表达水泡性口炎病毒g蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析

《表达水泡性口炎病毒g蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

密级：论文编号：中国农业科学院学位论文表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析StudyontheConstructionandImmunogenictiyofRecombinantAdenovirusExpressingGProteinofVesicularStomatitisVirus硕士研宄生：薛晓娟指导教师：李刚教授申请学位类别：农学硕士专业：葡贈医学研宄方向：与培养单位：北京畜牧兽医研究所研宄生院2015年5月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：辱时间：城年上月巧日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研宄生签名:时间：>/j：年i:月7日导师签名:时间:年$•月以|曰 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析动物重大疫病论文作者薛晓娟专业预防兽医学研宄方向的诊断与防控指导教师李刚培养单位（研究所）北京畜牧兽医研宄所姓名职称硕（博）单位专业签名评硕导口孙怀昌教授扬州大学预防兽医学博导口阅副研宄硕导口蒋桃珍中国兽医药品监察所预防兽医学人员博导口答辩主席硕导口毛开荣研宂员中国兽医药品监察所预防兽医学博导口硕导口毛开荣研宂员中国兽医药品监察所预防兽医学博导口硕导口中国农业科学院北京畜崔尚金研究员预防兽医学博导口牧兽医研究所答硕导口中国农业科学院北京畜朱鸿飞研究员博导口牧兽医研究所辩硕导口郑瑞峰研究员北京市畜牧总站博导口委硕导口何宏轩研究员中国科学院动物研究所.口博导口贝会议记录（秘书）袁维峰论文答辩时间地点2015年5月25日北京畜牧兽医研宂所科辅楼202会议室 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudyonConstructionandImmunogenictiyofRecombinantAdenovirusExpressingGProteinofVesicularStomatitisVirusM.S.Candidate：XueXiaojuanSupervisor：Prof.LiGangMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:Diagnosis,PreventionandControlofMajorAnimalInfectiousDiseasesMay2015 摘要水泡性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV))引起的高度接触性人畜共患的重大传染性疫病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定通报传染病，也是《中华人民共和国进出境动植物检疫法》规定的进境动物二类传染病。目前，该病还没有有效的治疗方法，只能通过疫苗进行防控。在疫苗研究方面，国内外已有一些研究，但新型疫苗的研究有待进一步开发。VSV糖蛋白(G)定位在包膜的突起上，刺激机体产生中和抗体,呈现型乃至株的特异性，是研究VSV基因工程疫苗的首选抗原。本研究利用人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体，构建了表达VSV单一血清型的G蛋白及两血清型G蛋白融合蛋白的重组腺病毒，并对其免疫原性进行了初步分析。本研究设计了三对分别扩增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因的特异性引物，利用PCR技术扩增VSV-IN-G基因及VSV-NJ-G基因；通过GlyGlyGlyGlySer多肽序列的连接，利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因。将三个目的基因分别克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMVK-NpA中，构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒。利用PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定筛选阳性重组质粒。将鉴定正确的重组穿梭质粒分别用PacI酶线性化后，与同样用PacI酶线性化的骨架载体pacAd59.2-100共转染AAV-293细胞，成功包装出了三株重组腺病毒rAd-VSV-NJ-G,rAd-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。将三种重组腺病毒分别接种于AAV-293细胞，连续传代至20代，测定其TCID50，效价均稳定。利用间接免疫荧光和westernblot检测方法检测目的蛋白的表达，结果显示G蛋白在重组腺病毒中均可以正确表达，且具有良好的反应原性。为了评价三株重组腺病毒的免疫效果，本研究选取50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为5组，每组10只。将三株重组腺病毒分别以2周为间隔，肌肉注射及皮下注射接种小鼠3次。于首次接种后0,2,4,6周采集血液分离血清，利用间接ELISA检测VSV特异性抗体水平，结果显示均可诱导小鼠产生VSV特异性抗体。以病毒中和试验检测中和抗体水平，其中和抗体水平均在1:16~1:32之间。利用淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平，结果表明均可以引起接种小鼠强烈的淋巴细胞增殖效应，且明显高于阴性对照组。以上结果表明，所构建的三株重组腺病毒可以很好地表达目的蛋白，接种小鼠可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应，为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。关键词：水泡性口炎病毒；G蛋白；重组腺病毒；免疫原性分析III AbstractVesicularstomatitis(VS)isanacutehighlycontagioushumanzoonoticinfectiousdiseasecausedbythevesicularstomatitisvirus(VSV).ItwasclassifiedasanotificationdiseasebyOIE,anditisoneoftheClassⅡanimaldiseasesinChina.Now,thereisnoeffectivetreatmentforthediseaseanditcanonlybepreventedandcontrolledbythevaccine.Someresearchesofvesicularstomatitisvirusvaccineshavebeendoneathomeandabroad,buttheresearchofnewvaccinesneedsfurtherdevelopment.VSVglycoprotein(G)positionsontheprotrusionsoftheenvelopeandstimulatestheproductionofneutralizingantibodies,aswellaspresentingthespecifictypestrains,isthepreferredantigenforVSVengineeredvaccineresearch.Inthisstudy,weconductedtherecombinantadenovirusexpressedtwoserotypesGproteinsandthefusionproteinofVSVGproteinbyahumantype5replication-defectiveadenovirusexpressionvectorandconductedthepreliminaryanalysisoftheirimmunogenicity.ThreeparisofprimersweredesignedtoamplifytheVSV-IN-G、VSV-NJ-GandVSV-IN-NJ-Ggenes.WeamplifiedtheVSV-IN-GgeneandVSV-NJ-GgenebyPCRandamplifiedtheVSV-IN-NJ-GgenebyoverlappingPCRwiththepolypeptidesGlyGlyGlyGlySer.ThethreegeneswereclonedintotheadenovirusshuttlevectorpacAd-CMVK-NpAtoconstructtherecombinantshuttleplasmidscontainingthetargetgenes.TherecombinantshuttleplasmidswereidentifiedbyPCR,restrictionandsequencing.TherecombinantshuttleplasmidsandadenovirusbackboneplasmidlinearizedwithPacⅠrestrictionenzymewerecotransfectedtotheAAV-293cellsandthethreekindsofrecombinantadenovirusrAd-VSV-IN-G，rAd-VSV-NJ-GandrAd-VSV-IN-G-NJ-Gwerepackagedsuccessfully.ThethreekindsofrecombinantadenovirusinoculatedintotheAAV-293cellswereseriallypropagatedto20generationsandthevirustiterswerestablebydetermineingtheTCID50.Byindirectimmunofluorescenceandwesternblotdetectionmethodfordetectingtheexpressionofthetargetproteins,itshowedthatGproteinscanbeexpressedandshowedgoodreactogenicity.Inordertoevaluatetheimmuneaffectionoftherecombinantadenovirus,thestudyselected50、6-8-week-oldfemaleBALB/cmice,whichwererandomLydividedintofivegroups,eachgroupof10.Themicewererespectivelyinoculatedsubcutaneouslythreetimesat2-weekintervalswithrecombinantadenovirus.Afterthefirstinoculation0,2,4,6weekscollectedserumtodetectthespecificantibodylevelsbyindirectELISA.TheresultsshowedthatthethreegroupsalsocaninducetheproductionofVSV-specificantibodies.Invirusneutralizationtestfordetectionofneutralizingantibodylevel,theantibodylevelswere1:16to1:32ofthreegroups.TheresultsofLymphocyteproliferationtesttodetectlevelsofimmunecellsshowthatthevaccinescancauseastrongimmunemouselymphocyteproliferation,andaresignificantlyhigherthanthenegativecontrolgroup.Theseresultsshowedthatthethreekindsofrecombinantadenoviruscanexpressforeignproteinsverywell,andtheproteinscancauseacertaindegreeofhumoralandcellularimmuneresponsesinimmunizedmice,laidafoundationforfurtherstudiesoftherecombinantadenovirusvaccinesexpressingVSVglycoprotein.Keywords:VSV;GProtein;Recombinantadenovirus;ImmunogenicityIV 目录第一章引言............................................................11.1流行概况及危害....................................................11.2病原及其理化性质..................................................21.3病毒基因组结构及其结构蛋白........................................31.4VSV疫苗研究进展..................................................51.4.1灭活苗........................................................51.4.2弱毒苗........................................................51.4.3亚单位疫苗....................................................61.4.4基因工程疫苗..................................................61.5重组腺病毒疫苗研究进展............................................61.5.1腺病毒........................................................61.5.2复制缺陷型腺病毒载体..........................................71.5.3腺病毒载体在疫苗研究中的应用..................................71.6本研究的目的和意义................................................8第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定..................92.1材料和方法........................................................92.1.1菌株、细胞及质粒..............................................92.1.2主要试剂......................................................92.1.3主要的仪器设备...............................................112.1.4实验所用主要试剂及配制方法...................................112.2实验方法.........................................................142.2.1引物设计.....................................................142.2.2Vero细胞的培养..............................................142.2.3VSV-NJ的增殖................................................152.2.4VSV-NJ病毒RNA的提取........................................152.2.5VSV-NJ-G基因的RT-PCR扩增...................................162.2.6VSV-IN-G基因的扩增..........................................16V 2.2.7VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增.....................................172.2.8E.coliDH5α感受态细胞的制备................................182.2.9将目的基因克隆至T载体.......................................182.2.10重组腺病毒穿梭质粒的构建....................................192.2.11大量提取重组穿梭质粒及骨架载体质粒..........................202.2.12重组腺病毒的构建............................................212.2.13重组腺病毒的鉴定............................................222.2.14重组腺病毒的扩增及遗传稳定性分析............................242.2.15重组腺病毒G蛋白表达的鉴定..................................242.3实验结果与分析...................................................252.3.1VSV-NJ-G基因的扩增..........................................252.3.2VSV-IN-G基因的扩增..........................................262.3.3VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增.....................................262.3.4重组腺病毒穿梭质粒的构建.....................................272.3.5重组腺病毒的构建.............................................272.3.6重组腺病毒的扩增与遗传稳定性分析...............................292.3.7Westernblot检测G蛋白的表达..................................292.3.8间接免疫荧光检测...............................................302.4讨论.............................................................31第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒对小鼠的免疫原性分析...................333.1实验材料.........................................................333.1.1细胞及病毒...................................................333.1.2试剂及实验动物...............................................333.1.3主要仪器设备.................................................333.2实验方法.........................................................333.2.1实验动物的选择和分组.........................................333.2.2免疫原的制备.................................................343.2.3动物免疫程序.................................................343.2.4免疫后样品采集...............................................34VI 3.2.5抗VSV特异性抗体的检测.......................................353.2.6免疫小鼠中和抗体的检测.......................................353.2.7免疫小鼠T淋巴细胞增殖试验...................................363.3结果.............................................................373.3.1抗VSV特异性抗体的检测.......................................373.3.2免疫小鼠中和抗体的检测.......................................373.3.3免疫小鼠淋巴细胞增殖试验.....................................393.4讨论.............................................................40第四章全文结论.......................................................42参考文献..............................................................43致谢................................................................50作者简历..............................................................51VII 图表目录图1.1VSV病毒粒子电镜图................................................3图1.2VSV结构示意图...................................................4图2.1穿梭载体pacAd5CMVK-NPA图谱(6217BP,氨苄抗性)..................10图2.2骨架载体pacAd59.2-100图谱(34947BP,氨苄抗性).................10图2.3VSV-NJ-G基因的RT-PCR扩增.......................................25图2.4VSV-IN-G基因的PCR扩增..........................................26图2.5VSV-IN-G-NJ-G基因的PCR扩增.....................................26图2.6重组腺病毒穿梭质粒的酶切鉴定....................................27图2.7重组腺病毒感染AAV-293细胞病变效应..............................28图2.8重组腺病毒的PCR鉴定............................................28图2.9不同代次重组腺病毒的PCR鉴定....................................29图2.10Westernblot检测VSVG蛋白在重组腺病毒感染293细胞中的表达....30图2.11Westernblot检测融合蛋白在重组腺病毒感染293细胞中的表达......30图2.12间接免疫荧光检测VSVG蛋白的表达................................31图2.13间接免疫荧光检测融合蛋白的表达.................................31图3.1小鼠免疫后血清中特异性抗体水平的变化............................37图3.2小鼠免疫后淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖反应....................40表2.1PCR扩增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因ORF的引物........14表3.1重组腺病毒免疫小鼠程序..........................................34表3.2VSV-INTCID50的测定..............................................38表3.3VSV-NJTCID50的测定..............................................38表3.4VSV-IN毒株检测重组腺病毒诱导产生VSV中和抗体....................39表3.5VSV-NJ毒株检测重组腺病毒诱导产生VSV中和抗体....................39VIII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepairs碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白BHK-21Babyhamsterkidneycelllin幼仓鼠肾细胞系dDay天ddH2ODoubledistillateH2O双蒸水DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺DMEMDulbecco’smodifiedeagle’smediumDMEM培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖三磷酸DNADeoxyribonucleosideacid脱氧核糖核酸E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbnentassay酶联免疫吸附试验FBSFetalbovineserum胎牛血清hHour小时HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验IPTGisopropyl-β-D-thiogalactosede异丙基硫代-β-D-半乳糖苷kDakilodalton千道尔顿LLiter升LBLyriabrothLB培养基minminute分钟mLmilliliter毫升mMmmol/L毫摩尔每升3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymetho四唑化合物MTSxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliumnmNanometre纳米ODOpticaldensity吸光度ORFopenreadingframe开放阅读框PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液IX 英文缩略词表（续表）英文缩写英文全称中文名称PBSTPhosphate-bufferedsalinewithTween-20含吐温20的磷酸盐缓冲液rAdRecombinantadenovirus重组腺病毒r/minRevolutionsperminute转/每分钟RNARibonucleicacid核糖核酸sSecond秒SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠SDS-PAGESodiumdodecylsulfate-polyacrylam-ide聚丙烯酰胺凝胶电泳SIStimulationindexgelelectrophoresis刺激指数TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量TEMEDN,N,N,N’-Tetramthylenediamine四甲基乙二胺TmMeltingtemperature解链温度TMB3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine3,3’,5,5’-四甲基联苯胺VSVesicularStomatitis水泡性口炎VSVVesicularStomatitisVirus水泡性口炎病毒X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyra5-溴-4氯-3吲哚基β-D半乳糖nosideµgmicrogram微克μLMicrolitre微升μmmicrometer微米X 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言水泡性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus，VSV)引起的高度接触传染性的病毒性人畜共患的重大传染性疫病(Letchworthetal.,1999;odgueLL,2002;Eun-JeongHeoetal.,2010)。水泡性口炎病毒又称传染性水泡性口膜炎病毒、牛及马的口腔溃疡病毒和伪口蹄疫病毒等。临床表现为口腔黏膜、乳房和蹄部冠状带皮肤出现水泡和溃疡(Letchworthetal.,1999)。其易感动物主要是牛、马和猪，有些野生动物也会感染VSV(田克恭，张仲秋，2013)。当VSV感染牛和猪时，其临床症状与口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)、猪水泡疹(VES)很类似，很难诊断(FerrisandDonaldson,1988；OliverLungetal.,2011)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定通报传染病，也是《中华人民共和国进出境动植物检疫法》规定的进境动物二类传染病。1.1流行概况及危害VS主要发生在西半球，最早的报道是发生在中美和北美的马的一种病毒性疾病，第一次世界大战期间蔓延至欧洲，并定期出现在南非。后来墨西哥、中美洲、巴拿马、委内瑞拉、哥伦比亚、秘鲁、阿根廷、法国和南非等国相继报道过本病，至今该病在中美洲、美国部分地区和南美洲的北部呈地方性流行,在南、北美洲的温带地区呈周期性流行（FerrisNP,etal.,2012）。VSV在美国没有口蹄疫的城市是引起动物水泡性疾病最重要的病原,从美国南部墨西哥到美国北部每年都有上成千上万次此病的爆发。在美国，VS有2种不同的爆发模式，在东南部州（乔治亚州、阿拉巴马洲、北卡罗莱纳洲和南卡罗来纳洲）从1900年代初到1970年代中期，各个州每年都有家畜临床病例的报道，从那时以来，这些地区再分离到的VSV主要集中在孤立的野生动物种群。相比之下，在美国西南部的一些州（新墨西哥洲、亚利桑那洲、犹他州和科罗拉多州）VS疫情大约每隔5~10年散在发生（RodriguezLL.，2002）。截至到2002年，VS最后一个疫情周期发生在1995年到1998年。重要的系统发育分析表明，不同血清型的VSV引起的VS发生在美国西南部和东南部。从2004年到2006年,在美国西南部的九个州爆发了751起水泡性口炎。新泽西型VSV(VSNJV)引发的VS，给美国的养殖业带来了巨大的经济损失(AndresM.Perez,StevenJ.，etal.,2010)。2012年美国再次发生了VS疫情，6月6日，美国农业部动植物卫生检疫署向OIE通报，新墨西哥州3家农场发生水泡性口炎，4匹马感染。8月17日—9月17日，美国动植物卫生检疫署共4次向OIE通报，新墨西哥州8家农场发现14匹马感染VSV。自2012年5月以来，到2012年11月新墨西哥州已发生36次VS疫情（中国动物卫生与流行病学中心国际兽医事务处，2012;MccluskeyBJ,etal.,2013）。通过对2012年分离到的VSV进行分子生物学流行病学分析，该次分离到的VSV并不是进化的新的VSV，病毒的基因型和2000年在墨西哥中部的韦拉克鲁斯分离的VSV基因型密切相关。LauroVelazquez-Salinas分析得到从2005年到2011年墨西哥发生VS疫情是由VSNJV从美国散布到墨西哥而导致的，并非有的新的毒株产生(LauroVelazquez-Salinas1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言etal.,2014)。水泡性口炎病毒感染猪、牛、马，主要引起舌的表面产生糜烂性病变、牙龈经常伴有囊泡、口腔黏膜破烂、乳头及蹄冠部皮肤出现水泡（田克恭，张仲秋，2013），但是通常病毒不会导致机体各组织器官发生原发性损伤(Meadetal.,2009)。VS疫情的发生往往给发病地区带来严重的危害，重视该病具有重大的实际意义。VS疫情在动物群中经常大面积流行，感染率极高，达96％，尽管死亡率不高，但所造成的经济损失仍然很大。有的VS疫情发生时所造成的经济损失大约100~200美元每头牛(Lederetal.,1983;Alderink,1984;Goodgeretal.,1985)。奶牛发生VS疾病时，并发乳腺炎疾病，生产性能大大降低，造成产奶量下降，从而造成严重的经济损失及危害人类健康。犊牛养殖业遭遇VS疫情时，损失也是很大，比如1995年在Colorado南部，16个牧场发生VS疾病，损失了2500头母犊牛，均损失了上万美元。此外，在临床上该病很难与其他的口足病区分开来。人也可以患水泡性口炎疾病，是一种非常严重的非致命性流感疾病（Letchworthetal.,1999)；人自然感染VSV，一般是长期待在VS疫区或是在实验室从事VSV研究（BrianD.Lichtyetal.,2004）。流动的人口、马、胚胎和动物源产品是将VSV从疫病区带至VS非疫病区，因此是最常见的传染源。目前，VSV已经成为了一种标准的免疫学试剂、干扰素和病毒学研究领域最常用的活病毒载体。但是很多使用该病毒的人不知道人和动物感染VSV会产生不同的后果。实验室合理化地使用VSV，不会造成非疫病区家畜感染VSV引起疫情的发生。1.2病原及其理化性质水泡性口炎病毒在分类上属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）、水泡病毒属（Vesiculovirus）。该属病毒由一组形态基本相同、抗原性有差异的病毒组成，包括9个公认的种和20个暂定种，其中有些暂定种是鱼类的病原体，有些无致病性。根据中和试验和补体结合试验，VSV可分为两个独立的血清型,即新泽西型(VSNJV)和印第安纳型(VSIV)(Martinezetal.,2004；ChadE.Mire,MichaelA.，2011)，其中VSIV根据其抗原交叉反应性又分为3个亚型(NigelP.Ferrisetal.,2012),即印第安纳Ⅰ型、印第安纳Ⅱ型和印第安纳Ⅲ型，其中Ⅰ型为典型毒株，主要分离于牛的毒株，也有分离自猪和昆虫的毒株。这些毒株流行于从美国北部（哥伦比亚、委内瑞拉、厄瓜多尔和秘鲁）到南部墨西哥，其中最主要的流行株为VSNJV，临床检测约80%为VSNJV(Hansonetal.,1968)。新泽西株被认为是最为危险的毒株，不仅在临床上占绝大比例，而且其致病性也远远大于印第安纳株（BridgesVEetal.,1997）。VSV病毒粒子呈典型的子弹状或圆柱状（图1.1），其病毒粒子大小为（150~180）nm×（50~70）nm；由两个结构组分组成，在病毒粒子内部为紧密卷曲呈螺旋状结构的核衣壳，具有一定感染性(Marozinetal.,2012;Mathuretal.,1996)，电镜下观察，犹如线性螺纹，其外径约49nm，内径约29nm，每个螺旋大约有35个亚单位；在病毒粒子外部有囊膜，并紧密地包裹着核衣壳，囊膜上均匀密布短的纤突，纤突长约10nm。非感染性的损伤性VSV模型无活性的转录酶且RNA含量较少(Cameiroetal.,2006;Zimmeretal,2013)。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.1VSV病毒粒子电镜图Fig1.1ElectronmicroscopyfigureofVSVparticlueVSV对理化因子的抵抗力与口蹄疫病毒相似。58℃30min、可见光、紫外线及脂溶剂都能使其灭活。在土壤中于4~6℃可以存活若干天。经尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊途径接种，VSV可在鸡胚内良好增殖。绒毛尿囊腔接种时引起痘斑样病变。水泡性口炎病毒可在多种细胞系上生长，如鸡胚成纤维细胞，猪、牛、鼠、猴肾上皮细胞。其中Vero细胞和BHK-21细胞对水泡性口炎病毒高度敏感，通常用BHK-21细胞获得高滴度的病毒，用Vero细胞分离病毒。水泡性口炎病毒是高效的干扰素诱生剂，可能与其能在增殖过程中生成双股RNA及dsRNA有关。VS的实验室诊断主要有病毒的分离、血清血诊断和分子生物学方法，主要包括酶联免疫吸附试验（Kweon,C.H，2005；Lee,H.S，etal.2009；Eun-JeongHeo,etal,2010；HualeiWang，2010；SuzhenYang，2010）与PCR检测方法（JovitaFern，2008；WilliamC.Wilson，2009）。1.3病毒基因组结构及其结构蛋白VSV是单股负链RNA病毒，是弹状病毒科重要的模型病毒（HansonRP:1952；HansonRP:1981；WebbPA,HolbrookFR:1989）。其基因组全长约11kb，类似弹状病毒科所有病毒的基因组成，由5个重要的基因组成：3´-N-P-M-G-L-5´；依次编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多功能基质蛋白(M)、囊膜糖蛋白(G)以及大聚合酶蛋白(L)5种结构蛋白(图1.2)(KaitlinRainwater-Lovettetal.,2007；ChadE.Mire,MichaelA.Whitt，2011；SunCetal.,2013)，共同构成具有感染性的病毒颗粒(Kuateetal.,2006;Tobereta.,2014)。G蛋白与M蛋白参与病毒侵入宿主细胞、破坏宿主细胞的先天免疫程序及新的病毒粒子的出芽及组装(EricHastie,etal.2013)；其他的3种蛋白（N蛋白、P蛋白、L蛋白）共同构成RNA基因组的病毒感染性核心，复杂病毒的转录和复制。负链RNA病毒的RNA基因组由其所编码的核衣壳蛋白所包被。由病毒RNA基因组所组成的络合物结构与核衣壳蛋白构成病毒的核衣壳（LUOMing，2012）。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.2VSV结构示意图Fig1.2TheschematicdiagramofVSVN蛋白是该病毒核衣壳的主要蛋白，与病毒RNA基因组构成N-RNA复合物。所形成复合物协同约50拷贝的L蛋白（242kDa）、依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）及约500拷贝的P蛋白，以L蛋白为辅助因子形成病毒转录复制的核糖核蛋白复合物(EmersonandYu,1975;Thomasetal.,1985;DeandBanerjee,1985;RauxHetal.,2010)。P蛋白与N蛋白和L蛋白共同作用，介导N-RNA复合物与L蛋白之间的接触(MellonandEmerson,1978)。P蛋白是负链RNA病毒复制的一个重要组成成分，感染病毒的细胞内,N蛋白以单体、多聚体和与P蛋白结合3种形式存在（LeyratCetal.,2012）。N蛋白为VSV的群特异性抗原,VSNJV和VSIV的N蛋白具有68.7%的同源性，与其他弹状病毒无交叉反应,诱导产生非中和抗体。L蛋白是一种较大的蛋白,可能具有激酶活性，能使P蛋白的多个丝氨酸磷酸化。M蛋白是VSV基因组所编码的最小的一种产物,被喻为病毒的“大脑”，在病毒的复制和致病机制功能中发挥着重大作用。可以稳定G蛋白三聚体；连接细胞膜上的G蛋白和N蛋白；在[8]病毒感染期间能关闭宿主细胞的转录、核细胞质的转运和翻译，抑制宿主的天然免疫反应(ChongandRose,1994;Hartyetal.,2001;Jayakaretal.,2000)。M蛋白是VSV的毒力蛋白，负责诱导细胞病变效；感染VSV的细胞出现凋亡的特征，在很大程度上是由基质蛋白的作用(AhmedandLyles,1998;Ahmedetal.,2003;ConnorandLyles,2005;Fariaetal.,2005;Petersenetal.,2000)。在M蛋白51号位置用精氨酸替代的甲硫氨酸,重组病毒将不能抑制宿主基因的表达，与野生VSV毒株比较，重组的VSV病毒能刺激与天然免疫有关的基因的表达。目前将基质蛋白基因进行突变使病毒毒力减弱，成为一个更有效的治疗工具已成为各国学者的研究热点。G蛋白组成同源聚体的棘突，锚定于病毒囊膜之中，在病毒感染的起始步骤中发挥着重要功能。主要功能为负责病毒吸附其宿主细胞；病毒和宿主细胞的细胞膜的融合；介导胞吞作用后病毒囊膜和内吞体膜之间的融合（LeBlanc,I.etal.2005)，并且指导病毒的出芽。磷脂酰丝氨酸与糖蛋白结合，组成细胞表面膜的成分，可以使VSV感染几乎所有的动物细胞。由于VSV这种广泛的组织取向，使其被用于抗癌剂用于所有类型的肿瘤（BrianD.Lichty，2004）。当病毒接触到细胞表面，病毒通过细胞的内吞作用进入细胞（Sun,X.,2005；Johannsdottir,H.K.,2009；Cureton,D.K.,2009），随后PH值下降，糖蛋白催化病毒和宿主细胞的细胞膜融合释放病毒的核糖核蛋白4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言（RNP）到细胞质中，RNA多聚体使病毒基因组进行转录(Roche,S.etal.2006;Roche,S.etal.2007;Roche,S.etal.2008;ChadE.Mire.etal.2009)。膜脂质在空间组织细胞中发挥着重要作用（vanMeer,G.etal.2008），内部囊泡内吞作用途径的特性之一是它含有一种独特的脂质，成为双单酰基甘油磷酸脂（BMP）或双溶血磷脂酸（LBPA）（Kobayashi,T.etal.2001；Piper,R.C.andKatzmann,D.J.2007)。BMP在低pH条件下促进膜融合、膜内陷及控制晚期内涵体和多泡体的形态和功能（Kobayashi,T.etal.2002；E.Jeetendraetal.2003；Matsuo,H.etal.2004)。2血清型的糖蛋白呈现型乃至株的特异性，只有55.15%的同源性。VSIVG蛋白具有511个氨基酸，其糖基化在第178个和第335个氨基酸，在胞质域包含共价连接脂肪酸；VSNJVG蛋白含有517个氨基酸，糖基化位点和VSIVG蛋白相同，但它不酰化；这两种蛋白除了一级结构及抗原结构相同，但具有不同的成熟肽。VSNJVG蛋白在细胞内折叠的更快且不依赖糖基化（MachamerCEetal.1990；MathieuMEetal.1996）。G蛋白刺激机体产生中和抗体，是研究VSV基因工程疫苗的首选抗原。1.4VSV疫苗研究进展目前尚无有效治疗水泡性口炎的方法，疫苗免疫接种是预防和控制该病的重要措施，因此对VSV疫苗的研究尤为重要。目前VSV疫苗研究方面主要有灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等疫苗的研究。1.4.1灭活苗用活的VSV、紫外灭活的VSV和纯化的VSVG蛋白分别感染小鼠，检测中和抗体，发现中和抗体含量最高的是用活的VSV抗原感染的小鼠，然而低剂量的VSV不能刺激产生抗体。在紧急情况下可用活的VSV野毒进行免疫，此方法曾被大量的应用于南美的牛群中，但会有散毒的危险(LaueermanLH,etal,1984)。Bachma等(BachmannMF,etal,1994)比较了甲醛、β-丙酸丙酯、紫外线三种灭活方法灭活VSV制备免疫抗原，免疫动物，所引起的中和抗体反应均减弱，与（Bachmannetal.1993)结论一致。这种中和抗体的减少可通过提高剂量免疫的方案来弥补。用甲醛和β-丙酸丙酯灭活病毒免疫动物，不能诱导VSV特异性细胞毒性T细胞（CTL）应答，而用紫外灭活病毒免疫动物可以诱导显著并持久的CTL应答。这种免疫效果直接影响到了灭活疫苗的应用，由于灭活疫苗诱导机体产生的中和抗体不足以保护动物免受病毒的感染，有时甚至会增强疫苗接种的免疫病理应答。美国已批准生产氢氧化铝灭活苗，另一种油佐剂苗已在哥伦比亚做田间试验；这两种疫苗在接种马和牛的血清中均能产生高水平的特异性抗体。JamesA.House等将准备市售的含VSV-NJ抗原与VSV-IN抗原的油佐剂疫苗免疫小牛以确定其诱导机体产生保护性免疫应答的能力；研究结果表明在疫苗接种后进行攻毒试验，接种小牛均得到了保护作用(JamesA.Houseetal.2003)。1.4.2弱毒苗弱毒苗已在美国、巴拿马、危地马拉、秘鲁和委内瑞拉做过田间试验，结果均不可靠。这种5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言疫苗仅限用于已经确诊的VS病例或是那些已被认为是VS疫情高危的地区。因为这类疫苗是由全病毒组成，免疫疫苗的动物很难与自然感染VSV的动物区别开，它的使用也不利于VS疫病的有效监测。单股负链RNA病毒的基因的表达受控于单一转录启动子的距离，因此这类病毒的表型可以通过基因被系统地操纵重排来实现。Flanagan通过将N蛋白基因从转录起始部位去掉，使得病毒毒力减弱和完全失去致病力，然后致弱VSV与G蛋白基因连接在一起，使病毒毒力减弱，制备重组疫苗，此疫苗可使猪对野生型VSV产生抵抗力，这种基因重组的方法提供了一个新的思路，是发展活的弱毒苗的一个方向（FlanaganEB,etal.2001）。1.4.3亚单位疫苗亚单位疫苗是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗。Yilma,T.等利用非离子洗涤剂β-D-辛基葡糖苷从纯化的VSV中制备含有G蛋白的亚单位疫苗。混合弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂后免疫牛与小鼠，攻毒后没有引发水泡性口炎疾病，该疫苗避免了弱毒苗与灭活苗所导致的毒力反强、散毒等危险，同时也可以区分接种该疫苗的动物和由全病毒自然感染的动物（Yilma,Tetal.1985）。1.4.4基因工程疫苗DNA疫苗不仅可以诱导产生体液免疫，还可以诱导产生细胞免疫，而细胞免疫在机体对感染病毒的清除过程中起到关键作用。Cantlon等人根据糖（G）蛋白能诱导机体产生中和抗体的原理，组建了一种新型DNA疫苗，用皮内注射的途径刺激鼠、牛、马可产生中和抗体，但分别产生了不同的免疫反应。若用表达白介素-2的基因重组疫苗或具有免疫刺激性的寡核苷酸链协同注射时可明显提高抗体水平。但是其诱导机体产生中和抗体应答的能力尚不清楚（J.D.Cantlon,2000）。Flanagan等人也开展了基因重组苗的研制。2008年周学章等构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒pIRES-G1500，在BHK-21细胞中获得正确表达；质粒免疫小鼠后，可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高，并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体(周学章等，2008)。1.5重组腺病毒疫苗研究进展1.5.1腺病毒腺病毒(Adenovirus，Ad)属腺病毒科(Adenoviridae)，分为禽腺病毒属(Aviadenovirus)和哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。Ad是无囊膜的二十面体病毒壳体，基因组为线性双链DNA结构，全长约36kb(JoossK,ChirmuleN,2003)。其两端各含有100~140bp的末端反向重复序列(ITR)，可以出现双链DNA的环状结构(CailinDealetal.,2013)；分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言早期基因分为E1区、E2区、E3区和E4区，其中E1区和E4区是病毒复制所必需的。腺病毒现具有100多个血清型，其中人腺病毒(Humanadenovirus)有49种，属于哺乳动物腺病毒属，其中人2型（Ad2）及5型(Ad5)被广泛应用于基因治疗及生物学研究中(SchmitzH.etal,1983)。1.5.2复制缺陷型腺病毒载体腺病毒载体分为复制型和复制缺陷型(CailinDealetal.,2013)，复制缺陷型腺病毒载体即把腺病毒结构基因全部剔除，只保留了腺病毒必需的顺式作用元件和包装信号序列，细胞毒性大幅度减弱，此外，该载体系统还引入了CMV启动子，是现阶段研究重组腺病毒载体活疫苗最主要的载体(SmallJCetal.,2011;WeinbergDH.,1986;JonesN.,1978)。具有以下优点：第一，免疫效果显著，免疫途径广泛，可以通过肌肉和皮下注射进行免疫，也可以不需注射，喷雾免疫或者经口服后能产生局部粘膜免疫应答；并且腺病毒细胞嗜性广，可以感染树突状细胞，机体可以有效的对其抗原进行抗原递呈(PattersonLJ.，2012)。第二，宿主范围广，在增殖和非增殖细胞中感染和高效表达外源基因；第三，为复制缺陷性载体，安全性好；以人和动物为实验模型的大量实验已经表明在大多数情况下复制缺陷型腺病毒载体疫苗安全性是可以保证的(SullivanNJetal.,2000)。第四，腺病毒载体的容量大，并能同时表达多个基因；第五，可悬浮培养，增殖速度快，病毒滴度高，病毒颗粒稳定，不易突变相对稳定，容易浓缩、纯化和保存。1.5.3腺病毒载体在疫苗研究中的应用现在腺病毒载体已被广泛应用于疫苗研究中，其中人5型复制缺陷型腺病毒（Ad5）是最常用的。近年来人5型腺病毒载体己经被广泛应用于活载体疫苗的研发,截止2011年6月，基于腺病毒载体的临床试验已达400余例(ArnbergN,2012)。目前开发成熟的商品化腺病毒载体有多种（YanFetal,2013;LeeYJetal,2007）。管洁等利用Ad5构建了表达丙型肝炎病毒截短型非结构蛋白3（NS3）和核心蛋白融合抗原的重组腺病毒疫苗，体外可以有效表达融合蛋白，免疫小鼠可以激发抗原特异的抗体反应与较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答，并可以产生明显的交叉保护效果（管洁等，2015）。苏春霞等构建共表达口蹄疫病毒（FMDV）VP1-2A基因和猪白细胞介素2（IL-2）基因的重组腺病毒，免疫小鼠，结果显示，与rAd-VP1免疫组相比，rAdVP1-2A-poIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力，又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示，串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化(苏春霞等，2014)。Wang等利用腺病毒载体构建了小反刍兽疫病毒F和H融合蛋白表达重组腺病毒，实验表明重组腺病毒可以在体外正确表达目的蛋白，且具有良好的反应原性(WangY.,etal,2013)。7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.6本研究的目的和意义至今水泡性口炎在中美洲、美国部分地区和南美洲的北部呈地方性流行，在南、北美洲的温带地区呈周期性流行，现在美国地区时有VS疫情的发生，自2012年5月以来，到2012年11月新墨西哥州已发生36次VS疫情。目前我国还未爆发过水泡性口炎疫情，随着我国加入WTO，动物及动物产品的国际贸易量增加，为防止国外动物疫病传入我国，保护我国畜牧业的健康发展，对该病进行充分的了解和研究具有重要意义。水泡性口炎目前还没有有效的治疗方法，只能通过疫苗进行防控，因此，开发安全有效的VSV新型疫苗对我国VS疫情的防控非常必要。近年来人5型腺病毒载体己经被广泛应用于活载体疫苗的研发，重组腺病毒疫苗具有免疫效果显著，免疫途径广泛，安全性好，腺病毒载体容量大，增殖速度快，病毒滴度高等特点。本研究试图利用人5型复制缺陷型腺病毒系统，构建可以表达VSV-IN-G蛋白、VSV-NJ-G蛋白及VSV-IN-G与VSV-NJ-G蛋白的融合蛋白的重组腺病毒；接种AAV-293细胞及Vero细胞，通过间接免疫荧光试验及Westernblot检测目的蛋白在体外的表达情况及活性，通过PCR鉴定及病毒滴度测定，分析重组腺病毒的遗传稳定性。将构建的重组腺病毒免疫小鼠，通过间接ELISA方法、中和抗体检测及淋巴细胞增殖试验检测免疫反应的各项指标，分析重组腺病毒引起小鼠的体液免疫及细胞免疫水平，评价其免疫效果，期望能够获得较高的抗体水平及保护效力。8 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定摘要：本研究以人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体，构建表达水泡性口炎病毒单一血清型G蛋白及两血清型G蛋白的融合蛋白的重组腺病毒。利用PCR技术扩增编码VSV-IN-G蛋白、VSV-NJ-G蛋白的基因；通过GlyGlyGlyGlySer多肽序列的连接，利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因。将目的基因分别克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMVK-NpA中。通过PCR、酶切及测序鉴定正确的重组穿梭质粒，然后分别通过PacI酶线性化后，与同样经PacI酶线性化的骨架载体pacAd59.2-100共转染AAV-293细胞，包装出三株重组腺病毒rAd-VSV-NJ-G,rAd-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。将三种重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至20代，效价均稳定，用目的基因的特应性引物PCR扩增均可扩增出目的条带。利用间接免疫荧光和westernblot检测方法检测，结果显示G蛋白在重组腺病毒中可以正确表达，并具有很好的生物活性，从而为VSV重组腺病毒疫苗的研究奠定了基础。关键词：水泡性口炎病毒；G蛋白；重组腺病毒；构建2.1材料和方法2.1.1菌株、细胞及质粒pMD-18T-VSV-IN-G质粒，VSV-NJ毒株，E.coliDH5α感受态细胞，Vero细胞，AAV-293细胞及腺病毒载体系统均由本实验室保存。2.1.2主要试剂PrimerStar高保真聚合酶、M-MLV反转录酶、dNTP购自TaKaRa公司；普通质粒小提试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色剂购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒、Endo-free质粒大提试剂盒购自OMEGA公司；琼脂糖、Trizol及Lipofectamine2000脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；DMEM高糖培养基、Opti-MEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清为杭州四季清公司产品；鼠源VSV-G单克隆抗体购自北京博奥龙免疫技术有限公司；生物辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司；蛋白高分子量预染Marker购自Fermentas公司；MarkerIV购自天根生化科技(北京)有限公司；2KPlusDNAMarker购自北京全式金生物技术有限公司。9 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定图2.1穿梭载体pacAd5CMVK-NpA图谱(6217bp,氨苄抗性)Fig.2.1SchematicdiagramofshuttleplasmidpacAd5CMVK-NpA图2.2骨架载体pacAd59.2-100图谱(34947bp,氨苄抗性)骨架载体缺失左ITR、包装信号和E1区Fig.2.2SchematicdiagramofbackbonevectorpacAd59.2-100ThenovelpacAd59.2-100Adbackbonevectorisdevoidoftheleft-handITR,thepackagingsignalandE1sequences.10 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定2.1.3主要的仪器设备超净工作台（SW-CJ-1F）购自北京华威中仪科技有限公司；PCR仪（AG22331Hamburg）购自德国Eppendorf公司；紫外凝胶成像系统（Tanon2500）购自上海天能科技有限公司；金属恒温仪（H203）购自金银杏科技有限公司；电子天平（METTLERTOLEDOPL203-IC）购自Mettler公司；摇床（ZHWY-211B)购自上海智城分析仪器制造有限公司；紫外分光光度计（Evolution60）购自Thermo公司；蛋白电泳系统（BioRadMiniProteinⅡ）购自BIO-RAD公司；低温台式高速离心机（BiofugoprimoR）购自美国thermo公司；Milli-Q纯水仪购自美国Millipore公司。2.1.4实验所用主要试剂及配制方法1）LB（液体）培养基酵母粉（YeastExtract）5g胰蛋白胨(Tryptone)10gNaCl10g精确称取上述试剂并溶解于800mL去离子水中，定容至1L，用5MNaOH溶液调pH值至7.4，121℃高压灭菌30min后取出，室温保存备用。2）氨苄（Ampicillin，Amp）储存液(100mg/mL)称取2g氨苄青霉素，并将其溶解于20mL去离子水中，经0.22µm滤器过滤除菌，分装后，-20℃保存备用。3）含0.1%Amp的LB固体培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%（w/v），121℃高压蒸汽灭菌30min后至培养基冷却至50℃左右，按照1:1000的比例加入Amp储存液，摇匀后每块培养皿铺20mL左右于培养皿中，冷却凝固后用封口膜密封，4℃保存备用。4)含0.1%Amp的LB液体培养基在LB液体培养基中，按照1:1000的比例加入Amp储存液至终浓度为100µg/mL，4℃保存备用。5)DMEM液体培养基DMEM干粉2袋（1袋/1L）NaHCO37.4g称取上述成分溶解于1600mL去离子水中，搅拌均匀，定容至2L调整pH至7.3左右，再用0.22µm无菌滤器于生物安全柜中过滤除菌，分装后置于4℃保存。6）0.07%胰酶11 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定NaHCO30.5gNaCl8gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O7.28g胰酶0.7gEDTA0.2g称取上述成分并溶解于800mL去离子水中，调整pH至7.4，用0.22μm滤器过滤除菌后，分装，置于4℃保存备用。7)50×TAE储存液Tris242g0.5MEDTA（pH8.0）100mL冰乙酸57.1mL称取上述成分，加入800mL去离子水充分搅拌后，定容至1L，过滤后室温保存。实验时，将40mL50×TAE加入1960mL去离子水中，充分搅拌均匀后配成1×TAE使用。8)0.lmol/LCaCl2溶液称取2.7g的CaCl2·6H2O溶于去离子水中并定容至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，置于4℃保存备用。9）磷酸盐缓冲液（PBS）NaCl80gNa2HPO4.12H2O35.8gKCl2gKH2PO42.4g称取上述成，用1800mL去离子水充分搅拌溶解，定容至2L，调pH值至7.4，室温保存。10）PBST溶液将Tween-20加入至PBS溶液中，使其体积终浓度为0.5‰，磁力搅拌器搅拌均匀使其充溶解，现配先用。11）4×SDS凝胶上样缓冲液SDS16g溴酚蓝0.8g100mMTris40mL20%甘油80mL将上述成分加入到50mL去离子水中，磁力搅拌至充分溶解后，定容至200mL，室温保存备用。12）10%过硫酸铵（AP）溶液称取2g过硫酸铵溶液于16mL去离子水中，待充分溶解后，定容至20mL，分装至1.5mLEP管中，1mL/支，4℃保存。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定13）二硫苏糖醇（DTT）溶液称取2.55g二硫苏糖醇粉末，用8mLpH5.2的0.01M的乙酸钠充分溶液，用乙酸钠溶液定容至10mL，分装后-20℃避光保存。14）10%SDS溶液称取10gSDS溶解于80mL去离子水中，待充分溶解后，定容至100mL，调pH至7.2，室温保存备用。15)30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺150gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺4g称取上述成分加入到300mL去离子水中，磁力搅拌至充分溶解后，定容至500mL，4℃避光保存。16）pH6.8的Tris溶液（0.5M）称取36.3gTris加入到500mL去离子水中溶液，定容至600mL，用浓盐酸调pH至6.8，室温保存。17）pH8.8的Tris溶液（1.5M）称取109.02gTris加入到500mL去离子水中溶液，定容至600mL，用浓盐酸调pH至8.8，室温保存。18）2×Tris-GlyTris碱12.08g甘氨酸（Gly）75.2gSDS4g称取上述试剂，加至1600mL去离子水中，充分溶解后，定容至2L，室温放置备用。19）湿转缓冲液甘氨酸（Gly）28.8gTris碱6g甲醇400mL称取上述试剂，用1000mL去离子水充分溶解后，定容至2L。20)考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝（R-250）2.5g冰乙酸100mL甲醇450mL去离子水450mL充分溶解后，放通风厨中室温保存备用。21）脱色液冰乙酸100mL甲醇450mL去离子水450mL13 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定将上述试剂搅拌均匀后，放通风厨中室温保存备用。2.2实验方法2.2.1引物设计根据NCBI公布的VSV-IN-G全基因组序列(GenBank登录号：J02428.1)及VSV-NJ-G全基因组序列（GenBank登录号：V01214.1），利用PrimerPremier5.0软件设计引物，分别用于扩增VSV-IN-G、VSV-NJ-G的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)及VSV-IN-G-NJ-G串联基因，引物序列为见表2.1。表2.1PCR扩增VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-NJ-G基因ORF的引物Table2.1TheprimersusedforPCRamplificationoftheORFofVSV-IN-G、VSV-NJ-GandVSV-IN-NJ-G引物片段大小(bp)引物序列(5'-3')PrimersPrimersequenceSizeofProductsIN-G-XFCGGAATTCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTA1536IN-G-XRATTTGCGGCCGCTTACTTTCCAAGTCGGTTCNJ-G-XFCGGAATTCGCCACCATGTTGTCTTATCTAATCTTTGCA1554NJ-G-XRATTTGCGGCCGCTTAACGGAAATGAGCCATTTCCACGIN-G-linkerGCTTCCACCTCCACCCTTTCCAAGTCGGTTClinker-NJ-GGGTGGAGGTGGAAGCATGTTGTCTTATCTAATC引物IN-G-XF（下划线为EcoRⅠ酶切位点）及IN-G-XR（下划线为NotⅠ酶切位点）为扩增VSV-IN-G基因的上下游引物，引物NJ-G-XF（下划线为EcoRⅠ酶切位点）及NJ-G-XR（下划线为NotⅠ酶切位点）为扩增VSV-NJ-G基因的上下游引物。引物IN-G-XF及IN-G-linker（下划线为linker序列）为扩增VSV-IN-G-linker基因的引物，linker-NJ-G（下划线为linker序列）及NJ-G-XR为扩增linker-VSV-NJ-G基因的引物，其中，IN-G-linker为去除了终止密码子TAG的引物，下划线的碱基编码的片段Gly-Gly-Gly-Gly-Ser作为linker，最终以IN-G-XF及NJ-G-XR为引物，VSV-IN-G-linker基因和linker-VSV-NJ-G基因的PCR产物为模板通过融合PCR扩增出VSV-IN-G-NJ-G融合基因。方框中的GCCACC为引入的Kozak序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,稀释为10µmol/L使用。2.2.2Vero细胞的培养1）从液氮中取出冻存Vero细胞的冻存管，置于37℃温水中轻轻摇动使其迅速溶解；2）将已完全解冻的Vero冻存管于生物安全柜内用75%酒精棉擦拭后，用无菌吸管将细胞悬液移至无菌的15mL离心管中，放于水平离心机中以1000r/min离心3min；3）吸弃上清，加入10mLDMEM细胞培养液重悬细胞沉淀，移入细胞瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养；4）12h后观察细胞是否贴壁，贴壁后将细胞培养瓶中的培养液倒掉，加入10mL含10%FBS14 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定的DMEM培养液，放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养；5）待细胞贴壁生长至80%满时进行细胞传代培养，传代时弃去旧的细胞培养液，用灭菌的PBS清洗3次。6）加入1mL0.07%的胰酶消化,注意观察，待看到细胞瓶壁出现细针孔空隙时弃去胰酶消化液，加10mL10%牛血清DMEM培养基，反复吹打（尽量减少吹出气泡）；7）再补加10mL10%牛血清DMEM培养基,混匀，从待传细胞培养瓶中吸出10mL细胞培养液，加入到新的细胞瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。8）培养过程中于显微镜下观察细胞生长情况。2.2.3VSV-NJ的增殖1）于接种病毒前一天将Vero细胞进行传代培养，待Vero细胞贴壁生长至80%密度满时弃去细胞培养瓶中的细胞培养液，用灭菌的PBS清洗3次；2）取100μLVSV-NJ毒液加入至1mL细胞维持液含（2%FBS的DMEM），混合均匀，接种于一瓶T-75细胞培养瓶中，同时取一瓶Vero细胞加入1mL细胞维持液作为阴性对照；3）将接种VSV-NJ的细胞瓶及阴性对照细胞瓶置于37℃、5%CO2培养箱中，培养1h，每隔15min轻摇1次细胞瓶，使病毒更好地吸附细胞；4）1h后取出细胞培养瓶，每瓶补加10mL细胞维持液，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。5)次日观察细胞生长情况，待Vero细胞出现CPE，即变圆、脱落、甚至破碎时进行收毒；6）收毒时将接种VSV-NJ病毒的Vero细胞培养瓶于37℃和-20℃条件下反复冻融3次，转移至无菌的15mL离心管中，3000r/min离心5min，收取上清，即为VSV-NJ病毒液；7）将收获的VSV-NJ病毒液放于-80℃冰箱保存或直接用于VSV-NJ病毒RNA的提取。2.2.4VSV-NJ病毒RNA的提取取200μLVSV-NJ毒株扩增后的病毒液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒操作程序提取总VSV-NJ总RNA。具体操作步骤如下：1）取三支1.5mL无菌的EP管，每管加入200μLVSV-NJ感染的Vero细胞冻融液，再加入200μLBufferV-L,漩涡震荡混合均匀，于室温条件下放置5min；2）每管加入75μLBufferV-N，漩涡振荡混合均匀，室温条件下12000r/min离心5min；3）吸取上清加到新的2mL离心管中，加入300μL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6~8次，混合均匀。4）将新制备管放于新的2mL离心管中，将步骤3中的混合溶液转入到新的制备管中，室温条件下6000r/min离心1min；5）弃去离心管中的滤液，将制备管放回2mL离心管中，加入500μLBufferW/A，室温条件下静置1min，室温条件下12000r/min离心1min；6）弃去离心管中的滤液，将制备管放回2mL离心管中，加入800μLBufferW2，室温条件下15 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定12000r/min离心1min；7）将制备管放回2mL离心管中，室温条件下12000r/min离心1min；8）将制备管置于干净的1.5mLEP管中，在制备管膜中央位置加入50μLBufferTE，室温静置1min,于室温条件下12000r/min离心1min洗脱RNA，将洗脱后的RNA直接用于RT-PCR实验。2.2.5VSV-NJ-G基因的RT-PCR扩增利用TakaraM-MLVReverseTranscriptase,按照说明书进行，以提取的VSV-NJRNA为模板，NJ-G-XF及NJ-G-XR为引物合成VSV-NJ的第一条链cDNA。体系如下：5×M-MLVBuffer2μLdNTPMix(10mmol/L)1μLNJ-G-XF1μLNJ-G-XR1μLRnaseInhibitor0.25μLM-MLV反转录酶(200U)0.25μLRNA4.5μLTotal10μL混合均匀后进行如下反应：42℃，60min;72℃，15min，合成cDNA。以反转录得到的cDNA作为模板，NJ-G-XF及NJ-G-XR为上下游引物PCR扩增VSV-NJ-G基因。反应体系如下：cDNA4µL5×PrimeSTARBuffer10µLNJ-G-XF(10µmol/L)2µLNJ-G-XR(10µmol/L)2µLdNTPMix(2.5µmol/L)8µLPrimeSTARHSDNA0.5µLpolymeraseddH2O23.5µLTotal50µL混合均匀后进行如下反应：94℃，3min；（94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min）30个循环；72℃，10min。经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书回收目的片段。2.2.6VSV-IN-G基因的扩增以pMD-18T-VSV-IN-G质粒作为模板，IN-G-XF及IN-G-XR为上下游引物PCR扩增16 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定VSV-IN-G基因。反应体系如下：pMD-18T-VSV-IN-G质粒1µL5×PrimeSTARBuffer10µLIN-G-XF(10µmol/L)2µLIN-G-XR(10µmol/L)2µLdNTPMix(2.5µmol/L)4µLPrimeSTARHSDNA0.5µLpolymeraseddH2O30.5µLTotal50µL混合均匀后进行如下反应：94℃，3min；（94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min）30个循环；72℃，10min。经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书回收目的片段。2.2.7VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增以pMD-18T-VSV-IN-G质粒作为模板，引物IN-G-XF及IN-G-linker为扩增VSV-IN-G-linker基因；以pMD-19T-VSV-NJ-G质粒作为模板，linker-NJ-G及NJ-G-XR为扩增linker-VSV-NJ-G基因。PCR反应体系如下：质粒DNA1µL5×PrimeSTARBuffer10µLIN-G-XF/linker-NJ-G2µLIN-G-linker/NJ-G-XR2µLdNTPMix(2.5µmol/L)4µLPrimeSTARHSDNA0.5µLpolymeraseddH2O30.5µLTotal50µL混合均匀后进行如下反应：94℃，3min；（94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min）30个循环；72℃，10min。经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书回收目的片段。以VSV-IN-G-linker基因及linker-VSV-NJ-G基因PCR胶回收产物为模板，以IN-G-XF与NJ-G-XR为上下游引物，扩增VSV-IN-G-NJ-G基因。反应体系如下：PCR纯化产物2µL+2µL5×PrimeSTARBuffer10µLIN-G-XF2µL17 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定NJ-G-XR2µLdNTPMix(2.5µmol/L)4µLPrimeSTARHSDNA0.5µLpolymeraseddH2O27.5µLTotal50µL混合均匀后进行如下反应：（94℃，10s；55℃，10s；72℃，3min40s）30个循环；72℃，10min。经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书回收目的片段。2.2.8E.coliDH5α感受态细胞的制备采用氯化钙法制备E.coliDH5α感受态细胞。制备过程如下：1)将-80℃冻存的E.coliDH5α菌种于超净台中划线接种于LB琼脂平板培养基上，置于37℃培养箱中培养12h；2)挑取一个单菌落接种于含3mLLB液体培养基的试管中，于37℃、200r/min条件下振荡培养12h；3)取1mL已培养12h的E.coliDH5α菌液于超净工作台中接种于含100mLLB培养基的三角烧瓶中，于37℃、200r/min条件下振荡培养1.5~2h；4)取少许菌液，用紫外分光光度计测其OD600nm值，当达到0.4~0.6时，于超净工作台中将菌液转移到两个无菌的且预冷的50mL离心管中，冰上放置10min；5)于4℃条件下以4100r/min离心10min；6）弃去上清，加入5mL预冷的0.lmol/L的CaCl2重悬菌体沉淀，于4℃条件下以4000r/min离心10min；7)弃去上清，加入4mL预冷的0.lmol/LCaCl2,重悬菌体沉淀；再加入1mL80%甘油混匀，使甘油的终浓度为16%；8)将第7步骤中的溶液分装至预冷的无菌1.5mLEP管中，100μL/管，置-80℃冻存或直接用于转化实验。2.2.9将目的基因克隆至T载体2.2.9.1连接将纯化的VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因PCR产物，克隆至pMD-19–TVector中。连接体系如下：18 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定目的基因PCR纯化产物4µLpMD-19-TVector1µLSolutionI5µLTotal10µL放于PCR仪中，16℃反应30min,反应结束后，将EP管置于冰盒中。2.2.9.2将连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞1)加连接产物10µL至100µLE.coliDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；2)于42℃水浴锅中热激90s，立即置于冰上2min；3)与超净工作台中向EP管中加800μLLB液体培养基，于37℃、200r/min条件下震荡培养1h；4)取200µL菌液、4µL的IPTG(1mol/L)和40µL的X-gal(20mg/mL)涂布于含Amp的LB平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。2.2.9.3阳性克隆的筛选次日挑取白色单个菌落，接种到3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养12h。通过PCR、酶切筛选阳性克隆，将阳性质粒送金唯智生物技术有限公司测序。将测得的目的基因的序列与GenBank公布的VSV-IN毒株与VSV-NJ毒株的序列进行核苷酸与氨基酸水平上的比对，将测序结果正确的质粒分别命名为pMD-19-VSV-IN-G、pMD-19-VSV-NJ-G、pMD-19-VSV-IN-G-NJ-G。2.2.10重组腺病毒穿梭质粒的构建2.2.10.1酶切、连接及转化将纯化的VSV-IN-G、VSV-NJ-G及VSV-IN-G-NJ-G基因PCR产物分别用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，纯化后连接至经相同限制性内切酶处理的腺病毒穿梭载体pacAd-CMVK-NpA中。酶切体系如下：PCR产物/pacAd-CMVK-NpA20µL10×HBuffer5µLBSA5µLTriton5µLEcoRⅠ2µLNotⅠ2µLddH2O11µLTotal50µL19 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定混合均匀后放入37℃水浴锅中，反应4h，1%琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化酶切产物，测定核酸浓度后，按照比例将目的基因分别连至pacAd-CMVK-NpA载体中。连接体系如下：目的基因酶切产物4µLpacAd-CMVK-NpA1µL10×T4DNALigaseBuffer1µLT4DNALigase1µLddH2O3µLTotal10µL放于PCR仪中，16℃反应12h,反应结束后，将EP管置于冰盒中。将连接产物10µL加至100µLE.coliDH5a感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，立即置于冰上2min；加入500μLLB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养1h；均匀地涂布于含Amp的LB平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。2.2.10.2阳性克隆的筛选次日随机挑取白色单个菌落，接种到3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养12h。通过PCR、酶切筛选阳性克隆，将阳性质粒送金唯智生物技术有限公司测序。将测序结果正确的重组穿梭质粒分别命名为pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G、pAd-VSV-IN-G-NJ-G。2.2.11大量提取重组穿梭质粒及骨架载体质粒将保存的重组穿梭质粒（pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G、pAd-VSV-IN-G-NJ-G）菌种及腺病毒骨架载体pacAd59.2-100质粒菌种分别按1%比例取30μL接种于3mL含1‰Amp的LB液体培养基,37℃、200r/min震荡培养12h以活化菌种。次日，将活化的菌种按1%比例接种于200mL0.1%Amp的LB液体培养基,37℃、200r/min震荡培养12h-16h。使用OMEGAE.Z.N.A.TMFastfilterEndo-FreePlasmidMaxiKit,按照其说明书提取质粒。具体操作如下：1）各取200mL培养过夜的含重组穿梭质粒（pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G、pAd-VSV-IN-G-NJ-G）菌液及腺病毒骨架载体pacAd59.2-100质粒菌液，分别分装至无菌的50mL离心管中，室温条件下，5000r/min离心10min；2）弃去上清，收集菌体，加入10mLSolutionⅠ/RNaseA,轻轻重悬菌体沉淀；3）每管加入10mLSolutionⅡ,轻轻地颠倒离心管10~15次，室温条件下孵育2min,使菌体充分裂解；4）每管加入5mL预冷的BufferN3,立即温和地颠倒离心管数次，直至形成白色絮状沉淀；5）于4℃条件下，12000r/min离心10min，收集上清；6)把制备管放入一个50mL的收集管中，加入5mLBufferGPS，室温静置10min,室温条件下，5000r/min离心5min；弃掉洗脱液，将制备管放回收集管中；7)将步骤5）的上清加至过滤用的注射器中，推动活塞，将液体过滤至一个新的无菌的50mL20 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定离心管中；8）向过滤好的溶液中加入0.1体积的ETRSolution，轻轻颠倒7~10次，冰上放置10~20min(期间颠倒几次)，冰浴后溶液会变澄清；9)于42℃水浴锅中水浴5min(期间颠倒几次)，水浴后溶液会重新变混浊；10）室温条件下，5000r/min离心5min；如果有ETRSolution悬浮，则室温再放置5~10min；11）将上清转移至一个新的无菌的50mL离心管中，加入0.5体积的无水乙醇，温和地颠倒5~8次，室温放置2min；12）将步骤11）的20mL上清加入到HiBindDNA大提柱中，用50mL离心管收集，4℃条件下，5000r/min离心5min，弃掉洗脱液；13）重复步骤12），直至将步骤11）的溶液全部放入HiBindDNA大提柱；14）向HiBindDNA大提柱中加入10mLBufferHB,4℃条件下，5000r/min离心5min，弃掉洗脱液，将大提柱放回离心管中；15)加入15mLDNAWashBuffer,4℃条件下，5000r/min离心5min，弃掉洗脱液；将大提柱放回离心管中；16）加入10mLDNAWashBuffer,4℃条件下，5000r/min离心5min，弃掉洗脱液；将大提柱放回离心管中；17）4℃条件下，7000r/min离心10min；18）将大提柱于超净工作台中干燥，使酒精完全挥发；19）将大提柱放到一个新的无菌的50mL离心管中，加入1mLEndotoxin-FreeElutionBuffer,室温静置2min，4℃条件下、7000r/min离心10min，收集质粒DNA，置-80℃保存备用；20）取适量质粒DNA以1:100稀释后，用分光光度计测定OD260nm和OD280nm光密度吸收值，按如下公式计算DNA浓度：质粒DNA（µg/mL）＝OD260nm×50µg/mL×稀释倍数用R值＝OD260nm/OD280nm判定质粒DNA的纯度，R值处于1.8~2.0之间表示质粒纯度符合转染用。2.2.12重组腺病毒的构建将各重组穿梭质粒pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G及pAd-VSV-IN-G-NJ-G分别用PacI酶线性化后，与同样经PacI酶线性化的腺病毒骨架载体pacAd59.2-100共转染AAV-293细胞，包装重组腺病毒；同时设不含外源基因的穿梭质粒及含EGFP荧光蛋白基因的穿梭质粒pAd-EGFP作为对照组，与腺病毒骨架载体质粒用PacⅠ酶切线性化后分别共转染AAV-293细胞。2.2.12.1重组穿梭质粒及骨架载体质粒的线性化将重组穿梭质粒pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G、pAd-VSV-IN-G-NJ-G、pAd-EGFP及腺病毒架载体pacAd59.2-100用PacI酶进行线性化。体系如下：21 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定重组穿梭质粒/骨架载体质粒80µL10×Buffer15µLPacI3.5µLddH2O51.5µLTotal150µL混合均匀后放入37℃水浴锅中，反应4h，0.8%琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化酶切产物，测定核酸浓度，按照比例进行细胞转染。2.2.12.2重组穿梭质粒与骨架载体质粒共转染AAV-293细胞利用脂质体Lipofectamine-2000转染试剂盒，按照说明书进行转染。具体操作如下：1)转染前一天，将形态良好、生长旺盛的AAV-293细胞以2×105个/孔的量接种于6孔细胞培养板，放于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度为70%~80%时进行转染；2)将各纯化的线性化重组穿梭质粒2μg分别与0.5μg纯化的线性化腺病毒骨架载体质粒加至无血清培养基OPTI-MEM中；取10μL脂质体Lipofectamine-2000加至250μL无血清培养基OPTI-MEM中，混匀室温静置5min；3)将各质粒DNA混合液与脂质体混合液轻轻混匀后于室温静置20min；4)吸弃待转染细胞孔的培养基，用无血清DMEM培养基洗涤1次，再用无血清培养基OPTI-MEM洗涤1次，弃掉洗涤液；6)将步骤3）的混合液缓缓从细胞孔边缘滴加到AAV-293细胞孔中，前后摇晃使转染复合物完全覆盖细胞表面；7）置于37℃、5%CO2培养箱中培养4h；8)转染4h后将转染复合物弃去，加入成含10%FBS的DMEM培养基，放回37℃、5%CO2培养箱中继续培养；9）每隔3d观察一下细胞生长情况，若细胞培养液变黄，补加1mL含2%FBS的DMEM培养基,放回37℃、5%CO2培养箱中继续培养；10）转染后7~15d观察细胞是否出现病变，理论上不超过15d；于荧光显微镜下观察对照组观察对照组是否出现绿色荧光；若出现病变，收集出现细胞病变的AAV-293细胞，反复冻融3次，3000r/min离心5min收取上清，即为原代重组腺病毒。2.2.13重组腺病毒的鉴定2.2.13.1重组腺病毒的增殖1）将原代重组腺病毒病毒液接种于汇合度为80%的AAV-293细胞，接种量为200µL，再加入1mL维持液，对照组加入1mL维持液，放入37℃、5%CO2培养箱中培养1h，使病毒充分吸附细胞；2、1h后，每瓶补加9mL维持液，放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养；22 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定3、观察细胞生长情况，是否出现细胞病变；4、细胞出现细胞病变时，收毒，反复冻融3次，3000r/min、4℃离心10min收取上清，即为第1代重组腺病毒，连续传代4次。2.2.13.2重组腺病毒DNA的提取取200μL第4代重组腺病毒液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒操作程序提取病毒DNA。具体操作如下：1）各取200μL重组腺病毒感染的AAV-293细胞冻融液，加200μLBufferV-L,漩涡震荡混合均匀，室温放置5min；2）加75μLBufferV-N，漩涡振荡混合均匀，12000r/min离心5min；3）吸取上清加到新的2mL离心管中，加300μL异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6~8次，混合均匀；4）将新制备管放于新的2mL离心管中，将步骤3中的溶液转入到制备管中，6000r/min离心1min；5）弃滤液，将制备管放回2mL离心管中，加500μLBufferW/A,室温静置1min，12000r/min离心1min；6）弃滤液，将制备管放回2mL离心管中，加800μLBufferW2，12000r/min离心1min；7）将制备管放回2mL离心管中，12000r/min离心1min；8）将制备管置于干净的1.5mLEP管中，将制备管置于EP管中，在制备管中央加50μLBufferTE，室温静置1min，12000r/min离心1min，洗脱DNA，置-20℃保存或直接进行PCR反应。2.2.13.3重组腺病毒PCR鉴定以提取的重组腺病毒的DNA为模板，以IN-G-XF及IN-G-XR为扩增VSV-IN-G基因的上下游引物，鉴定含有VSV-IN-G基因的重组腺病毒；以NJ-G-XF及NJ-G-XR为扩增VSV-NJ-G基因的上下游引物，鉴定含有VSV-NJ-G基因的重组腺病毒；以IN-G-XF及NJ-G-XR为扩增VSV-IN-G-NJ-G基因的上下游引物，鉴定含有VSV-IN-G-NJ-G的重组腺病毒。PCR体系如下：病毒DNA3µL5×PrimeSTARBuffer5µL上游引物1µL下游引物1µLdNTPMix(2.5µmol/L)2µLPrimeSTARHSDNApolymerase0.25µLddH2O12.75µLTotal25µL混合均匀，VSV-IN-G/VSV-NJ-G基因的扩增进行如下反应：94℃，3min；（94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min）30个循环；72℃，10min。VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增进行如下反应：（94℃，23 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定10s；55℃，10s；72℃，3min40s）30个循环；反应结束后各取5µlPCR产物，与1µL6×loadingbuffer混合均匀后点样，1%琼脂糖凝胶以120V电泳30分钟，在紫外凝胶成像系统下观察结果。将目的条带切胶，胶回收后送金唯智生物技术有限公司测序。将测得的目的基因的序列与GenBank公布的VSV-IN毒株与VSV-NJ毒株的序列进行核苷酸与氨基酸水平上的比对，将测序结果正确的所对应的重组腺病毒分别命名为rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G、rAd-VSV-IN-G-NJ-G，不含外源基因的重组腺病毒命名为wtAd。2.2.14重组腺病毒的扩增及遗传稳定性分析2.2.14.1重组腺病毒的扩增及鉴定将收获的重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G、rAd-VSV-IN-G-NJ-G及wtAd接种于汇合度为80%的AAV-293细胞，待细胞出现病变后，反复冻融3次，3000r/min、4℃离心10min收取上清，即为新一代重组腺病毒。同样方法连续扩增病毒20代，将第5、10、15、20代重组腺病毒提取DNA，PCR鉴定，方法同2.2.11.2、2.1.11.3。2.2.14.2重组腺病毒的TCID50测定具体操作如下：1）将AAV-293细胞用0.07%胰酶EDTA消化液消化后，加入30mL10%FBSDMEM培养液，制备细胞悬液，取一滴滴入细胞计数板，于显微镜下找到计数区，计数得5×104个∕mL；将制备的细胞悬液加入96孔细胞培养板的孔中，每孔滴加100μL。放入37℃、5%CO2培养箱中培养；2）待细胞生长融合度为80%时准备接种第5、10、15、20代重组腺病毒；3）稀释病毒液：取10个灭菌的EP管，向每个管中加入1080μL含2%FBS的DMEM维持液，向第一个管中加入120μL重组腺病毒病毒原液，混匀后取120μL加入第二个管中，依次类推将重组腺病毒作10倍梯度稀释；4）将稀释好的病毒液加入96孔板，每个稀释度占用一行，作8个复孔，最后两个孔留作空白对照，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；5）逐日观察细胞病变的情况，按Read-Muenels法计算TCID50。2.2.15重组腺病毒G蛋白表达的鉴定2.2.15.1SDS-PAGE及Westernblot检测将重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G、rAd-VSV-IN-G-NJ-G及wtAd接种于汇合度为80%的AAV-293细胞；待细胞出现病变后，弃去培养液，用细胞裂解液裂解细胞，离心取上清；加入4×SDS电泳上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳；转印至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂乳（100mLPBST中加入5g脱脂奶粉）于4℃条件下封闭过夜；用PBST24 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定洗膜3次后，分别加入对应血清型的抗体（1:5000倍稀释的VSV-IN-G单抗、1:1000倍稀释的经VSV-NJ毒株免疫山羊的阳性血清），融合蛋白用两种血清型的抗体检测，置于37℃、80r/min培养箱中作用2h；用PBST洗膜3次，分别加入1:5000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP与兔抗山羊IgG-HRP，置于37℃、80r/min培养箱中作用1h；用PBST洗膜3次，用用增强型HRP-DAB底物显示试剂盒避光显色10min；使用ddH2O终止显色；观察结果。2.2.15.2间接免疫荧光检测将Vero细胞接种于96孔细胞培养板，待其长成单层时，分别接种重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G、rAd-VSV-IN-G-NJ-G及wtAd，置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h；48h后接种wtAd的细胞孔直接于荧光显微镜下观察，其余孔轻轻吸弃培养液，加入适量PBS洗涤一次；每孔加入100µL预冷的4%甲醛，4℃条件下固定30min；然后弃去固定液；PBST洗涤3次，分别加入对应血清型的抗体（1:2000倍稀释的VSV-IN-G单抗、1:500倍稀释的经VSV-NJ毒株免疫山羊的阳性血清），融合蛋白用两种血清型的抗体检测，37℃作用1h；弃去一抗后用PBST洗涤3次后弃去洗涤液，分别滴加1:200稀释的FITC标记的山羊抗小鼠二抗、1:200稀释的FITC标记的兔抗山羊二抗，37℃避光反应1h；用PBST洗涤3次，于荧光显微镜下观察。2.3实验结果与分析2.3.1VSV-NJ-G基因的扩增RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增出了与VSV-NJ-G基因相应的约1554bp大小的特异性条带，同时阴性对照组未出现条带，与预期结果相符（图2.3），与GenBank公布的VSV-NJ毒株的序列进行核苷酸与氨基酸水平上的比对均正确。图2.3VSV-NJ-G基因的RT-PCR扩增Fig2.3AmplificationofVSV-NJ-GgenebyRT-PCRM:2KPlusDNAMarker；1：阴性对照；2：VSV-NJ-G基因的RT-PCR产物M：2KPlusDNAMarker;1：Negativecontrol;2:RT-PCRproductVSV-NJ-Ggene25 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定2.3.2VSV-IN-G基因的扩增PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增出了与VSV-IN-G基因相应的约1536bp大小的特异性条带，同时阴性对照组未出现条带，与预期结果相符（图2.4），与GenBank公布的VSV-IN毒株的序列进行核苷酸与氨基酸水平上的比对均正确。图2.4VSV-IN-G基因的PCR扩增Fig.2.4AmplificationofVSV-IN-GgenebyPCRM:2KPlusDNAMarker；1：VSV-IN-G基因的PCR产物2：阴性对照M：2KPlusDNAMarker;1:PCRproductVSV-IN-Ggene;2:Negativecontrol2.3.3VSV-IN-G-NJ-G基因的扩增通过PCR扩增出了带有linker序列的VSV-IN-G-linker基因与linker-VSV-NJ-G基因；以带有linker序列的两个基因为模板，IN-G-F和NJ-G-R为模板，通过融合PCR技术，将VSV两个血清型的G基因连接在一起，即为VSV-IN-G-NJ-G基因，其大小为3100bp，与预期结果相符（图2.5）；将其连接至pMD-19T克隆载体，挑取阳性克隆，经PCR鉴定、酶切鉴定及测序，与GenBank公布的VSV-IN毒株与VSV-NJ毒株的序列进行比对，结果显示所扩增的融合基因含有两个G基因的序列，进行核苷酸与氨基酸水平上的比对均正确。图2.5VSV-IN-NJ-G基因的PCR扩增Fig.2.5AmplificationofVSV-IN-G-NJ-GgenebyPCRM:2KPlusDNAMarker；1：VSV-IN-NJG基因的PCR产物2：阴性对照M：2KPlusDNAMarker;1:PCRproductVSV-IN-G-NJ-Ggene;2:Negativecontrol26 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定2.3.4重组腺病毒穿梭质粒的构建将所扩增出的三个目的基因的PCR纯化产物用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，分别克隆至同样用用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的腺病毒穿梭载体pacAd-CMVK-NpA中，构建含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒；经PCR鉴定筛选出阳性菌落，扩大培养后提取质粒，将所获得的含有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，分别可以切出一条约1536bp、1554bp、3100bp的片段和6200bp的片段（图2.6），与预期结果相符。经测序，所插入的目的基因的序列都正确，表明目的基因正确插入腺病毒穿梭载体中。将鉴定为阳性的重组腺病毒穿梭质粒分别命名为pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G及pAd-VSV-IN-G-NJ-G。图2.6重组腺病毒穿梭质粒的酶切鉴定Fig.2.6RestrictenzymesidentificationoftherecombinantshuttleplasmidsM:DNA分子质量标准；1:pAd-VSV-IN-G质粒的双酶（EcoRⅠ+NotⅠ）切产物；2：pAd-VSV-NJ-G质粒的双酶（EcoRⅠ+NotⅠ）切产物；3：pAd-VSV-IN-G-NJ-G质粒的双酶（EcoRⅠ+NotⅠ）切产物M:DNAMarker；1:ProductfrompAd-VSV-IN-GdigestedwithEcoRⅠandNotⅠ；2：ProductfrompAd-VSV-NJ-GdigestedwithEcoRⅠandNotⅠ；3：ProductfrompAd-VSV-IN-G-NJGdigestedwithEcoRⅠandNotⅠ2.3.5重组腺病毒的构建将重组穿梭质粒pAd-VSV-IN-G、pAd-VSV-NJ-G、pAd-VSV-IN-G-NJ-G及穿梭载体质粒、含有EGFP基因的穿梭质粒pAd-EGFP与腺病毒骨架载体质粒分别用PacⅠ酶切线性化，共转染AAV-293细胞，在转染后10d，细胞出现病变，收集出现细胞病变的AAV-293细胞，获得三株重组腺病毒，分别命名为rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。同时转染含有EGFP荧光蛋白基因的腺病毒的293细胞对照组，也出现了细胞病变，在荧光显微镜下观察可以看到明显的荧光。将重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G连续传代4代，接种后48h细胞均出现细胞病变（图2.7），提取DNA，分别利用VSV-IN-G基因、VSV-NJ-G基因及VSV-IN-NJ-G基因的特异性引物可以扩增出和预期结果相符的目的条带，大小分别为1536bp、1554bp、3100bp（图2.8），同时对照组无任何条带。27 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定图2.7重组腺病毒感染AAV-293细胞病变效应Fig.2.7Cytopathiceffect(CPE)ofAAV-293cellsinfectedwiththerecombinantadenovirusA:接种rAd-VSV-IN-G的293细胞；B:接种rAd-VSV-NJ-G的293细胞；C:接种rAd-VSV-IN-G-NJ-G的293细胞；D:接种wtAd的293细胞；E:接种VSV的293细胞；F:正常的293细胞A：CPEofAAV-293cellinfectedwiththerAd-VSV-IN-G；B：CPEofAAV-293cellinfectedwiththerAd-VSV-NJ-G；C：CPEofAAV-293cellinfectedwiththerAd-VSV-IN-NJ-G；D：CPEofAAV-293cellinfectedwiththewtAd；E：CPEofAAV-293cellinfectedwithVSV；F：AAV-293cellcontrol图2.8重组腺病毒的PCR鉴定Fig.2.8IdentificationoftherecombinantadenovirusbyPCRM:2KPlusDNAMarker；1：rAd-VSV-IN-G的PCR产物；2：rAd-VSV-NJ-G的PCR产物；3：rAd-VSV-IN-NJ-G的PCR产物；4：阴性对照组M：2KPlusDNAMarker；1：PCRproductfromrAd-VSV-IN-G；2：PCRproductfromrAd-VSV-NJ-G；3：PCRproductfromrAd-VSV-IN-NJ-G；4：Negativecontrol28 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定2.3.6重组腺病毒的扩增与遗传稳定性分析将所获得的重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G于AAV-293细胞中连续扩增20代，将第5、10、15、20代重组腺病毒提取DNA，PCR鉴定，均可扩增出与含插入的目的基因大小相符的特异性条带，与预期结果相符（图2.9），测序基因序列正确。将-8.56-8.16-8.96第5、10、15、20代重组腺病毒做TCID50测定，其TCID50分别为10/mL、10/mL、10/mL-8.34-7.76-8.16-7.67-8.2-6.96-7.16-7.67和10/mL；10/mL、10/mL、10/mL和10/mL；10/mL、10/mL、10/mL-7.2和10/mL；说明重组的腺病毒具有一定的稳定性。图2.9不同代次重组腺病毒的PCR鉴定Fig.2.9PCRidentificationofdifferentpassagestherecombinantadenovirusM:DNA分子质量标准；1-4：分别为rAd-VSV-IN-G第5、10、15、20代的PCR产物；6~9:分别为rAd-VSV-NJ-G第5、10、15、20代的PCR产物；11~14:分别为rAd-VSV-IN-NJ-G第5、10、15、20代的PCR产物；5、10、15：阴性对照M::2KPlusDNAMarker;1-4：PCRproductfromrAd-VSV-IN-Gatpassage5、10、15、20；6-9：PCRproductfromrAd-VSV-NJ-Gatpassage5、10、15、20；11-14：PCRproductfromrAd-VSV-IN-NJ-Gatpassage5、10、15、20；5、10、15:Negativecontrol2.3.7Westernblot检测G蛋白的表达收获重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G感染的AAV-293细胞，经Westernblot检测，结果表明这三种重组腺病毒在感染的AAV-293细胞中可以复制并表达VSV的G蛋白（57KDa、57KDa）（图2.10）及其融合蛋白（114KDa）（图2.11），接种野生型腺病毒的AAV-293细胞中检测不到该蛋白。29 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定图2.10Westernblot检测VSVG蛋白在重组腺病毒感染293细胞中的表达Fig.2.10ExpressionofVSVGproteinintherAdinfected293cellsbywesternblotM:蛋白相对分子质量标准；1：感染rAd-VSV-IN-G的AAV-293细胞；4：感染rAd-VSV-NJ-G的293细胞；2、3:感染wtAd的AAV-293细胞M:ProteinmolecularweightMarker；1:293cellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G；4:293cellsinfectedwithrAd-VSV-NJ-G；2、3：293cellsinfectedwithwtAdV；图2.11Westernblot检测融合蛋白在重组腺病毒感染293细胞中的表达Fig.2.11ExpressionoffusionproteinintherAdinfected293cellsbywesternblotM:蛋白相对分子质量标准；2：感染rAd-VSV-IN-G-NJ-G的293细胞(VSV-IN-G单抗检测)；3：感染rAd-VSV-IN-G-NJ-G的293细胞(VSV-NJ多抗检测)；1、4：阴性对照M:ProteinmolecularweightMarker；2:293cellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G-NJ-G（detectedbyVSV-INmonoclonalantibody）；3：293cellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G-NJ-G（detectedbyVSV-NJpolyclonalantibody）；1、4：Negativecontrol2.3.8间接免疫荧光检测将构建的重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G接种Vero细胞，培养48h,进行间接免疫荧光试验。结果表明重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G感染的Vero细胞可以产生特异性荧光，对照组的细胞未见有任何特异性荧光产生（图2.12），表明重组腺病毒可以在细胞中有效表达；利用VSV-IN-G单克隆抗体与VSV-NJ多克隆抗体检测30 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定rAd-VSV-IN-G-NJ-G感染的Vero细胞，均有特异性荧光产生，说明重组腺病毒可以表达VSV-IN-G蛋白与VSV-NJ-G蛋白两种蛋白，且具有一定的反应原性（图2.13）。图2.12间接免疫荧光检测VSVG蛋白的表达Fig.2.12ExpressionofVSVGproteinbyIFAA:感染rAd-VSV-IN-G的Vero细胞；B:感染rAd-VSV-NJ-G的Vero细胞；C:正常的Vero细胞A:VerocellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G；B:VerocellsinfectedwithrAd-VSV-NJ-G；C:Verocellscontrol图2.13间接免疫荧光检测融合蛋白的表达Fig.2.13ExpressionoffusionproteinbyIFAA:感染rAd-VSV-IN-G-NJ-G的Vero细胞（VSV-IN-G单抗检测）；B:感染rAd-VSV-IN-G-NJ-G的Vero细胞（VSV-NJ-G多抗检测）；C:正常的Vero细胞A:VerocellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G-NJ-G（detectedbyVSV-INmonoclonalantibody）；B:VerocellsinfectedwithrAd-VSV-IN-G-NJ-G（detectedbyVSV-NJpolyclonalantibody）；C:Verocellscontrol2.4讨论目前尚无有效治疗水泡性口炎的方法，疫苗免疫接种是预防和控制该病的重要措施，VSV疫苗的研究尤为重要。国内外已有学者对VSV核酸疫苗和基因工程疫苗了一些研究（MartinezIetal,2004；周学章等，2008；李晓芳等,2014），但还没有利用人5型腺病毒作为载体进行VSV基因工程活载体疫苗的研究。人5型腺病毒是常见的用于疫苗构建和基因治疗的载体，重组腺病毒已经成为能够诱导产生+CD8细胞免疫反应的具有良好发展前景的疫苗载体。BassettJD等（BassettJD，2011）研究表明+在免疫反应中人5型重组腺病毒所诱导的CD8细胞反应占主导地位。新近研究出的热稳定技术可以使腺病毒载体在高达45℃的室温下保存6个月而其侵染活性少有下降。腺病毒载体疫苗可以有多种给药途径，它可以侵染不同类型的细胞和组织可以侵染分化和未分化细胞，甚至包括抗原31 中国农业科学院硕士学位论文第二章表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与鉴定提呈细胞（王芃，周建光，2014）。本研究利用人5型复制缺陷型腺病毒载体RAPAD腺病毒表达系统构建了可以表达VSV-IN-G蛋白重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、表达VSV-NJ-G蛋白的重组腺病毒rAd-VSV-NJ-G及同时表达VSV两个血清型G蛋白的融合蛋白的重组腺病毒rAd-VSV-IN-G-NJ-G。该研究成功克隆出了VSV两种血清型的G基因，并通过融合PCR技术将两个G基因串联起来；将目的基因利用分子克隆技术插入腺病毒穿梭载体中，携带目的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒经酶切线性化后转染AAV-293细胞，在细胞内进行重组，通过观察细胞病变效应(CPE)来筛选重组腺病毒；同时包装了不含外源基因及含有EGFP基因的重组腺病毒作为对照组。研究表明在转染细胞10d时细胞开始出现细胞病变效应，含有EGFP基因的对照组在荧光显微镜下可以看到较亮的绿色荧光。收获重组腺病毒毒后再继续在AAV-293细胞中连续增殖4代，通过PCR扩增及基因序列测定证明目的基因正确插入腺病毒表达载体，接种AAV-293细胞均可以使细胞产生细胞病变效应。利用PCR鉴定与TCID50测定方法测定重组腺病毒的遗传稳定性。将收获的原代重组腺病毒感染AAV-293细胞，连续传代至20代，细胞均在36~48h内产生细胞病变效应，PCR鉴定均有-8.0目的条带，测序基因序列正确，病毒滴度TCID50在10/mL左右，表明目的基因可以在重组腺病毒中稳定的遗传。经过间接免疫荧光与westernblotting检测，表明重组的腺病毒可以正确地表达目的蛋白，所表达的目的蛋白具有较好的生物学活性。该研究为VSV基因工程活载体疫苗及水泡性口炎的防治技术奠定了基础。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒对小鼠的免疫原性分析摘要：为了评价构建的重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G和rAd-VSV-IN-G-NJ-G的免疫效果，本研究选取50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为5组，每组10只。将重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G和rAd-VSV-IN-G-NJ-G分别以2周为免疫间隔，肌肉注射及皮下注射免疫小鼠3次，另外两个对照组分别注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS。于首次免疫后0、2、4、6周采集血液分离血清，利用间接ELISA检测VSV特异性抗体水平，以病毒中和试验检测中和抗体水平，淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平。结果表明rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G和rAd-VSV-IN-G-NJ-G均能够引起小鼠产生VSV特异性抗体、中和抗体及淋巴细胞增殖，空载体对照组及阴性对照组在整个实验过程中均未出现明显的免疫应答。关键词：VSVG蛋白；重组腺病毒；小鼠；免疫反应3.1实验材料3.1.1细胞及病毒重组腺病毒（rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G、rAd-VSV-IN-G-NJ-G）由研究前期构建；Vero细胞由本实验室保存；VSV-NJ毒株实验室保存，VSV-IN毒株由哈尔滨兽医研究所步志高研究员赠送。3.1.2试剂及实验动物DMEM、RPMI160购自Gibico公司；刀豆蛋白A(ConA)购自Sigma公司；小鼠脾脏淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品公司；CellTiter96®AQOneSolutionCellProliferationAssay购自Promega公司；50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠购于北京华阜康生物技术股份有限公司。3.1.3主要仪器设备低温台式高速离心机（3-18K）购自美国Sigma公司；低温超速离心机（WX80）购自美国Sorvall公司；酶标仪购自BIO-RAD公司。3.2实验方法3.2.1实验动物的选择和分组将50只6~8周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组，每组10只。注射重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、33 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究rAd-VSV-NJ-G和rAd-VSV-IN-G-NJ-G的实验组分别命名为rAd-VSV-IN-G组、rAd-VSV-NJ-G组和rAd-VSV-IN-G-NJ-G组；另外设两个对照组分别注射wtAd(野生型腺病毒)或PBS分别命名为wtAd组、PBS组。3.2.2免疫原的制备将重组腺病毒以MOI=10接种AAV-293细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2d。收毒，-20℃/室温反复冻融3次，取悬液3000r/min、4℃离心10min，除去细胞碎片，收获上清即为重组腺病毒；按照2.2.12.2重组腺病毒的TCID50测定方法测定新增殖的重组腺病毒的TCID50。置-80℃保存用于动物免疫实验。3.2.3动物免疫程序表3.1重组腺病毒免疫小鼠程序Table3.1Immunizationprocedureofmicewiththerecombinantadenovirus组别小鼠数量（只）初免剂量二免剂量三免剂量81082×10TCID508rAd-VSV-IN-G10TCID5010TCID5081082×10TCID508rAd-VSV-NJ-G10TCID5010TCID5081082×10TCID508rAd-VSV-IN-NJ-G10TCID5010TCID5081082×10TCID508wtAd10TCID5010TCID5010200µLPBS100µL100µL首次免疫时选择小鼠后腿肌肉分点注射；加强免疫时，加倍免疫剂量并选择小鼠后腿肌肉分点注射及皮下注射两种免疫方式；三次免疫时用与首次免疫相同的免疫剂量，选择肌肉注射与皮下注射两种免疫方式。首次免疫后0、2、4、6周眼眶采血，分离血清检测血清中的特异性抗体和中和抗体；3免后2周（即首免后第6周）每组处死3只小鼠分离脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖试验。3.2.4免疫后样品采集首次免疫后0、2、4、6周眼眶采血分离血清：用毛细血管从小鼠眼眶静脉丛采集血液，放入无抗凝剂的试管中，放入4℃冰箱凝集过夜，在4℃条件下3000r/min离心10min,上清即为分离的血清，移至新的离心管中，置-80℃保存，用于特异性抗体的检测与中和抗体的检测。3免后2周（即首免后第6周）每组处死3只小鼠分离脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖试验。利用小鼠脾脏淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞：1)颈椎脱位法处死小鼠，置于75%酒精中浸泡5-10min，进行小鼠全身消毒灭菌；2)于生物安全柜中将小鼠仰卧位放入无菌平皿中，剪开皮肤，无菌取出脾脏；3)将小鼠脾脏置于无菌平皿中，用不含血清的RPMI1640培养液反复清洗两次；34 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究4)加入10mL含20%胎牛血清的F液，用5mL注射器吸取F液，将针头插进脾脏，不断冲洗使小鼠脾脏淋巴细胞吹出；5)将冲出的小鼠脾脏淋巴细胞悬液经200目不锈钢滤网过滤到新的无菌平皿中，移至一个新的无菌离心管中，于室温条件下1000r/min离心5min；6)加入5mL细胞洗涤液，充分混匀后，于室温条件下1000r/min离心5min；7)弃上清，加入3mL全血及组织稀释液重悬细胞沉淀，混合均匀后将细胞悬液缓慢叠加在C液液面之上，于室温条件下1500r/min离心20min；8)离心后液体由上而下分为4层。第一层：稀释液层；第二层：乳白色淋巴细胞层；第三层：透明分离液层；第四层：红细胞层；收集第二层的乳白色淋巴细胞层；9)加入5mL细胞洗涤液，充分混合均匀后，于室温条件下1000r/min离心5min；10)弃上清，重复步骤8洗涤1次；11)弃上清，加入1mL含10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，进行淋巴细胞计数，计数后进行淋巴细胞增殖试验。3.2.5抗VSV特异性抗体的检测取首次免疫后0、2、4、6周眼眶采血分离的小鼠血清，采用本实验室建立的以纯化的VSV为包被抗原的间接ELISA方法检测VSV特异性抗体水平。对抗原的包被浓度、血清稀释倍数等检测条件均已进行了优化。ELISA具体操作步骤如下：1)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的VSV全病毒抗原进行稀释使浓度为2μg/mL，按100μL/孔加入ELISA板中，37℃作用1h后再放4℃包被过夜；2)弃去包被液，用PBST反复洗板3次，每次3min；3)每孔加入200μL的封闭液100mL/L牛血清，4℃封闭过夜；4)弃去封闭液，用PBST反复洗板3次，每次3min；5)加入100μL用封闭液1:100倍稀释的待检小鼠血清，37℃孵育90min；6)弃去待检血清，用PBST反复洗板3次，每次3min；7)加入100μL用封闭液1:2000倍稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP，37℃孵育1h；8)弃去二抗，用PBST反复洗板3次，每次3min；9)每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光显色10min；10)每孔加入100μL2mol/LH2SO4终止反应，酶标仪读取OD450nm值。3.2.6免疫小鼠中和抗体的检测利用微量中和试验对收集的所有免疫小鼠血清进行VSV特异性病毒中和滴度检测。35 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究3.2.6.1病毒毒价的测定1）将BHK-21细胞用0.07%胰酶EDTA消化液消化后，加入30mL10%FBSDMEM培养液，4制备细胞悬液，取一滴滴入细胞计数板，于显微镜下找到计数区，计数得5×10个∕mL。将制备的细胞悬液加入96孔细胞培养板的孔中，每孔滴加100μL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；2）细胞生长24h时观察细胞，状态良好，准备接种VSV-IN与VSV-NJ病毒液；3）稀释病毒液：取10个灭菌的EP管，向每个管中加入1080μL含2%FBS的DMEM维持液，向第一个管中加入120μL病毒原液，混匀后取120μL加入第二个管中，依次类推将VSV-IN与VSV-NJ病毒分别作10倍梯度稀释；4）将稀释好的病毒液加入96孔板，每个稀释度占用一行，作8个复孔，最后两个孔留作空白对照，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；5）逐日观察细胞病变的情况，做好记录；用Reed-Muench法计算VSV-IN与VSV-NJTCID50。3.2.6.2中和抗体的检测51）将Vero细胞以2×10个细胞/mL接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养至长成单层细胞，用于中和试验；2）将待检血清56℃水浴中处理30min，灭活补体；3）用无血清DMEM培养基将待检小鼠血清进行2倍倍比稀释；24）将VSV病毒（VSV-IN、VSV-NJ）用DMEM培养基稀释，使10TCID50/mL，加至96孔细胞培养板，100μL/mL；5）每孔加入等量（100µL）待检稀释血清与100TCID50VSV进行混合，37℃作用1h，每个血清稀释度设置6个重复。6)将待检小鼠血清与VSV的混合液接种于已长成单层的Vero细胞上，放回37℃、5%CO2培养箱培养。同时设病毒感染对照和未接种病毒正常细胞对照。7)继续培养48h,于显微镜下观察各孔细胞病变效应CPE，计算中和抗体滴度。中和抗体定义为至少可以抑制50%细胞病变的血清最高稀释度。中和抗体滴度大于10判定为血清阳转。3.2.7免疫小鼠T淋巴细胞增殖试验3免后2周（即首免后第6周）每组处死3只小鼠分离脾脏淋巴细胞，进行淋巴细胞增殖试验，按照试剂说明书分离小鼠脾脏淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验，具体步骤如下：61）计数后，调整小鼠脾脏淋巴细胞密度为2×10个/mL，按100μL/孔将细胞加入96孔板中；2）每个样品分3组，每组3个重复：A组为VSV（IN/NJ）刺激组，加100μLVSV；B组为ConA阳性刺激对照组，加100μLConA(5µg/mL)；C组为阴性对照组，加100μLRMPI1640完全培养基；将细胞板置于37℃、5%CO2培养箱中培养72h；36 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究3）每孔加入20mLMTS后再置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养4h后测OD490nm。根据公式：SI=刺激组OD490nm平均值/非刺激组OD490nm平均值来判断淋巴细胞增值程度。3.3结果3.3.1抗VSV特异性抗体的检测运用间接ELISA方法检测免疫小鼠不同时期的血清中的特异性抗体水平。如图所示，对免疫前的小鼠血清进行检测，均未检出抗VSV的特异性抗体，首免后2周各组抗体水平升高不明显；在免疫后4周，rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组抗体水平明显增高，且明显高于wtAd与PBS对照组；对首免后6周的小鼠血清进行检测，rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组抗体水平进一步增高，对照组未检测出抗VSV的特异性抗体（图3.1）。图3.1小鼠免疫后血清中特异性抗体水平的变化Fig3.1DynamicchangesofantibodylevelintheserumoftheimmunizedmicThedatepresentsthemeans+SDof3replicatesforeveryrecombinantadenovirusvaccine3.3.2免疫小鼠中和抗体的检测3.3.2.1VSVTCID50的测定应用Reed-Muench法测定了VSV-IN与VSV-NJTCID50，利用Reed-Muench法计算公式计算37 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究-10.2510.25VSV-IN毒株的TCID50=10/mL，即将VSV-IN病毒稀释10接种1mL可使50%的细胞发生-10.16病变（表3.2）；利用Reed-Muench法计算公式计算VSV-NJ毒株的TCID50=10/1mL，即将10.16VSV-NJ病毒稀释10接种1mL可使50%的细胞发生病变（表3.3）。表3.2VSV-INTCID50的测定Table3.2TCID50determinationofVSV-IN病毒稀释度有CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数累计无CPE孔出现CPE比例%数-11080770100(77/77)-21080690100(69/69)-31080610100(61/61)-41080530100(53/53)-51080450100(45/45)-61080370100(37/37)-71080290100(29/29)-81080210100(21/21)-9107113192.8(13/14)-1010626366.7(6/9)表3.3VSV-NJTCID50的测定Table3.3TCID50determinationofVSV-NJ病毒稀释度有CPE孔数无CPE孔数累计CPE孔数累计无CPE孔出现CPE比例%数-11080760100(76/76)-21080680100(68/68)-31080600100(60/60)-41080520100(52/52)-51080440100(44/44)-61080360100(36/36)-71080280100(28/28)-8107120195.2(20/21)-9107113286.6(13/15)-1010626460(6/10)3.3.2.2小鼠血清中和抗体的检测血清中和抗体检测结果表明，用VSV-IN毒株与VSV-NJ毒株分别检测免疫重组腺病毒的小鼠血清与对照组小鼠血清，对照组小鼠血清均未检测到中和抗体。用VSV-IN毒株检测的实验组小鼠血清结果表明，rAd-VSV-IN-G组与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组产生了明显的针对VSV-IN-G蛋白的中和抗体，中和抗体水平较好，而rAd-VSV-NJ-G组结果显示中和抗体水平较差（表3.4）；38 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究用VSV-NJ毒株检测的实验组小鼠血清结果表明，rAd-VSV-NJ-G组与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组产生了明显的针对VSV-NJ-G蛋白的中和抗体，中和抗体水平较好，而rAd-VSV-IN-G组结果显示中和抗体水平较差(表3.5)；但三组之间差异不显著（P>0.05）。表3.4VSV-IN毒株检测重组腺病毒诱导产生VSV中和抗体Table3.4DetectionofVSVneutralizingantibodiesinducedbyrecombinantadenovirusbyVSV-IN组别首免后周数0246rAd-IN0(10/10)1:2(7/10)1:8(7/10)1:16(5/10)0(3/10)1:16(3/10)1:32(5/10)rAd-NJ0(10/10)1:2(4/10)1:4(5/10)1:8(7/10)0(6/10)1:16(5/10)1:16(3/10)rAd-IN-NJ0(10/10)1:2(7/10)1:16(5/10)1:16(2/10)0(3/10)1:32(5/10)1:32(8/10)wtAd0(10/10)0(10/10)0(10/10)0(10/10)PBS0(10/10)0(10/10)0(10/10)0(10/10)表3.5VSV-NJ毒株检测重组腺病毒诱导产生VSV中和抗体Table3.5DetectionofVSVneutralizingantibodiesinducedbyrecombinantadenovirusbyVSV-NJ组别首免后周数0246rAd-IN0(10/10)1:2(5/10)1:4(5/10)1:8(10/10)0(5/10)1:8(5/10)rAd-NJ0(10/10)1:2(6/10)1:8(7/10)1:16(5/10)0(4/10)1:16(3/10)1:32(5/10)rAd-IN-NJ0(10/10)1:2(6/10)1:8(5/10)1:16(3/10)0(4/10)1:16(5/10)1:32(7/10)wtAd0(10/10)0(10/10)0(10/10)0(10/10)PBS0(10/10)0(10/10)0(10/10)0(10/10)3.3.3免疫小鼠淋巴细胞增殖试验小鼠首次免疫后6周时，无菌取脾脏淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验，分别用VSV-IN毒株抗原及VSV-NJ毒株抗原刺激后，继续培养72h，加入MTS，继续培养4h后测于酶标仪测各孔OD490nm吸光度值，计算淋巴细胞刺激指数（StimulationIndex,SI）。结果显示，用VSV-IN毒株与VSV-NJ毒株刺激后rAd-VSV-IN-G与rAd-VSV-NJ-G实验组小鼠淋巴细胞增殖效应不同，rAd-VSV-IN-G-NJ-G组小鼠淋巴细胞增殖效应差异不大，且高于rAd-IN与rAd-NJ组SI值。用39 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究VSV-IN毒株抗原刺激时，rAd-VSV-IN-G组与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组SI值均大于2，在2.5左右；rAd-VSV-NJ-G组小鼠淋巴细胞刺激指数要小于2。用VSV-NJ毒株抗原刺激时，rAd-VSV-NJ-G组与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组SI值均大于2；rAd-VSV-IN-G组小鼠淋巴细胞刺激指数要小于2。用不同的毒株刺激对照组小鼠淋巴细胞，其SI值均在1左右。实验组小鼠淋巴细胞SI值较阴性对照组差异显著（图3.2）。图3.2小鼠免疫后淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖反应Fig.3.2Proliferationofsplenocytestovirusstimulationintheimmunizedmice3.4讨论水泡性口炎由水泡性口炎病毒引起的高度接触性传染的人畜共患的重大传染性疫病。该病被世界动物卫生组织(OIE)确定为必须通报的疫病,也是《中华人民共和国进出境动植物检疫法》规定的进境动物二类传染病。疫苗免疫接种是预防和控制该疫病的重要措施，而病毒活载体疫苗可以克服传统疫苗的缺点，使用更加安全、免疫原性更好(Luongoetal.,2012;Flynnetal.,2011)。腺病毒载体系统可以高效的整合并表达外源基因，可以有效的激发免疫反应，所以是一个非常好的基因工程疫苗载体(Russell,2000;TatsisandErtl,2004)。本研究将编码G蛋白的基因作为候选基因，该基因包含糖基化位点及VSV-IN型和NJ型的G蛋白抗原决定簇基因。VSV糖蛋白是决定VSV毒力、抗原性及免疫原性的最主要结构蛋白，是诱导VSV保护性免疫的最主要成分，参与宿主细胞的融合反应，其受体存在于多种组织的细胞膜表层，甚至昆虫细胞和肿瘤细胞上，组织嗜性广泛(Mireetal.,2009)。Zinkernagel等(ZinkernagelRM,1997)研究了中和抗体在鼠体内对VSV急性细胞病变的影响并评估了抗体的特异性，认为只有VSV的G蛋白能升高中和抗体并与抗体发生中和反应。选择人5型腺病毒表达载体系统构建分别表达VSV-IN毒株G蛋白、VSV-NJ毒株G蛋白及两种血清型毒株的G蛋白的串联蛋白。通过构建含有EGFP增强型荧光蛋白基因的重组腺病毒作为阳性对照，更快更好地40 中国农业科学院硕士学位论文第三章表达VSVG蛋白重组腺病毒疫苗对小鼠的免疫效果研究进行表达目的基因重组腺病毒的筛选，本研究成功构建了表达VSV-IN毒株G蛋白、VSV-NJ毒株G蛋白及两种血清型毒株的G蛋白的串联蛋白；所构建的重组腺病毒感染AAV-293细胞及Vero细胞，在细胞内均可高效表达外源基因。利用获得的重组腺病毒免疫小鼠，验证并比较三种疫苗在诱导动物体液免疫和细胞免疫方面的作用。一般而言，免疫更高滴度的重组腺病毒及多次加强免疫会诱导产生更高水平的免疫效果。腺病毒载体具有免疫途径广泛的优点，可以通过肌肉注射和皮下注射进行免疫，也可以不需注射，喷雾免疫或经口服后能产生局部黏膜免疫应答。谢力等构建了表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒，通过滴鼻途径与肌肉注射两种方式免疫小鼠，结果发现滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答（谢力等，2014）。实际操作中，肌肉注射比滴鼻免疫更加精确、快速、方便，而且肌肉注射可接受的最大免疫剂量要远大于滴鼻途径，很多有关重组腺病毒的研究主要选择肌肉注射与皮下注射（韦显凯等，2008；王先炜等，2009）杨玉艾等，2010）。因此，我们在免疫小鼠实验时选择了在第二次免疫时选择加倍免疫剂量，且选择肌肉注射和皮下注射两种方式进行免疫；加强免疫后，小鼠血清特异性抗体水平明显增高。通过利用间接ELISA方法检测免疫小鼠不同时期的血清中的特异性抗体水平，结果表明在首次免疫后2周时采集小鼠血清，rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组小鼠血清中特异性抗体水平均较低，略高于wtAd与PBS对照组，较免疫前差异不显著。加强免疫后，三个实验组小鼠血清中特异性抗体水平均明显提高，表明三种重组腺病毒均可引起小鼠体液免疫反应；其中rAd-VSV-IN-G-NJ-G组小鼠血清中特异性抗体水平高于另外两组的特异性抗体水平。首免后6周，rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G组抗体水平进一步增高，且三组的抗体水平差异不大。对免疫小鼠血清中和抗体水平的检测结果显示，在初次免疫后2周，抗体水平较低；加强免疫后中和抗体水平增高，rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G重组腺病毒在首次免疫后6周，用特异性性抗原检测时，均出现了中和抗体血清学阳性转换，且阳转率均大于50%。其中和抗体水平均在1:16~1:32。用VSV-IN毒株检测rAd-VSV-NJ-G组小鼠血清中和抗体水平较低，同样用VSV-NJ毒株检测rAd-VSV-IN组小鼠血清中和抗体水平亦较低。通过用VSV-IN和VSV-NJ株刺激动物，三个实验组rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G产生抗体水平是有差异的，rAd-VSV-IN-G-NJ-G组抗体水平比rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G都要高。利用淋巴细胞增殖试验对免疫小鼠进行了细胞免疫水平的检测，结果显示，所构建的三株重组腺病毒rAd-VSV-IN-G、rAd-VSV-NJ-G与rAd-VSV-IN-G-NJ-G均可以引起免疫小鼠强烈的淋巴细胞增殖反应，明显高于wtAd与PBS对照组，差异显著（P<0.05）。以上结果表明，所构建的三株重组腺病毒可以很好地表达目的蛋白，所表达的G蛋白免疫小鼠可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应。本研究为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定良好的基础。其诱导产生的体液免疫和细胞免疫反应是否可以同样在本动物上产生且保护动物抵抗VSV的攻击，还有待进一步研究。41 中国农业科学院硕士学位论文第4章全文结论第四章全文结论1、获得了VSV两个血清型的G基因及两个血清型G基因的串联基因。2、利用人5型复制缺陷型腺病毒表达系统，包装出了可以表达VSV-IN-G蛋白、VSV-NJ-G蛋白及其融合蛋白的三株重组腺病毒rAd-VSV-NJ-G,rAd-VSV-IN-G及rAd-VSV-IN-G-NJ-G。3、对包装出的三株重组腺病毒进行体外免疫特性分析，G蛋白在重组腺病毒中可以正确表达，且具有的较好的反应原性。4、将三株重组腺病毒免疫小鼠，检测小鼠产生的VSV特异性抗体水平、中和抗体水平及淋巴细胞增殖反应，结果表明所包装的三株重组腺病毒均可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应，为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。42 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献[1]管洁，邓瑶，陈红，等.表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性和保护效果分析[J].病毒学报,2015,31（1）：7-12.[2]李晓芳，张敏敏，葛金英，等.表达水泡性口炎病毒G基因重组新城疫病毒的构建及免疫原性研究[J].中国预防兽医学报，2014，36(4)：255-259.[3]苏春霞，段相国，郑洁，等.共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究[J].动物医学进展,2014,35(2):1-5.[4]田克恭，张仲秋.2013.人与动物共患病[M].第1版.北京.中国农业出版社：154-159.[5]王芃，周建光.腺病毒疫苗研究进展[J].生物技术通讯，2014，25(2)：263-267.[6]王先炜，李玉峰，姜平.表达猪圆环病毒2型Cap和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和免疫原性测定[J].生物工程学报，2009，11：1639-1645.[7]韦显凯，侯继波，姜平.表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性[J].中国兽医学报，2008，10：1128-1132.[8]谢力，王晓囡，李杨，等.表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价[J].中国生物工程杂志，2014，02：1-6.[9]杨玉艾，初晓辉，毕保良，等.猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究[J].中国预防兽医学报，2010，06：419-423.[10]周学章，李元刚，高丰.水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性[J].中国生物制品学杂志，2008，21(6)：500-509.[11]中国动物卫生与流行病学中心国际兽医事务处.2012年10—11月全球重大动物疫情综述.中国动物检疫，2012,29(12):55-56.[12]Ahmed,M.,Lyles,D.S..EffectofvesicularstomatitisvirusmatrixproteinontranscriptiondirectedbyhostRNApolymerasesI,II,andIII[J].Virology,1998,72(10):8413–8419.[13]Ahmed,M.,McKenzie,M.O.,Puckett,S.,etal.AbilityofthematrixproteinofvesicularstomatitisvirustosuppressbetainterferongeneexpressionisgeneticallycorrelatedwiththeinhibitionofhostRNAandproteinsynthesis[J].Virology,2003,77(8):4646–4657.[14]Alderink,F.J.VesicularstomatitisepidemicinColorado:clinicalobservationsandfinanciallossesreportedbydairymen[J].PreventiveVeterinaryMedicine,1984,3:29–44.[15]AndresM.Perez,StevenJ.Pauszek.Spatialandphylogeneticanalysisofvesicularstomatitisvirusover-winteringintheUnitedStates[J].PreventiveVeterinaryMedicine,2010,93(4):258-264.[16]ArnbergN.Adenovirusreceptors:implicationsfortargetingofviralvectors[J].Trendsinpharmacologicalsciences,2012,33(8):442-448.[17]AthearnK,SampleCJ,BarefootBE,etal.AcutereactogenicityafterintramuscularimmunizationwithrecombinantvesicularstomatitisvirusislinkedtoproductionofIL-1β[J].PLoSOne,2012,743 中国农业科学院硕士学位论文参考文献(10):e46516.[18]BrianD.Lichty,AnthonyT.Power,DavidF.Stojdl1andJohnC.Bell.Vesicularstomatitisvirus:re-inventingthebullet[J].MolecularMedicine,2004,10(5):210-216.[19]BassettJD,SwiftSL,BramsonJL.Optimizingvaccine-inducedCD8(+)T-cellimmunity:focusonrecombinantadenovirusvectors[J].ExpertReviewofVaccines,2011,10(9):1307–1319.[20]BachmannMF,BastC,HengartnerH,etal.Immunogenicityofaviralmodelvaccineafterdifferentactivationprocedures[J].MedicalMicrobiologyandImmunology,1994,183(2):95-104.[21]CameiroFA,VandenbusscheG,JulianoMA,etal.ChargedresiduesareinvolvedinmembranefusionmediatedbyahydrophilicpeptidelocatedinvesicularstomatitisvirusGprotein[J].Molecularmembranebiology,2006,23(5):396-406.[22]CantlonJD,GordyPW,bowenRA.Immuneresponsesinmice,cattleandhorsestoaDNAvaccinetovesicularstomatitis[J].Vaccine,2000,18(22):2368-2374.[23]CailinDeal,AndrewPekosz,GaryKetner.Prospectsfororalreplicatingadenovirus-vectoredvaccines[J].Vaccine,2013,31(32):3236-3243.[24]ChadE.Mire,DerekDube,SueE.Delos,etal.Glycoprotein-DependentAcidificationofVesicularStomatitisVirusEnhancesReleaseofMatrixProtein[J].Virology,2009,83(23):12139-12150.[25]ChadE.Mire,MichaelA.Whitt.Theprotease-sensitiveloopofthevesicularstomatitisvirusmatrixproteinisinvolvedinvirusassemblyandproteintranslation[J].Virology,2011,416：16-25.[26]Chong,L.D.,Rose,J.K.Interactionsofnormalandmutantvesicularstomatitisvirusmatrixproteinswiththeplasmamembraneandnucleocapsids[J].Virology,1994,68:441–447.[27]Connor，J.H.,Lyles,D.S.Inhibitionofhostandviraltranslationduringvesicularstomatitisvirusinfection.eIF2isresponsiblefortheinhibitionofviralbutnothosttranslation[J].BiologicalChemistry.2005,280(14),13512–13519.[28]Cureton,D.K.,Massol,R.H.,Saffarian,S.,Kirchhausen,T.L.andWhelan,S.P.Vesicularstomatitisvirusenterscellsthroughvesiclesincompletelycoatedwithclathrinthatdependuponactinforinternalization[J].PLoSPathog,2009,5:e1000394.[29]DonaldsonA.I,Ferris,N.P,VesicularStomatitis[J].EquineVeterinaryEducation,1995,7(4):205-207.[30]Faria,P.A.,Chakraborty,P.,Levay,A.,etal.VSVdisruptstheRae1/mrnp41mRNAnuclearexportpathway[J].MolecularCell,2005,17(1):93–102.[31]FernándezJ,AgüeroM,RomeroL,etal.Rapidanddifferentialdiagnosisoffoot-and-mouthdisease,swinevesiculardisease,andvesicularstomatitisbyanewmultiplexRT-PCRassay[J].Journalofvirologicalmethods,2008,147(2):301-311.[32]FerrisNP,ClavijoA,YangM,etal.Developmentandlaboratoryevaluationoftwolateralflowdevicesforthedetectionofvesicularstomatitisvirusinclinicalsamples[J].Journalofvirologicalmethods,2012,180(1):96-100.[33]FerrisNP,DonaldsonAI.Anenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionofvesicular44 中国农业科学院硕士学位论文参考文献stomatitisvirusantigen[J].Veterinarymicrobiology,1988,18(3):243-258.[34]FlanaganEB,ZampatoJM,BallLA.RearrangementofthegenesofVSVeliminatesclinicaldiseaseinthenaturalhostnewstrategyforvaccinedevelopment[J].Virology,2001,75(13):6107-6114.[35]Goodger,W.J.,Thurmond,M.,Hehay,J.,Mitchell,J.,Smith,P.EconomicimpactofanepizooticofbovinevesicularstomatitisinCalifornia[J].JournaloftheAmericanVeterinaryMedicalAssociation,1985,186:370–373.[36]GrahamFL.Adenovirusvectorsforhigh-efficiencygenetransferintomammaliancells[J].ImmunologyToday,2000,21(9):426-8.[37]Harty,R.N.,Brown,M.E.,McGettigan,J.P.,etal.Rhabdovirusesandthecellularubiquitinproteasomesystem:abuddinginteraction[J].Virology,2001,75(22):10623–10629.[38]HastieE,CataldiM,MarriottI,etal.Understandingandalteringcelltropismofvesicularstomatitisvirus[J].Virusresearch,2013,176(1):16-32.[39]HayekAM,McCluskeyBJ,ChavezGT,etal.Financialimpactofthe1995outbreakofvesicularstomatitison16beefranchesinColorado[J].JournalofAmericanVeterinaryMedicalAssociation,1998,212（6）:820-823[40]HeoEJ,LeeHS,JeoungHY,etal.DevelopmentofablockingELISAusingarecombinantglycoproteinforthedetectionofantibodiestovesicularstomatitisNewJerseyvirus[J].Journalofvirologicalmethods,2010,164(1):96-100.[41]HumrichJ,JenneL.Viralvectorsfordendriticcell-basedimmunotherapy[J].CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,2003,276:241-59.[42]JamesA.Housea,CarolHouse,PhilippeDubourget,MichelLombard.Protectiveimmunityincattlevaccinatedwithacommercialscale,inactivated,bivalentvesicularstomatitisvaccine[J].Vaccine,2003,21(17-18):1932–1937.[43]Jayakar,H.R.,Murti,K.G.,Whitt,M.A..MutationsinthePPPYmotifofvesicularstomatitisvirusmatrixproteinreducevirusbuddingbyinhibitingalatestepinvirionrelease[J].Virology,2000,74(21):9818–9827.[44]JenneL,SchulerG,SteinkassererA.Viralvectorsfordendriticcell-basedimmunotherapy[J].TrendsImmunology,2001,22(2):102-107.[45]KobayashiT,StartchevK,WhitneyAJ,etal.Localizationoflysobisphosphatidicacid-richmembranedomainsinlateendosomes[J].Biologicalchemistry,2001,382(3):483-485.[46]KobayashiT,BeuchatMH,ChevallierJ,etal.Separationandcharacterizationoflateendosomalmembranedomains[J].JournalofBiologicalChemistry,2002,277(35):32157-32164.[47]JohannsdottirHK,ManciniR,KartenbeckJ,etal.Hostcellfactorsandfunctionsinvolvedinvesicularstomatitisvirusentry[J].Journalofvirology,2009,83(1):440-453.[48]JonesN,ShenkT.Isolationofdeletionandsubstitutionmutantsofadenovirustype5[J].Cell,1978,13(1):181-188.[49]JoossK,ChirmuleN.Immunitytoadenovirusandadeno-associatedviralvectors:implicationsfor45 中国农业科学院硕士学位论文参考文献genetherapy[J].GeneTherapy,2003;10(11):955-63.[50]KuateS,Stahl-HennigC,StoiberH,etal.Immunogenicityandefficacyofimmunodeficiencyvirus-likeparticlespseudotypedwiththeGproteinofvesicularstomatitisvirusfJ].Virology,2006,351(1):133-144.[51]Kweon,C.H,Kwon,B.J,Kim,I.J,etal.DevelopmentofmonoclonalantibodylinkedELISAforsero-diagnosisofvesicularstomatitisvirus(VSV-IN)usingbaculovirusexpressedglycoprotein[J].VirologyMethods,2005,130(1–2):7-14.[52]KyleD.Fink.IntrastriatalTransplantationofAdenovirus-GeneratedInducedPlmipotentStemCellsforTreatingNeuropathologicalandFunctionalDeficitsinaRodentModelofHuntington'sDisease[J].StemCellsTranslationalMedicine,2014,3:131-154.[53]LaueermanLH,HansonRP.Vesicularstomatitisvirusvaccines:liveandinactivated[J].HotelCaminoReal,MexicoCity,D.F.Mexico,1984,591-607.[54]LeBlancI,LuyetPP,PonsV,etal.Endosome-to-cytosoltransportofviralnucleocapsids[J].Naturecellbiology,2005,7(7):653-664.[55]LederRR,MaasJ,LaneVM,etal.Epidemiologicinvestigationofvesicularstomatitisinadairyanditseconomicimpact[J].BovinePractitioner,1983,18:45-49.[56]Lee,H.S,Heo,E.J,Jeoung,H.Y,etal.Enzyme-linkedimmunosorbentassayusingglycoproteinandmonoclonalantibodyfordetectingantibodiestovesicularstomatitisvirusserotypeNewJersey[J].ClinicalVaccineImmunology,2009,16(5):667-671.[57]LeeYJ,ImsumranA,ParkMY,etal.AdenovirusexpressingshRNAtoIGF-1RenhancesthechemosensitivityoflungcancercelllinesbyblockingIGF-1pathway[J].LungCancer,2007,55(3):279-86.[58]LemckertAA,GrimbergenJ,SmitsS,etal.Generationofanovelreplication-incompetentadenoviralvectorderivedfromhumanadenovirustype49:manufactureonPER.C6cells,tropismandimmunogenicity[J].GeneralVirology,2006,87(10):2891-2899.[59]LetchworthG.J.,RodriguezL.L.andBarreraJ.DELC.VesicularStomatitis[J].Veterinarymicrobiology,1999,157(3):239–260.[60]LeyratC,SchneiderR,RibeiroEA,etal.Ensemblestructureofthemodularandflexiblefull-lengthvesicularstomatitisvirusphosphoprotein[J].Journalofmolecularbiology,2012,423(2):182-197.[61]LiJ,FaberM,PapaneriA,etal.AsingleimmunizationwitharecombinantcanineadenovirusexpressingtherabiesvirusGproteinconfersprotectiveimmunityagainstrabiesinmice[J].Virology,2006,356(1):147-154.[62]LungO,FisherM,BeestonA,etal.MultiplexRT-PCRdetectionandmicroarraytypingofvesiculardiseaseviruses[J].Journalofvirologicalmethods,2011,175(2):236-245.[63]MachamerCE,DomsRW,BoleDG,etal.Heavychainbindingproteinrecognizesincompletelydisulfide-bondedformsofvesicularstomatitisvirusGprotein[J].JournalofBiologicalChemistry,1990,265(12):6879-6883.46 中国农业科学院硕士学位论文参考文献[64]MarozinS,AltomonteJ,ApfelS,etal.Posttranslationalmodificationofvesicularstomatitisvirusglycoprotein,butnotJNKinhibition,istheantiviralmechanismofSP600125[J].Journalofvirology,2012,86(9):4844-4855.[65]MartinezI,BarreraJC,RodriguezLL,etal.Recombinantvesicularstomatitis(Indiana)virusexpressingNewJerseyandIndianaglycoproteinsinducesneutralizingantibodiestoeachserotypeinswine,anaturalhost[J].Vaccine,2004,22(29-30):4035–4043.[66]MartinezI,WertzGW.Biologicaldifferencesbetweenvesicularstomatitisvirusindianaandnewjerseyserotypeglycoproteins:identifcationofaminoacidresiduesmodulatingpH-dependentinfectivity[J].Virology,2005,79(6):53578-3585.[67]MathieuME,GrigeraPR,HeleniusA,etal.Folding,unfolding,andrefoldingofthevesicularstomatitisvirusglycoprotein[J].Biochemistry,1996,35(13):4084-4093.[68]MathurM,DasT,BanerjeeAK.ExpressionofLproteinofvesicularstomatitisvirusIndianaserotypefromrecombinantbaculovirusininsectcells:requirementofahostfeetor(s)foritsbiologicalactivityinvitro[J].Journalofvirology,1996,70(4):2252-2259.[69]MatsuoH,ChevallierJ,MayranN,etal.RoleofLBPAandAlixinmultivesicularliposomeformationandendosomeorganization[J].Science,2004,303(5657):531-534.[70]MccluskeyBJ,Pelzel-McCluskeyAM,CreekmoreL,etal.VesicularstomatitisoutbreakinthesouthwesternUnitedStates,2012[J].VeterinaryDiagnosticInvestigation,2013,25(5):608–613.[71]MeadDG.,RainwaterLovettK,MurphyMD,etal.ExperimentaltransmissionofvesicularstomatitisNewJerseyvirusfromSimuliumvittatumtocattle:clinicaloutcomeisinfluencedbysiteofinsectfeedingfJ].Journalofmedicalentomology,2009,46(4):866-872.[72]MireCE,DubeD,DelosSE,etal.Glycoprotein-dependentacidificationofvesicularstomatitisvirusenhancesreleaseofmatrixprotein[J].Journalofvirology,2009,83(23):12139-12150.[73]NigelP.Ferris,AlfonsoClavijo,MingYang,etal.Developmentandlaboratoryevaluationoftwolateralflowdevicesforthedetectionofvesicularstomatitisvirusinclinicalsamples[J].VirologicalMethods,2012,180:96-100.[74]PattersonLJ,KuateS,Daltabuit-TestM,etal.Replicatingadenovirus-simianimmunodeficiencyvirus(SIV)vectorsefficientlyprimeSIV-specificsystemicandmucosalimmuneresponsesbytargetingmyeloiddendriticcellsandpersistinginrectalmacrophages,regardlessofimmunizationroute[J].ClinicalandVaccineImmunology,2012,19(5):629-637.[75]Petersen,J.M.,Her,L.S.,Varvel,V.,etal.Thematrixproteinofvesicularstomatitisvirusinhibitsnucleocytoplasmictransportwhenitisinthenucleusandassociatedwithnuclearporecomplexes[J].MolecularCellBiology,2000,20(22):8590–8601.[76]Piper,R.C.andKatzmann,D.J.Biogenesisandfunctionofmultivesicularbodies[J].Annualreviewofcellanddevelopmentalbiology,2007,23:519–547.[77]Rainwater-LovettK,PauszekSJ,KelleyWN,etal.MolecularepidemiologyofvesicularstomatitisNewJerseyvirusfromthe2004–2005USoutbreakindicatesacommonoriginwithMexicanstrains[J].Journalofgeneralvirology,2007,88(7):2042-2051.47 中国农业科学院硕士学位论文参考文献[78]RauxH,ObiangL,RichardN,etal.Thematrixproteinofvesicularstomatitisvirusbindsdynaminforefficientviralassembly[J].Journalofvirology,2010,84(24):12609-12618.[79]RocheS,AlbertiniAAV,LepaultJ,etal.Structuresofvesicularstomatitisvirusglycoprotein:membranefusionrevisited[J].Cellularandmolecularlifesciences,2008,65(11):1716-1728.[80]RocheS,ReyFA,GaudinY,etal.StructureoftheprefusionformofthevesicularstomatitisvirusglycoproteinG[J].Science,2007,315(5813):843-848.[81]RocheS,BressanelliS,ReyFA,etal.Crystalstructureofthelow-pHformofthevesicularstomatitisvirusglycoproteinG[J].Science,2006,313(5784):187-191.[82]odgueLL.Emergenceandre-emergenceofvesicularstomatitisintheUnitedStates[J].Virusresearch,2002,85(2):211-219.[83]SchmitzH,WigandR,HeinrichW.Worldwideepidemiologyofhumanadenovirusinfections[J].Americanjournalofepidemiology.1983;117(4):455-66.[84]SmallJC,ErtlHCJ.Viruses—frompathogenstovaccinecarriers[J].Currentopinioninvirology,2011,1(4):241-245.[85]SunC,ZhaoK,ChenK,etal.DevelopmentofaconvenientimmunochromatographicstripforthediagnosisofvesicularstomatitisvirusserotypeIndianainfections[J].Journalofvirologicalmethods,2013,188(1):57-63.[86]SunX,YauVK,BriggsBJ,etal.Roleofclathrin-mediatedendocytosisduringvesicularstomatitisvirusentryintohostcells[J].Virology,2005,338(1):53-60.[87]ToberR,BankiZ,EgererL,etal.VSV-GP:apotentviralvaccinevectorthatbooststheimmuneresponseuponrepeatedapplications[J].Journalofvirology,2014,88(9):4897-4907.[88]Velazquez-SalinasL,PauszekSJ,ZarateS,etal.PhylogeographiccharacteristicsofvesicularstomatitisNewJerseyvirusescirculatinginMexicofrom2005to2011andtheirrelationshiptoepidemicsintheUnitedStates[J].Virology,2014,449:17-24.[89]WangH,FengN,YangS,etal.Arapidimmunochromatographicteststripfordetectingrabiesvirusantibody[J].Journalofvirologicalmethods,2010,170(1):80-85.[90]WangY.,LiuGQ.,ChenZY,etal.RecombinantadenovirusexpressingFandHfusionproteinsofpestedespetitsruminantsvirusinducesbothhumoralandcell-mediatedimmuneresponsesingoats[J].VeterinaryImmunologyandImmunopathology,2013,154(1-2):1-7.[91]WeinbergDH,KetnerG.Adenoviralearlyregion4isrequiredforefficientviralDNAreplicationandforlategeneexpression[J].Journalofvirology,1986,57(3):833-838.[92]WilsonWC,LetchworthGJ,JiménezC,etal.Fieldevaluationofamultiplexreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreactionassayfordetectionofVesicularstomatitisvirus[J].Journalofveterinarydiagnosticinvestigation,2009,21(2):179-186.[93]YanF,ZhengY,HuangL.Adenovirus-mediatedcombinedanti-angiogenicandpro-apoptoticgenetherapyenhancesantitumorefficacyinhepatocellularcarcinoma[J].Oncologyletters,2013,5(1):348-354.[94]YilmaT,RistowS,WoodardL,etal.Protectiveimmuneresponseofcattleandmicetog48 中国农业科学院硕士学位论文参考文献glycoproteinandsyntheticpeptidevaccinesagainstvesicularstomatitis[J].VirusResearch,1985,3:82.[95]ZimmerB,SxunmermatterK,ZimmerG.Stabilityandinactivationofvesicularstomatitisvirus,aprototyperhabdovirus[J].Veterinarymicrobiology,2013,162(1):78-84.[96]ZinkernagelRM,FelixHoppe-seyler.Protecticeantibodyresponsesagainstviruses[J].BiologicalChemmistry,1997,378(8):729.49 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢本论文是在我的导师李刚教授的精心指导下完成的，导师渊博的学识，严谨的科研思维，勤恳踏实的工作态度以及丰富的人生阅历都让我受益匪浅，衷心感谢导师李刚教授三年来对我的学业和生活上的帮助。正是李老师的严格要求和精心指导才使我能顺利的完成硕士学业。三年的时间里我不仅学会了知识并且在李老师的殷切教导下更学会了如何做人、处事。再次衷心向导师李刚教授致以衷心的感谢！同时，真诚的感谢朱鸿飞研究员三年来给予的帮助与关怀，对朱老师认真的科研态度，严谨的治学精神，深厚的专业修养以及大度的处事风格表示深深的敬意！衷心感谢史利军老师、赵占中老师、侯绍华老师、贾红老师以及袁维峰老师、郭晓宇老师和鑫婷老师，你们严谨的科研态度与平易近人的人格魅力让我深有感触。在实验上遇到困难时指点迷津，提出宝贵的建议；在生活上给予我莫大的帮助。真诚的感谢金红岩师姐、李文超师姐、隋修琨师兄、赵玲娜师妹、王勇师兄、程朝飞师兄、黄华欣师兄、陶春爱师姐、刘淑清师姐、张改梅师姐、李明师兄、吴竞同学、董瑞凯师弟在实验操作和生活上给与的帮助与关怀。衷心的感谢实验室工作人员梁琳、李明昕、饶迪等对我学习和生活上的热情帮助。衷心的感谢我的同班同学，感谢你们三年来对我的帮助与鼓励，有了你们我的人生才更加丰富，你们是我永远的财富！感谢三年来代课的所有老师和出席参加我的开题、中期考核以及即将参加我的毕业答辩的所有的老师们！衷心地感谢所有帮助我和支持我的人！最后衷心的感谢我的父母以及我的亲人，你们的鼓励是我战胜困难的法宝，你们的支持是我昂头挺胸，大步向前的动力！50 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历薛晓娟，女，汉族，1989年9月28日出生于山东省聊城市。硕士研究生就读于中国农业科学院研究生院北京畜牧兽医研究所，师从李刚教授。教育背景：2012.09-2015.06中国农业科学院研究生院预防兽医学专业硕士2008.09-2012.06山东农业大学动物科技学院制药工程专业学士发表及拟发表论文：*1、薛晓娟，金红岩，隋修琨，赵玲娜，李刚.表达水泡性口炎病G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析[J].中国兽医科学,2015,45(5):448-512.*2、薛晓娟，李刚，隋修锟，李文超，金红岩，王勇，梁琳.水泡性口炎病毒双糖蛋白重组腺病毒疫苗的构建与免疫原性分析.北京畜牧兽医学会第九届三新论坛会议论文，2013.*3、薛晓娟，金红岩，赵玲娜，隋修锟，ZheneyMakay,李刚.表达水泡性口炎病毒双血清型G蛋重组腺病毒的构建及对小鼠的免疫效果研究.畜牧兽医学报（已接收）51