高效液相色谱法测定食品中的维生素D

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1、高效液相色谱法测定食品中的维生素D张燕婉王津生（中国肉类食品研究中心北京100075）最普遍使用的方法是先用乙醇-氢氧化钾溶液1前言将样品皂化，然后用有机溶剂萃取其中的非皂化物。在皂化过程中应控制条件，避免过热引起的组分异维生素D（Vit.D）在人体骨胳组织矿化代谢过构化。又由于Vit.D在空气中易氧化分解，在食物样程中起着十分重要的作用，它不仅促进钙与磷在肠品中含量较低，皂化时可加入一些抗氧化剂以阻止道的吸收，而且也作用于骨质组织，促进钙磷最终形氧化。为避免皂化带来的问题，有人曾采用过夜冷皂成骨质的基本结构。当Vit.D缺乏时，

2、会导致人体患化（或萃取前不皂化的办法（3）佝偻病和软骨病等。Vit.D是一群结构类似的类固纯化是Vit.D预处理方法中关键的一步，处理醇的衍生物。目前的研究已经表明，化学上已有十多不当会产生大量的聚合物。当然也有像Agarwal种类固醇具有Vit.D的生理活性，但其中最重要的等（7）那样，不进行纯化，而是采用样品与三氯化锑是Vit.D3（胆钙化醇）和Vit.D2麦角钙化醇）以及它们的代谢产物（如1,25-(OH)2-D3,25-OH-D3)。（SbCl3）反应，使强化牛奶中存在于非皂化物中的维生素，转变为等规聚合物（isotach

3、ysteols），这种衍生物能够在301nm波长处被测到，且不受其它物质的干扰。纯化的方法随食品的原料和种类而有所不同。例如，对于强化的鲜牛奶和奶粉，在进行HPLC分析之前，可用半制备型的氰基键合相色谱柱进行提纯；而对于饲料样品需要采用两步提纯：即先用氧化铝（Al2）的色谱柱将Vit.D与Vit.E、胡萝卜素分开，再用RP-18半制备柱进行Vit.D的纯化。Vil-目前测定维生素D的方法主要有高效液相色lalobos等（）和Romanov等（9）也都用氧化铝色谱柱谱法（HPLC），薄层色谱法（TLC）和气相色谱法提纯玉米片、沙丁鱼

4、和植物中的Vit.D。Bekhof（GC）。在过去的几年里，虽然曾用开管柱、TLC法等（11采用两步梯度HPLC系统，在氰基键合相上进行纯化，将氰基柱直接连在分析柱的六通阀上。制备和GC法进行Vit.D的分析，但近五年里这几种方型RP-18液相色谱柱多用于婴儿食品和蘑菇中法没能得到进一步的发展。相反，HPLC法分析Vit.D在近十年里经过持续不断的研究，得到了很大的Vit.D的分离；Laffi（0，用RP-8柱提纯饲料中的发展，已成为目前测定机体中生物活性很小的Vit.Vit.D。Takamura等（）则先用TLC粗分离蘑菇中的D

5、含量的最有效和最普遍的分析方法。Vries（1,2）等Vit.D2，再用HPLC进一步提纯，最后用热喷雾HPLC-MS仪对Vit.D2进行分离、检定。Hung等（3）人经过大量验证实验，建立了两种完善的分析方法，已被美国AOAC组织采用，定为正式的方法，并被为了省去皂化以减少Vit.D的异构化，把提纯增加到四步，即：（1）二氧化硅柱的提纯，（2）聚四氟膜过作为1993年出版的《美国营养标签分析方法》一书中维生素D的分析方法（1。滤，（3）凝胶色谱柱提纯，（4）NP-HPLC半制备柱提纯。这些步骤被认为对于D2,D3含量低的多复杂成

6、2样品的预处理分的样品尤为必要。HPLC法测定Vit.D用于食品分析不同于药物3高效液相色谱分析分析。后者可以将药物的Vit.D提取液直接注入色谱柱，而食品分析需先进行皂化和纯化，并经过适当用HPLC法可以分离测定Vit.D2和Vit.D3的异构体、光异构体及其代谢产物，而且正相色谱的色谱柱预先净化后才可进行。各种预处理方法见表1。（NPC）和反相色谱（RPC）都可用于总Vit.D的分本文收稿日期：1993年12月22日，修回日期：1994年3月3日析，见表2。AOAC规定：正相色谱法获得的Vit.D定Vit.D多采用UV检测，可

7、固定254nm波长，也结果，必须对其皂化中由于加热引起的异构化影响可多通道选择，在260nm或310nm处测定。Delgado带来的测定误差加以校正（校正因子：1.25）。Vil-等（13）采用电化学检测器同时分析牛奶中的Vit.D3lalobos等（4通过对八种代表性样品（食品、饲料和医Vit.A和Vit.E，样品皂化后，经萃取可直接注入色药）的Vit.D分析，比较三种不同固定相，柱A:SI-谱分析柱，省去了纯化这一步。Takamura（）采用热60silica，柱B:Vydac201TPBC18，柱CODSC18对喷雾液相-质

8、谱仪（TSP-MS）测定蘑菇中的Vit.D2。Vit.D的分离结果，发现：色谱分离柱B和柱C能将HPLC法分析Vit.D时色谱条件的选择（NP或RP）D2,D3分离开，而柱A只能测定总Vit.D的量。这说取决于分析的对象和目的。对于总Vit.D的分