放射性配体受体结合试验

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1、放射性配体受体结合试验1、定义:放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassayofreceptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。2、原理:1）、放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。2）、放射配基与受体制备物（含受体的组织或细胞制备物）作用时，其结合形式有两种，一种是配基与受体的特异性结合，其特

2、点是亲和力高；且由于受体有限，故具有饱和性。另一种是配基与受体制备物的非受体分子的结合，称为非特异性结合。其特点是亲和力低但结合点多，不易饱和。用放射性配基研究特异性受体时，必须设法减除非特异性结合。一般采用的方法是制备总结合管和非特异结合管，两者计数之差即为特异性结合量。总结合管：将放射性配基与受体制备物反应，除去游离的放射性配基，测定结合的放射性配基的计数，（其中包含特异性结合与非特异性结合，称为总结合）。非特异性结合管：将大量（一般为500－1000倍）非标记特异性配基与标记的放射性配基相混，然后共同与受体制备物反应。由于非标记配基与标记配基两者比例悬殊，所以受体几乎全

3、部被非标记配基饱和，标记配基只能与组织制备物中的非特异结合位点结合。这时测出的标记配基的结合量，反映的是非特异结合量。用总结合管的计数减去非特异结合管的计数，即可得到特异结合计数。3、分类：RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量

4、）。4、实验材料:动物组织仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）材料（2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）药品（放射性配基、各种非标计化合物等）5、实验具体步骤：1）、配制各种缓冲液及试剂按处方配比配制各种缓冲液贮备液配制各种非标记配体溶液配制各种受试药物溶液注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、M

5、ethysergide、Butaclamol及5HT等2）、制备膜受体分离出目标组织加10倍体积Tris-HCl溶液冰冷的缓冲液,用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保存备用。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机试剂：超纯水3）、加样：取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度按以下顺序及比例加入各种反应液。（1）总结合管：1

6、00ul膜受体+200ul缓冲液+10ul放射性配体（2）非特异管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10ul放射性配体（3）受试物管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10ul放射性配体注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液4）、受体配体结合反应：以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：恒温水浴锅，制冰机试剂：无5）、分离游离及结合的放射性配体上述各管在反应结束后，分别倒入

7、抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯试剂：甲苯、PPO、POPOP6）、测定结合型放射配体每分钟放射计数采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：液闪仪试剂：无7）、数据处理按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（总结合管cpm—化合物cpm）/（总结合