冷冻电镜技术.doc

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1、冷冻电镜技术一、课程所讲基础知识回顾1、电子显微镜成像技术的发展历史（1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）：该技术的原理为重金属燃料与H结合,特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。（2）上世纪60年代的三维重构技术三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维

2、结构。显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。（3）上世纪70年代的电子晶体学即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）主要原理为将样品快速冷冻在

3、玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液屮相同，呈天然状态。因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。（1）关于玻璃态冰：冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率冇关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。（2）操作步骤概要：冷冻包埋一一转移至液氮或液氮屮一一观测，图像采集一一三维重构（3）图像采集的质量要求：应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。此外，特别应注意的是，该方法

4、对电子剂量很敏感，最适为10e/A2,明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。因此，必须采用低剂量技术（W20e/A2）,用lk-3k倍的低倍镜寻找,在冃标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（Is左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。1＞冰晶河染冰晶污染是冷冻电镜的主要问题和最重要的难点，可发生在冷冻电镜的各个步骤。在每个步骤中，冰晶污染的形成的主要原因不同。在冷冻制样阶段，冰晶污染形成的原因主要冇三点：（1）冷冻速率不够；（2）冷却剂的温度未接近凝点；（3）容器边

5、缘的小冰晶坠入液氮中.黏附在样品上，或在样品转移过程，空气中的水分子凝结在样品表面。2、电子辐射损伤电子辐射损伤的原因儿乎均可归结为热效应，被辐照区域的损伤大致可分为晶化、升华、起泡和漂移4种类型。（1）晶化与电子束的加速电压和电子剂量冇关，一般发生在样品表面，玻璃态的冰晶化形成立方晶相，失去各向同性。（2）升华一一也发生在样品表面，本身现象与电子剂量无关，但是升华速率与电子剂量有关.电子辐射会增加样品表面分子的动能，从而增加样品表面分子脱离样品表面的几率。（3）起泡一一对于较厚的含水样品。非弹性散射将造成能量沉积，大部分发生在

6、接近样品表面的内层，此外，水是热的不良导体，因此会岀现起泡现象。随电子剂量的增加，起泡的范围和形态也会冇所不同。（4）漂移一一样品的物理漂移来自于样品本身的形变，而样品的象漂移原因为电子在样品内的沉积，对电子束的偏转方向产生影响。一般来说，使用尽可能低的电子剂量和尽可能小的照明光斑是避免上述四种辐射损伤的最佳方法。3、图像去噪由于冷冻电镜特殊的低电子剂量和低衬度成像技术，使得图像反差弱,信噪比低，不易提取冇效的结构信息。而滤波是图像去噪的主要方法。其原理为将信号和噪声都视为随机信号，利用它们不同的统计特征，通过最小方差估计某点的

7、最似信号类型，若为噪点则予以除去。此外，图像增强和图像复原也可相对地减轻噪点对信号图像的影响,其屮图像增强是将人们主观感兴趣的部分亮度提高，而图像复原则是针对图像中客观存在，但受到了噪点干扰(称为退化)的样品信号，将它们的结构性信息予以恢复。对于图像增强，一般会综合采用滤波、掩模、灰度变换、直方图均衡化等方法对感兴趣区域的信息进行增强；而图像复原的典型方法是根据先前的样品经验，建立一个退化模型，以此模型为基础采用滤波等手段处理,使得复原后的图像符合一定的准则，达到改善图像质量的目的。其中信嗓比是评价图像复原程度的主要标准之一。参

8、考资料：[1]尹长城老师《现代生物医学成像技术》选修课内容[3]ChengL,SunJ.etal.Atomicmodelofacypovirusbuiltfromcryo-EMstructureprovidesinsightintothemechanismofm