1HCV基因分型采用Simmonds等[2]设计的5′NCR型特异性引物,对分离自10个丙肝患者的HCVRNA进行分型。取5μLHCVRNA溶液,采用六聚体随机引物,于20μL体系中逆转录为cDNA。取5μLcDNA,采用下列型特异性引物,内正义引物:5′AGTGTCRTRCAGCCTCCAGG3′(99~118nt);内反义引物1:5′GGGGCACGCCCAAATCTCCA3′(220~239nt）141bp;内反义引物2:5′CAAATGACCGGRCATAGAGT3′（210~229nt）131bp
5、;内反义引物3:5′GCACGCCCAAATTTCTGGGT3′（217~236nt）138bp;内反义引物1b:5′ACTACTCGGCTAGCAGTCTC3′（243~262nt）164bp;于50μLPCR体系中进行PCR,步骤为:95℃5min,95℃1min,40℃1min,72℃1min,共35个循环。 1.2.2pGEMF载体的构建以基因型为1b型的患者血清的HCVcDNA为模板,采用下列4条引物,扩增F蛋白基因的序列。正义引物的序列p1:5′GTGGATCCCCAAACGTAACACC3′;正义
6、引物的序列p2:5′CTAAGCCTCAGAGAAAGCCAAACGTAACACC3′;正义引物的序列p3:5′GTGGATCCAGCACAAATCCTAAGCCTCAGAG3′;反义引物的序列p4:5′GAGAATTCGCAACCAGGCAGA3′（斜体分别为BamHI、EcoRI的酶切位点）。第1轮用p3、p4作为引物扩增HCVcDNA,第2轮用p2、p4引物扩增第1轮的PCR产物,第3轮用p1、p4引物扩增第2轮的PCR产物。取第3轮的PCR产物0.5μL、pGEMSIMPLET载体0.2μL及Ligati
7、onBuffer3μL混合后,于16℃连接过夜,转化用氯化钙法制备的感受态大肠杆菌TG1。在铺有IPTG及XGal的氨苄青霉素平板上,进行蓝白菌落筛选。挑取白色菌落,用碱裂解法提取质粒DNA,经酶切鉴定及测序证明正确,说明HCVF蛋白基因已被克隆进T载体中,命名为pGEMF载体。 1.2.3重组表达载体pGEXF的构建pGEMF载体用EcoRI及BamHI双酶切后,进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的片断,同时以同样的方法双酶切pGEX4T2载体并回收目的片断。用T4DNA连接酶于16℃连接过夜,并转化用氯化钙法制备的
8、感受态大肠杆菌TG1。在氨苄青霉素平板上于37℃培养过夜。次日随机挑取生长的菌落,以碱裂解法抽提质粒DNA,进行双酶切及测序鉴定,构建pGEXF载体。 1.2.4融合蛋白的诱导表达及纯化将以pGEXF转化的大肠杆菌接种到LB培养基中(含有100mg/L的氨苄青霉素),于37℃摇床振荡培养至A600=0.6～0.8左右。加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG,于37℃诱
