FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一)

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1、FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-FreeSrvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的

2、标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况三仪器设备及耗材（一）仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于

3、杂交室和制备室。10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组

4、织切片等。试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075MKcl、1MHcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。（二）各种溶液的配制2.1：制NaOH溶液a)用天平称取4克分析纯的NaOH固体，置于一只三角烧瓶中。b)用200ml量筒准确取100ml蒸馏水，缓缓注入盛放NaOH固体的三角烧瓶中。c)摇荡三角烧瓶使NaOH固体充分溶解。d)然后缓缓倾倒入250ml广口瓶中，密封保存备用。2.2：配制20XSSC

5、溶液：取氯化钠175.5g和柠檬酸三钠88.2g，加入1000ml双蒸水中，用磁力搅拌棒搅拌，使其完全溶解，用滤纸过滤，调pH为5.3，封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。2.3：配制2XSSC溶液：用20×SSC和双蒸水，按1:9的比例稀释，调pH为7.0,封口膜封好，4℃保存备用，有效期6个月。2.4：2×SSC/0.1%NP-40配制50ml20×SSC(pH5.3)0.5mlNP-40449.5ml双蒸水500ml调pH为7.0,封口膜封好，室温保存备用，有效期6个月。2.5：系列酒精的

6、配制取无水乙醇28ml和34ml，分别与12ml和6ml双蒸水混合，配成70%和85%的酒精，与无水乙醇共同组成70%，85%，100%的系列酒精，封口膜封好，室温保存备用；另配制一上述系列酒精，封口膜封好，-20℃室温保存备用。2.6：PBS缓冲液：PBS1L配方（pH7.4）：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。高温高

7、压灭菌后室温保存。2.7：0.075MKcl低渗液：钾5.59g加入1000ml去离子水中溶解（或Kcl2.794g溶入500ml去离子水中），备用，4摄氏度低温保存。2.8：固定液：按甲醇（AR）：冰乙酸(AR)=3:1的比例配制细胞固定液，细胞固定液现配现用。2.9:1MHcl：取.9ml浓Hcl加去离子到100ml混匀，4℃保存备用。保存1个月。2.10：0.08mg/ml胃蛋白酶工作液：A：取40mg胃蛋白酶，放入1.5MLEP管中，加1ml去离子水溶解，分装到10个200ul离心管中。B：

8、次使用时，在考普林瓶中加50ml去离子水，加入500ul1MHcl，加入一管分装的胃蛋白酶溶液（100ul）。2.11:200ug/mlPK工作液：aPK储存液（20mg/ml）：称取0.1g蛋白酶K干粉溶于2XSSC（PH=7.0）溶液中，轻轻摇动，直至PK完全溶解，不要漩涡混匀。-20℃保存。b蛋白酶K工作液（200ug/ml）：取0.4mlPK储存液溶于40ml2XSSC（PH7.0）溶液中。五实验步骤（一）：羊水样本FISH实验SOP一：标本预处理①：将新鲜收