表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建与免疫原性分析

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1、表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文

2、进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日I表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究II表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究摘要奶牛乳房炎是影响奶牛生产性能的一种重要疾病，据统计该病占到奶牛一般疾病导致的直接损失的38%。由于我国奶牛以农户散养为主，饲养管理、卫生等措施不完善等，奶牛乳房炎导致的经济损失要远高于38%。国内外学者研究发现，引起奶牛乳房炎的微生物除了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌外，链球

3、菌也是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一。据统计，链球菌性乳房炎发病率为11%-47%。而传统链球菌预防研究主要集中在灭活苗和弱毒活苗上，但效果不理想。因此急需一种有效疫苗来防控该病。为此本实验采用基因工程方法构建能表达链球菌保护性抗原的基因工程疫苗。1.链球菌保护性抗原基因GapC和SIP的克隆与序列分析。从SHZ1株无乳链球菌基因组中以PCR方法分别克隆出保护性抗原基因GapC和SIP，然后分别连接到T载体上进行测序。结果显示，该菌株GapC基因与GenBank上公布的停乳链球菌GapC基因(序列号为AF375662.1)同源性为99.70%，有3个碱基突变，氨基酸序列

4、有2个发生突变同源性为99.4%。SIP基因与GenBank上公布的无乳链球菌SIP基因(序列号为DQ650634)序列同源性为98.62%，有17个碱基发生突变。氨基酸序列的同源性为98.15%，有8个氨基酸发生突变。2.链球GapC基因重组痘苗病毒rVV-GapC和链球菌SIP基因重组痘苗病毒rVV-SIP的构建、纯化与鉴定。将pMD18-T载体上鉴定正确的目的基因用单酶切酶SmaI切下，连接到pSC11载体上，然后测序鉴定目的基因是否正向连到载体上。经过测序判定目的片段正向插入载体上，并且与原序列同源性100%，构建pSC11-GapC,pSC11-SIP成功。下

5、一步将构建好的pSC11-GapC和pSC11-SIP质粒用脂质体法分别转染已感染痘苗病毒的BHK-21细胞，转染后待目的基因与痘苗病毒基因组随机重组，反复冻融收毒。将所收毒液按不同稀释梯度采用蓝白斑筛选法连续筛选5代，得到较纯化的重组痘苗病毒。采用PCR技术、RT-PCR技术、SDS-PAGE、WB技术检测经纯化后得到的重组痘苗病毒，经检测目的片段重组到了痘苗病毒基因组上，重组痘苗病毒rVV-GapC和rVV-SIP构建成功并能正常增殖转录翻译。3.重组痘苗病毒rVV-GapC和rVV-SIP的生长特性、安全性及免疫原性研究。用BHK-21细胞做重组毒TCID50测试

6、，结果显示重组毒与痘苗毒相比，致细胞病变能力没有下降，生长特性没有受到影响。小鼠接种重组毒后没有可见临床副作用，初步说明重组毒具有安全性。对小鼠进行重组毒免疫接种后再用链球菌攻击，与对照组相比，小鼠存活率较高，说明重组毒对小鼠具有一定的免疫保护作用。本研究为链球菌性奶牛乳房炎的疫苗研究奠定了基础。关键词：SHZ1株链球菌，GapC基因，SIP基因，痘苗病毒，rVV-GapC，rVV-SIPI表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究II表达链球菌主要保护性抗原的重组痘苗病毒的构建及免疫原性研究AbstractsBovinemastitisisoneoft

7、hemostimportantdiseasesthatdecreasedtheirperformance.Accordingtothestatistics,mastitisaccountsfor38%oftotalcostofallclinicaldiseases.Furthermore,duetoscatteredbreedingofdairycowsandpoormanagementandhygienearedominantinChina,theeconomiclosscausedbymastitisismuchgreaterthan