慢病毒介导的miRNA302c对腹膜间皮细胞EMT的干预作用及机制研究

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1、分类号UDC博士学位论文慢病毒介导的miRNA-302c对腹膜间皮细胞EMT的干预作用及机制研究EfIfectoflentivirus—mediatedmiRNA一302conEMTofperitonealmesothelialcellsandthemechanism作者姓名：李勰家冀，：科专业：临床医学(内幂：!学)学院(系、所)：湘雅二医院指导教．师：刘伏友教授副指导教师：肖力副教授答辩委员会主席中南大学二。一二年六月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工f仁及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文

2、中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包禽为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共嗣工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文f_}，辱41了明确豹说明。佟者簦熊痴，锡自佟者签名：fj期：年月日学位论文毂权使用授权书Z、／，、j7獬中南大学有关裸留、使j甘学位论文的规定，洚；：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学泣论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众

3、提供信息服务。作者签黔导师盛名删确右作者签名：导师签名：扫期f’耷稠曰摘要研究背景慢性肾脏病(ChronicKidneyDisease，CKD)是全球关注的公共卫生问题之～，国内外发病率逐年上升。约5％的CKD患者最终将发展成终末期肾功能衰竭，需终身接受肾脏替代治疗。其中，腹膜透析(peritonealdialysis，Pn)是符合我国国情的主要肾脏替代治疗方法，但长期PD可引起腹膜纤维化，导致超滤衰竭(ultrafiltrationfailure，UFF)，进而影响PD的长期应用，是患者退出PD的主要原因。转化生长因子13(transforminggrowt

4、hfactor-p，TGF．p)是腹膜纤维化发病机制中的关键因素，近年来多项研究发现腹膜间皮细胞上皮．间充质转分化(epithelialmesenchymaItransition，EMT)在TGF-p诱导的腹膜纤维化中起重要作用，是腹膜纤维化启动和可逆的关键环节。结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)具有促进细胞增殖、迁移和分化等作用，研究证实CTGF通过介导TGF．Dl，或直接作用其下游信号分子，与许多组织器官纤维化的发生发展密切相关。已有研究发现，CTGF不仅在PD腹膜纤维化中起到关键作用，并且在纤维化的始动

5、过程EMT的发生中也起到重要促进作用。microRNAs(miRNA)属于功能性非编码RNA，通过降解目标mRNA或抑制其翻译调节基因转录后水平的表达，参与调控生长发育，细胞分化、增殖、凋亡，肿瘤等疾病的发生发展，是目前生命科学领域的研究热点。有研究证实miRNA是TGF．Dl诱导EMT的重要调节因子，如miRNA一200家族和miRNA一205。但是，miRNA在腹膜纤维化领域的研究尚未见文献报道。近期，我们采用高通道miRNA芯片技术对PD病人腹透流出液腹膜间皮细胞miRNA的表达进行了图谱分析，发现miRNA的异常表达与PD患者腹膜EMT及纤维化密切相关

6、。随着基因治疗技术及基因载体系统的发展，对于PD患者腹膜纤维化的分子机制和干预治疗研究取得了进一步的发展，大量在PD的动物模型中进行的基因治疗研究证实了基因治疗方法在腹膜纤维化规制研究和治疗中的可行性。慢病毒载体(1entiviralvector，LV)作为雷前被广泛应用的基因载体，具有转染效率高，插入外源基因容量大，能感染分裂期和非分裂期细胞，并且不会引起明显免疫和炎症反应等优势，将其应用于腹膜纤维化的研究十分有意义。萋于以生分析，我们认为莱些：mi础闷A霹参与调节腹膜间皮细胞嘲，以慢瘸毒载俸为基因转染工具，从miRNA着手研究其在PD述程中EMT及纤雒讹的

7、作用及分子机制具着重要的理论和现实意●}靛。第一章腹腔注射慢病毒转染，j、鼠黢膜海皮细胞效应的研究目的通过小鼠腹腔注射不同滴度的携带绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)基因的慢病毒，观察其转染小鼠腹膜间皮细胞的效应，探讨腹腔注射慢病毒转染小鼠腹膜问皮细胞最佳效应滴度。方法12周龄ICR雄性小鼠，体重28．30克。随机分为对照组1l(n-5)、LV-GFPl组(n=5)、LV-GFP2组(n=5)、LV-GFP3组(n-5)。分别一次腹腔注射1．5m10．9％生理盐水或者不同滴度的慢病毒。于第28天处死小鼠，壁层腹膜用于HE和

8、Masson染色观察腹膜形态变化、冰冻