电镜冷冻制样技术NEWB

《电镜冷冻制样技术NEWB》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第七章电镜冷冻制样技术第一节冷冻制样的基础知识一金属投影技术二复型技术三电镜冷冻制样技术概述（一）发展概况：1946,Willams建立金属投影技术，主要用于观察颗粒材料，如病毒、细菌、原生动物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子，以及其它非生物材料的微粒和粉末材料。1955，Hall,Huxley提出负染色技术；1959,Horne和Brenner正式命名：Negativestaining，取代了金属投影技术。一金属投影技术目前金属投影技术主要用于：观察不适合负染色但需要金属投影来提高反差的样品

2、；可用于测量颗粒的大小、高度，增加颗粒的尺寸，以改善粒子在TEM的可见性；是复型技术、冷冻断裂蚀刻复型技术的基础。1.金属投影技术的概念：把具有高电子密度的金属材料（Pt，Pd,Au,Cu,Al),加热到其熔点之上，以一定的角度沉积在样品表面形成投影，从而增加样品的反差，并使图像具有立体感。（二）、金属投影基本概念及原理：⑴基本过程：真空蒸发→真空镀膜⑵基本原理：有金属沉积的部位散射能力强，TEM像呈现暗区无金属沉积的部位散射能力弱，TEM像呈现亮区⑶基本特点：图像反差明显，富有强烈的立体感样品被

3、“包埋”在金属膜中，即样品表面被金属粒子覆盖，其图像分辨率由金属粒子大小限制，样品表面细微机构看不清，只能看到表面形貌。不能分辨杂质和病毒，造成鉴定上的困难，故对病毒样品的纯度要求较高2.基本原理及特点：真空镀膜仪：10－4～10－5Torr⑴仪器结构真空钟罩：玻璃或金属钟罩；两组电极（碳电极、金属电极）；样品台。真空系统：两级泵真空系统，10－4～10－5Torr加热电流供给系统：大电流变压器，提高40－50A电流。⑵真空的作用：防止样品受到热传导和对流引起的热损伤。防止样品受到金属氧化而引起的污染。

4、3.所用仪器⑴.具有高电子密度，和较高的电子散射能力⑵.在喷镀层中金属颗粒细小，分布均匀，高温下不升华，经久耐用⑶.在电子束作用下，金属不会粒状化⑷.化学稳定，不与样品反应⑸.熔点低，易于蒸发4.选用金属的标准5.常用的金属：⑴Pt，Pd，Pt-Pd,Au,颗粒细10Å用于很小或很薄的生物材料，如病毒、核酸、蛋白质分子等。⑵Cu，Cr（铬的合金），颗粒粗20Å，用于对分辨率要求不高的较大样品，如细菌等1、一次投影A、样品的准备：制备样品悬液→滴样品液→摆载网→放入真空镀膜仪B、金属的选取：蒸发材料有粒状、

5、块状、细丝状、薄片状高分辨率的样品：粒度较细的Pt，Pt-C，Pt-Pd合金一般的样品：粒度粗、易蒸发，低价的Cu，Al，Cr（三）、方法：C、投影角度θ的调整调整原则：样品越细小，θ↘，如核酸5～9°，细菌30°病毒、噬菌体12－15°注意：样品与蒸发源的直线距离>10cmD、金属投影先喷3s~4min,厚10~20nm再90°垂直喷碳，加固E、样品颗粒大小的测量h:颗粒高度θ:投影角度l:照片上投影长度M:放大倍数H:蒸发源的高度L:蒸发源与样品的水平距离2、二次投影一次投影之后，将样品旋转180

6、°，再次投影3、旋转投影:金属蒸发时,样品30～60转/min适于：极小颗粒金属投影的电镜图像样品的颗粒呈黑色，投影区呈白色金属投影与日光投影的比较唯一一种能用TEM观察样品表面方法1、适用范围:金属材料,矿物质、化合物表面坚硬的生物材料：骨骼、牙齿、种子、孢子、花粉、木材2、定义：用电子透明的薄膜将某些坚硬材料表面结构“铸印”下来，复制的这层薄膜就是样品表面结构的一个“模子”，称之为复型（Replication)。二、复型技术（一）、技术概述3、优点：⑴分辨率极高，研究样品表面精细结构；⑵制样简单，不损

7、伤样品，图像具有立体感，⑶在TEM下可以观察样品天然表面或人工断面的细微结构特征。1、一级复型（负复型）基本描述：先用有机材料直接在样品表面印制复型，再将复型膜剥离样品，金属投影来增加反差。常用介质：0.5～1%火棉胶醋酸戊酯溶液或0.5%formvar氯仿溶液基本步骤：滴加福尔莫瓦溶液→成膜→漂膜→洗膜→捞膜→金属投影和喷碳加固→观察基本特点：分辨率高，20～50Å，人工假象少；复型膜软，剥离时易变形，且不易与样品分离（二）、制样方法2、预投影一级复型基本描述：直接在样品表面进行金属投影和喷碳，制成碳复

8、型膜，再化学法溶解掉样品，将复型膜打捞在载网上。典型方法：石蜡－铬预投影一级复型法基本步骤：准备材料→喷铬喷碳→石蜡补强→溶木材→脱蜡基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一级复型，剥离后以此为模板，进行金属投影和喷碳，制成二级碳复型，最后溶去一级有机复型膜，留下二级碳复型膜。常用方法：AC纸-C二级复型法基本步骤：贴AC纸→样表结构铸印于AC纸→揭下AC纸（一级复型）→用石蜡将AC纸粘于玻板→金属投影与喷碳（二级复型）→溶