高效液相色谱电喷雾质谱联用分析

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第4期2010年4月ChineseJournalofAnalyticalChemistry532～536DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00532高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析亚硝基脲导致的DNA股间交联*白宝清赵丽娇钟儒刚(北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100124)摘要为了探讨亚硝基脲类抗癌药物对DNA的股间交联作用，以合成的1-［N-(2′-脱氧胞基)］-2-［N-(2′-脱氧鸟基)］乙烷(dG-dC)为标准品，使用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HP

2、LC-ESI-MS/MS)方法测定了小牛胸腺DNA中1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)导致的DNA股间交联物。DNA样品经过变性、酶解和离心过滤后，以乙酸铵溶液和乙腈为流动相，经C18反向色谱柱分离。样品经电喷雾离子源(ESI)正离子化后，采用质谱一级和二级全扫描进行定性分析;采用选择反应扫描(SRM)方式，以m/z521→289作为检测的离子碎片，测定DNA样品中dG-dC的含量。本研究为DNA股间交联的定性和定量分析提供了有效的方法。关键词亚硝基脲;DNA股间交联;高效液相色谱-电喷雾串联质谱1引言［1］亚硝基脲(N

3、Us)是临床上一类重要的抗癌烷化剂，广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗。NUs能够［2］引起癌细胞DNA的损伤，进而影响其复制、转录和重组等。其中，导致DNA互补碱基对之间的横向［3，4］交联是一种重要的损伤形式，它能够诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抗癌的目的。氯乙基亚硝基脲［5～7］(CENUs)是典型的NUs类抗癌药物，其抗癌机制与导致互补的鸟嘌呤与胞嘧啶之间形成共价交联密切相关。CENUs引起DNA股间交联的反应主要包括两个步骤:首先，CENUs分解产生氯乙基正离66子，然后与DNA一条链上的鸟嘌呤O位点发生烷化反应，形成O-(2-氯乙基)

4、鸟嘌呤;烷基鸟嘌呤经3过自身环化的中间体再与DNA另一条互补链上的胞嘧啶N位点发生反应，形成1-［N-(2′-脱氧胞［8～12］基)］-2-［N-(2′-脱氧鸟基)］乙烷(dG-dC)二元股间加合交联产物。由于dG-dC在DNA中的含量［13］较低，有关dG-dC交联物定量分析的研究目前还未见报道。高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)方法因其具有检测灵敏度高、定量准确等优点，因此成为生物大分子损伤相关研究中的重要手段。为了探讨NUs类抗癌药物对DNA的股间交联作用，使用HPLC-ESI-MS/MS方法对1，3-双

5、(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)导致的DNA股间交联物进行了定性和定量分析。本研究对于评价DNA损伤程度的检测方法，阐明股间交联与抗癌作用之间的关系具有重要意义。2实验部分2.1仪器与试剂TSQQuantum高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪(美国Thermo-Fisher公司);6位恒温平行合成仪(美国J-KEM公司);Eppendorf5355恒温振荡混匀器(德国Eppendorf公司);Z-323K高速冷冻离心机(德国Hermle公司)。小牛胸腺DNA、蛇毒磷酸二酯酶、甲醇和乙腈(美国Sigma公司);脱氧核糖核酸酶I(DNa

6、seI)、牛肠碱性磷酸酶(CIAP)和S1核酸酶(TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司);MicroconYM-10微孔离心过滤器(美国Millipore公司)。无水乙醇(天津市福晨化学试剂厂);超纯水(自制，美国Pall公司超纯水系统)。2.21-［N-(2′-脱氧胞基)］-2-［N-(2′-脱氧鸟基)］乙烷(dG-dC)标准品的合成称取650mg(2.5mmol)2′-脱氧鸟苷(2′-deoxyguanosine)于250mL圆底烧瓶中，然后依次加入2009-07-10收稿;2009-11-14接受*E-mail:zhaoliji

7、ao@bjut.edu.cn第4期白宝清等:高效液相色谱-电喷雾质谱联用分析亚硝基脲导致的DNA股间交联533100mL无水吡啶、2.4mL(25mmol)醋酸酐、30mg(0.25mmol)4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和3.8mL(28mmol)三乙胺，于50℃搅拌反应30h，得到棕黑色溶液。反应结束后，加入20mL冷水冷却溶液，减压蒸去吡啶和水。再加入40mL去离子水，溶液浓缩，冷却后析出黄色晶体。过滤，重结晶，得到中间产物N-2，3′，5′-三乙酰基-2′-脱氧鸟苷。称取540mg(1.3mmol)N-2，3′，5′-三乙酰基-

8、2′-脱氧鸟苷于100mL圆底烧瓶中，加入无水吡啶溶解，减压蒸去吡啶，向圆底烧瓶中依次加入6mL无水二氧杂环己烷、1260mg(4.8mmol)三苯基膦、750μL(4.8mmol)偶氮二甲酸二乙酯和312