突变型hGM-CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

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1、2002年6月重庆大学学报(自然科学版)V0I．25No．6第25卷第6期JournalofChongqingUniversity(NaturalScienceEdition)Jun．2002文章编号：1000—582X(2o02)06—0094—04突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达杨红，欧阳克清，郭芝刚，李新平，陈云高，蔡绍皙(1．重庆大学生物工程学院分子生物学实验室，重庆400044；2．四川成都荣高实业集团有限公司，成都610000)摘要：l临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM—CSF相比，利用酵母表达系统生产

2、的hGM—CSF，具有毒副作用小等优点。鉴于非糖基化的hGM—CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM—CSF活『生更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM—CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母(Pichiapastoris)中实现该突变型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM—CSF的活性。关键词：突变型hGM—CSF；毕赤酵母；分泌表达中图分类号：Q786文献标识码：A人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(Human变型基因在毕赤酵母中表达的产物具有天然hGM—Granulocyte—MacmphageCo

3、lonyStimulatingFactor，hGMCSF的活性。—CSF)是由127个氨基酸组成的造血生长因子。hGMl材料和方法—CSF主要生物学功能是刺激造血前体细胞的增殖、分化和增强成熟效应细胞(主要是中性粒细胞、嗜酸性1．1实验材料细胞和单核／巨嗜细胞)。在临床上主要用于骨髓移1)质粒和菌株。质粒pPIC9k，pPIC9K—GM，大肠植、癌症、AIDS、白细胞减少等病症的辅助治疗-1]。杆菌(E．coli)TOPIOF’菌株，毕赤酵母(Pichiapastoris)但在治疗中还存在许多未尽人意之处，如比活性低，治GS115，K

4、MT1菌株，人胎肝cDNA文库均由胡应和博疗时用量大，循环半衰期短等缺点。临床实验表明，酵士惠赠。母系统表达的hGM—CSF与大肠杆菌体系表达的hGM2)培养基和培养条件。大肠杆菌用LB培养基，—CSF相比，具有较小的毒性和副反应发生率¨。J。天在37cc培养。酵母在30cc培养，完全培养基为YPD，然hGM—CSF由于糖基化程度不同，分子量从14．5～选择培养基为RDB，表达增殖培养基为BMGY，诱导32KD不等。根据相关文献报道，临床试验表明未糖表达培养基为BMMY。按照Invitrogen公司操作手册配基化的hGM—CSF的生物

5、活性更高¨。J。由此，实验室制。首次利用引物导入点突变的方法，从eDNA文库中钓3)酶与试剂。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、购出该基因并突变了其中的2个O一糖基化位点，即把自上海生工生物公司，一抗购自Sigma公司，其余试剂9一SerlO—Thr变为9一Alal0一AlaJ。并选择了毕为国产分析纯。引物合成委托胡应和博士在美国赤酵母宿主系统作为表达系统。毕赤酵母表达系统是Hugene公司合成。近年来应用较多的一种表达系统，它具有胞外分泌表1．2实验方法达，外源基因多拷贝重复整合到酵母染色体上，表达稳1)引物的设计与合成。参照发表的

6、人GM—定，产量高，适合高密度发酵，下游纯化相对容易等优CSFcDNA序列，合成了2段引物：点J。是一种良好的表达系统。本实验以野生型hGMprimed5’GCACGT坠GCACCCGCC～CSF基因在毕赤酵母中表达作对照。结果表明，突CGCTCGCCCAGCCCCGCCGCG·收稿日期：2002—02—08作者简介：杨红(1974一)，女，四川开江人，重庆大学硕士研究生。主要从事分子生物学研究。第25卷第6期杨红等：突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达95primer25’GGGAATICTCATCACTCCTGGAC2．

7、1hGM—CSF表达质粒的构建和鉴定TGGC1、C将从低熔点胶中回收的野生型和变异型hGM—在设计5’端寡聚核苷酸引物——引物1时，引入CSF基因用SnalBI和EcoRI双酶切，同时质粒载体了SnalB酶切位点，并且将第9位AGC(Ser)和第l0位pPIC9K也用SnalBI和EcoRI双酶切，分别回收后，连ACG(r)的分别变为GCC(Ala)GCG(Ala)。在设计3’接，转化大肠杆菌ToplOF’。经酶切图谱分析，构建成端的寡核苷酸引物——引物2时，引入了EcoRI酶切功，得到目的基因的转化子。质粒经测序鉴定，与设计位点和2

8、个终止密码子。的序列一致。目的基因的扩增见图1。质粒酶切鉴定2)PCR扩增。94℃，1min；55℃，1rain；72℃，1图谱见图2。表达质粒pPIC9K—GMM和pPIC9K—GMmin，30cycles。低熔点胶回