基于纳米材料的微少突变基因检测技术开发

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1、中文摘要肿瘤是一种威胁人类健康的重大疾病。早期诊断是提高肿瘤治愈率，降低肿瘤患者死亡率的有效途径。肿瘤的发生是基于分子水平上癌基因激活和抑癌基因的失活所致，通过对相关突变基因的检测可以对肿瘤的发生、发展进行有效的诊断和预测。肿瘤患者外周血循环DNA中可检测到与肿瘤细胞一致的基因突变，对这些突变基因的检测能够获取肿瘤的丰富信息，可以作为肿瘤分子诊断的一种重要标志物。由于外周血循环DNA中源于肿瘤细胞的突变基因比例很小，大部分是来源于正常细胞的野生型基因，而且野生型基因与突变基因相比仅有一个碱基的差异，对微少突变基因的检测造成了严重干扰，也对基因

2、检测技术的灵敏度提出了更高的要求。本研究针对外周血循环突变基因检测的要求，开发了两种高灵敏突变基因检测技术，将纳米材料与分子生物学、以及液相芯片和高灵敏电化学发光分析方法有机结合，充分利用纳米磁珠比表面积大，液相反应充分，同时又便于分离的特点，将其作为微少突变基因富集和检测的载体；分别利用等位基因特异性引物和酶促连接反应对微少突变基因进行识别和特异性扩增，结合磁珠对突变基因的分离和富集作用，最大程度地避免了野生型基因背景对微少突变基因检测的干扰；最后分别采用高灵敏的液相芯片和电化学发光分析方法对富集在磁珠表面的突变基因信号进行检测。经过优化后

3、，我们开发的微少突变基因检测技术可检测出样本中低至0．001％的点突变基因，这也是目前相关文献报道的对微少突变基因检测最灵敏的一种技术，达到了世界领先水平。我们开发的微少突变检测技术解决了外周血循环突变基因研究中检测手段灵敏度不足的难题，为外周血循环突变基因的I临床应用奠定了较好的技术基础，作为一种高灵敏、准确的微少突变基因检测技术，在肿瘤筛查、早期诊断、个体化治疗、预后判断、以及复发监控等领域有很好的应用前景。蓑抵循环核酸：纳米材料：外嗣噍：微少突变基因：睁瘤AbstractTumorisoneoftheleadingcausesofdis

4、ease．relateddeathworldwide．Ifthetumorcouldbefoundinearlystage，mostofthepatientsarecurable．Recently,thedetectionofmutationsinthetumorpatients’peripheralbloodhasbeenanactiveresearchfield．Themutationsinthecirculatingnucleicacidofbloodusuallybeartheuncommonvariationsconsistentw

5、iththoseofDNAjsolatedfrOmtumorcells。Thus,thedetectionofthesemutationsmayaffordabundantinformationaboutthestageoftumor,prognosis，anddrugefficiencyoftherapy．HoweveGthemutantallelesrepresentonlyatinyfractionoftotalcirculatingnucleicacidintheblood，insomecasesevenlessthan0．01％．A

6、ctually,therearepredominantwild-typeallelesderivedfromtheapoptosisofnormalcellsinthecirculatingDNA．Theextremelylowfractionandthesubtledifierencewithwild．．typeDNAmakethedetectionoftumor．．derivedmutationinthebloodverydifficult．Althoughavarietyofmethodsfordetectinggeneticvaria

7、ntshavebeenreportedSOfaLitisstillachallengetodetectsuchmutationsamongalargeexcessofwild-typealleles．Wehavedevelopedtwonovelstrategiesbasedonnanomaterialsthatenabletodetectthemutationsamonglargeexcesswild-typealleles．ThemagneticbeadswereusedasthevectorofraremutationsSOthatth

8、emutationscouldbeeaseofcontrolandanalysisInthesolution．Theidentificationandexclusi